Development of infrared laser ablation based ambient mass spectrometry imaging methods

Mass spectrometry (MS) imaging (MSI) is an untargeted and label-free chemical imaging method that can map distributions of compounds, such as metabolites, lipids, proteins, and pharmaceutical compounds, in solid samples, such as tissues and cells. Infrared laser ablation ambient MS (IRLA-MS) methods can carry out MSI measurements at atmospheric pressure with minimal sample preparation, which allows straightforward analysis of biological samples in their native state, and which is not feasible with traditional vacuum-based MSI methods that typically require extensive sample preparation and treatment. IRLA-MS methods are best suited for the analysis of small <1500 Da molecules, and they can cover the analysis of small nonpolar, neutral polar, and charged polar molecules depending on the ionization method. IRLA-MS methods with electrospray ionization (e.g., laser ablation electrospray ionization, LAESI) can analyze a wide-range of medium polar, polar, and ionic compounds, whereas IRLA-MS with atmospheric pressure photoionization (i.e., laser ablation atmospheric pressure photoionization, LAAPPI) is suitable for the analysis of nonpolar and polar analytes. However, LAAPPI- and LAESI-MSI have thus far been limited by a relatively poor lateral resolution of 200–400 μm, which has limited the number of structures they can spatially resolve in samples, and which can make them an unappealing choice for biological research. This thesis and its four studies cover the early stage of LAAPPI-MSI research and the development of a novel LAAPPI/LAESI MSI platform for optimized imaging with sub-100 µm lateral resolution. The main objective of the study was to enhance the imaging quality of these IRLA-MS methods for biological research. In the first study, the first in-house built LAAPPI-MSI setup of this work was used to study the distributions of low polarity triterpenoids in the phellem fractions of Betula pendula bark samples with a lateral resolution of 400 µm and provide complementary imaging data to the mass spectra acquired by desorption atmospheric pressure photoionization (DAPPI) MS. LAAPPI-MS offered an efficient tool for sampling and ionization of all the studied triterpenoids: betulin, betulinic acid, betulonic acid, allobetulin, allobetulone, and lupeol. Positive ion LAAPPI-MSI analysis showed that betulinic acid had a relatively high abundance in the lenticels, which are channels that enable the gas exchange through the bark, whereas all other triterpenoids were distributed more evenly in the phellem. The result was consistent with the spectral data acquired by the DAPPI-MS method. The second study demonstrated a simple focusing method for OPO IR laser beams, which are widely used for sampling in IRLA-MS methods. The capability to focus the IR laser beam to the smallest possible spot size typically determines the lateral resolution of the IRLA-MSI analysis. The results showed that the inhomogeneous multimode OPO IR laser beam profiles can be transformed to a better form before focusing by allowing the beam to propagate in free space. The resulting size of the IR laser ablated holes was observed to decrease from 385 to 20 µm as the beam propagation distance in free space increased from 1 to 18 m. Part of the IR laser energy was lost at longer beam propagation distance, but this was compensated by focusing of the radiation to a smaller area on the sample surface. The suitability of the focusing method for MSI was demonstrated in the LAAPPI-MSI of a mouse brain tissue section. In the third study, an enclosed LAAPPI/LAESI MSI platform utilizing the new OPO IR laser focusing method was developed and optimized for the analysis of rodent brain tissue sections with a lateral resolution of 70 µm. The improvement of the imaging resolution below 100 µm was a large step forward in terms of imaging quality, as compared to the first study, and which required a higher sensitivity, repeatability, and stability from the LAAPPI and LAESI methods due to the decreased number of sampled analytes and increased number of measured pixels. After optimization of operational parameters, positive and negative ion LAAPPI- and LAESI-MS detected many of the same metabolites and lipids in the brain. Many compounds were also detected either by LAAPPI- or LAESI-MS, indicating that LAAPPI and LAESI are more complementary than alternative methods. The stability of the optimized negative ion LAAPPI-MSI for larger sample areas was demonstrated with a successful measurement of a whole rat brain tissue section consisting of nearly 30 000 pixels, which revealed many lipid distributions correlating with different rodent brain structures. The last study applied LAAPPI-MSI with a lateral resolution of 70 µm for the analysis of the untreated and frozen leaves of model organism Arabidopsis thaliana (A. thaliana), which is an important species in fundamental plant research. A. thaliana leaves have a complex, multilayered structure, which can be difficult to analyze with most MSI methods that are confined to the analysis of the sample surface. Negative ion LAAPPI-MSI allowed the analysis of A. thaliana leaf substructures ranging from single-cell trichomes and the interveinal leaf lamina to primary, secondary, and tertiary veins. The method also showed its potential for depth profiling analysis for the first time by mapping analytes at the different depths of the leaf and spatially resolving the topmost trichomes and cuticular wax layer from the underlying tissues. Negative ion LAAPPI-MS detected many different flavonol glycosides, fatty acids, fatty acid esters, galactolipids, and glycosphingolipids, whose distributions varied significantly between the different substructures of A. thaliana leaves. This was also the first time that LAAPPI-MS was shown capable of imaging and analyzing contents of single cells.Massaspektrometrinen kuvantaminen (engl. mass spectrometry imaging, MSI) on mittaustekniikka, jolla voidaan samanaikaisesti määrittää jopa tuhansien ennalta tuntemattomien yhdisteiden, kuten metaboliittien, lipidien, ja proteiinien, jakautuminen kiinteässä näytteessä, mikä ei ole mahdollista monella perinteisellä kuvantamistekniikalla, kuten positroniemissiotomografialla tai magneettiresonanssikuvantamisella. MSI-mittaukset mahdollistavat muun muassa biomolekyylien jakautumismuutosten monitoroinnin, mikä voi puolestaan tuottaa uutta molekyylitason tietoa esimerkiksi terveiden ja sairaiden kudosten tai solujen välisistä eroista. Havaittujen yhdisteiden jakautuminen näytteessä esitetään niin kutsuttuina lämpökarttakuvina, jotka muodostetaan tuhansien yksittäisten ja järjestelmällisesti näytealueen yli tehdyn mittauksen datasta. Tämän vuoksi käytetyn mittauspisteen halkaisijan koko rajoittaa kuvien resoluutiota ja täten tarkkuutta, jolla havaittujen yhdisteiden sijainti voidaan yhdistää näytteen eri osarakenteisiin. Perinteiset kaupalliset MSI-menetelmät vaativat usein näytteen erillistä valmistusta ja esikäsittelyä, mittaavat näytteitä tyhjiössä, ja mahdollistavat vain tasaisten pintojen kuvantamisen. Näytteiden valmistus ja esikäsittely puolestaan estävät koskemattomien näytteiden suora-analyysin, voivat aiheuttaa merkittäviä muutoksia näytteessä jo ennen sen mittaamista, vaikeuttaa data-analyysia, ja rajoittaa MSI-tutkimukset ex vivo -olosuhteisiin. Tämän väitöstutkimuksen tavoitteena oli rakentaa uusi MSI-laitteisto Helsingin yliopiston Viikin kampukselle samalla jatkokehittäen kahta ilmanpaineessa toimivaa, jäätyneiden ja esikäsittelemättömien näytteiden suora-analyysiin soveltuvaa, in vivo -mittaukset mahdollistavaa, ja laserablaatiolla tehtävään näytteenottoon perustuvaa MSI-menetelmää: laserablaatioilmanpainefotoionisaatiota (engl. laser ablation atmospheric pressure photoionization, LAAPPI) ja laserablaatiosähkösumutusionisaatiota (engl. laser ablation electrospray ionization, LAESI). Ennen tutkimuksen alkua näillä ja muilla laserablaatioon perustuvilla MSI-menetelmillä oli erityisen heikko 200–400 µm kuvantamisresoluutio suhteessa käytetyn laservalon aallonpituuteen (2,94 µm). Väitöstutkimuksen tarkoituksena oli parantaa LAAPPI- ja LAESI-MSI-menetelmillä muodostettujen kuvien tarkkuutta ja täten menetelmien soveltuvuutta laajempaan tutkimuskäyttöön pienentämällä käytettävän mittauspisteen halkaisijan kokoa ja optimoimalla menetelmät paremman toistettavuuden ja mittausherkkyyden saavuttamiseksi. Väitöstutkimuksen ensimmäisessä osatutkimuksessa ensimmäisellä rakennetulla LAAPPI-MSI-laitteistolla määritettiin betuliinin ja eri betuliinijohdannaisten jakautuminen koivun kaarnan korkkihuokosten ympäristössä noin 400 µm kuvantamisresoluutiolla. LAAPPI-kuvantaminen kykeni osoittamaan betuliinihapon suuremman esiintyvyyden kaarnan korkkihuokosissa verrattuna ympäröivään kudokseen, mikä vahvisti tutkimuksessa käytettyjen muiden mittausmenetelmien tuloksia, mutta myös havainnollisti suuren mittauspisteen koon aiheuttaman epätarkkuuden kuvantamisessa. Toisessa osatutkimuksessa laserablaatioon perustuvien MSI-menetelmien kuvantamisresoluutiota parannettiin kehittämällä käytetylle infrapunalaserille uusi ja yksinkertainen tarkennusmenetelmä, joka on helppo toisintaa myös muissa laboratorioissa. Tarkennusmenetelmä pienensi mittauspisteen halkaisijan 20 µm kokoluokkaan ja menetelmän soveltuvuus MSI-mittauksiin osoitettiin hiiren aivoleikkeen LAAPPI-kuvantamisella. Kolmannessa osatutkimuksessa rakennettiin uusi LAAPPI/LAESI-MSI-laitteisto, joka yhdisti kehitetyn laservalon tarkennusmenetelmän jatkokehitettyihin LAAPPI- ja LAESI-menetelmiin. LAAPPI- ja LAESI-MSI-menetelmät optimoitiin jyrsijöiden aivoleikkeiden kuvantamista varten ja kuvantaminen 70 µm lateraalisella resoluutiolla osoitti Helsingin yliopistossa kehitetyn LAAPPI-menetelmän täydentävän suositummalla LAESI-menetelmällä kerättyä mittaustietoa erityisesti poolittomien metaboliittien ja lipidien osalta. Molemmat MSI-menetelmät havaitsivat myös paljon samoja metaboliitteja ja lipidejä ja näyttivät näiden yhdisteiden jakautuvan aivoleikkeissä samalla tavoin. Viimeisessä osatutkimuksessa optimoidun LAAPPI-MSI-menetelmän soveltuvuus kasvikudoksen analyysiin osoitettiin kuvantamalla esikäsittelemättömiä lituruohon lehtiä, joilla on valmistetuista kudosleikkeistä poiketen epätasainen pinta ja monikerroksinen rakenne. LAAPPI-menetelmä kykeni havaitsemaan muun muassa erilaisia flavonoidiglykosideja, rasvahappoja, ja lipidejä sekä samanaikaisesti kuvantamaan sekä lehden pinnan yksittäisiä trikomisoluja että lehden pinnanalaisia lehtisuonia. Tämä oli ensimmäinen kerta, kun LAAPPI-MSI-menetelmän osoitettiin soveltuvan yhdisteiden syvyysprofilointiin ja yksittäisten solujen mittaukseen, mikä on tärkeää menetelmän jatkokehityksen kannalta

Sub-100 mu m Spatial Resolution Ambient Mass Spectrometry Imaging of Rodent Brain with Laser Ablation Atmospheric Pressure Photoionization (LAAPPI) and Laser Ablation Electrospray Ionization (LAESI)

In this study, we applied a new IR laser-beam-focusing technique to enable sub-100 μm spatial resolution in laser ablation atmospheric pressure photoionization (LAAPPI) and laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry imaging (MSI). After optimization of operational parameters, both LAAPPI- and LAESI-MSI with a spatial resolution of 70 μm produced high-quality MS images, which allowed accurate localization of metabolites and lipids in the mouse and rat brain. Negative and positive ion LAAPPI- and LAESI-MS detected many of the same metabolites and lipids in the brain. Many compounds were also detected either by LAAPPI- or LAESI-MS, indicating that LAAPPI and LAESI are more complementary than alternative methods.In this study, we applied a new IR laser-beamfocusing technique to enable sub-100 mu m spatial resolution in laser ablation atmospheric pressure photoionization (LAAPPI) and laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry imaging (MSI). After optimization of operational parameters, both LAAPPI- and LAESI-MSI with a spatial resolution of 70 mu m produced high-quality MS images, which allowed accurate localization of metabolites and lipids in the mouse and rat brain. Negative and positive ion LAAPPI- and LAESI-MS detected many of the same metabolites and lipids in the brain. Many compounds were also detected either by LAAPPI- or LAESI-MS, indicating that LAAPPI and LAESI are more complementary than alternative methods.Peer reviewe

Soft X-ray Atmospheric Pressure Photoionization in Liquid Chromatography–Mass Spectrometry

Soft X-ray atmospheric pressure photoionization (soft X-ray APPI) as an ionization method in liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) is presented. The ionization mechanism was examined with selected test compounds in the negative ion mode, using soft X-ray APPI source emitting 4.9 keV photons. Test compounds with an acidic group were ionized by a proton transfer reaction, producing deprotonated molecules ([M-H](-)), whereas compounds having positive electron affinity were ionized by a charge exchange reaction, producing negative molecular ions (M-.). Soft X-ray APPI does not require a dopant to achieve high ionization efficiency, which is an advantage compared with vacuum ultraviolet APPI with 10 eV photons, in which a dopant is needed to improve ionization efficiency. The energy of the soft X-ray photons is in the keV range, which is high enough to displace a valence electron and often also inner shell electrons from LC eluents and atmospheric gases, initiating an efficient ionization process in the negative ion mode.Peer reviewe

Mass Spectrometry Imaging of Arabidopsis thaliana Leaves at the Single-Cell Level by Infrared Laser Ablation Atmospheric Pressure Photoionization (LAAPPI)

In this study, we show that infrared laser ablation atmospheric pressure photoionization mass spectrometry (LAAPPI-MS) imaging with 70 μm lateral resolution allows for the analysis of Arabidopsis thaliana (A. thaliana) leaf substructures ranging from single-cell trichomes and the interveinal leaf lamina to primary, secondary, and tertiary veins. The method also showed its potential for depth profiling analysis for the first time by mapping analytes at the different depths of the leaf and spatially resolving the topmost trichomes and cuticular wax layer from the underlying tissues. Negative ion LAAPPI-MS detected many different flavonol glycosides, fatty acids, fatty acid esters, galactolipids, and glycosphingolipids, whose distributions varied significantly between the different substructures of A. thaliana leaves. The results show that LAAPPI-MS provides a highly promising new tool to study the role of metabolites in plants.Peer reviewe

Chemical profiles of birch and alder bark by ambient mass spectrometry

Desorption atmospheric pressure photoionization (DAPPI) is an ambient mass spectrometry (MS) technique that allows the analysis of both polar and nonpolar compounds directly from the surfaces of various sample types. Here, DAPPI was used to study the chemical profiles in different parts of birch and alder tree barks. Four distinct fractions of Betula pendula (silver birch) bark were collected from three different developmental stages of the stem, after which the chemical profiles of the different tissue types were measured. Of special interest were triterpenoids, a class of important defensive substances, which are found in the bark of the silver birch. Additionally, the chemical profiles of lenticels and the surrounding surfaces in the phellem of B. pendula (silver birch), Alnus glutinosa (black alder), and Alnus incana (gray alder) were screened with DAPPI. Another ambient MS technique, laser ablation atmospheric pressure photoionization (LAAPPI), was further used for the mass spectrometry imaging of lenticels on the B. pendula phellem. All the studied birch bark fractions showed individual chemical profiles in DAPPI. The mass spectra from the young apical stem and the transition zone resembled each other more than the mature stem. Instead, the phellem was found to contain a high amount of triterpenoids in all the developmental stages of the stem. The most intense peaks in the DAPPI mass spectra of the birch bark fractions were those of betulin and lupeol. Betulinic and betulonic acid peaks were intense as well, and these compounds were detected especially in the lenticels of the tree samples.Peer reviewe

Adsorption of PO-210, AM-241 & SR-90 on mineral deposits formed in drinking water distribution networks

A plausible radiological attack to the water supply network is a severe threat to the society. In this thesis adsorptions of Po-210, Am-241 and Sr-90 radionuclides on three real water pipe mineral deposits are studied with varying potable water quality. Furthermore, a small-scale piping system was prepared in order to examine the effects of living biofilms and flow of water on adsorption of Po-210 on pipe deposits. It was discovered that the adsorptions of all studied radionuclides are negligible onto the three mineral deposits in the range of potable water quality. The species of the studied radionuclides do not prefer to adsorb onto deposits due to formation of stable compounds, such as hydroxides, in solution in pH range of 6.5-9.5. However, adsorption is feasible onto these deposits by setting the water quality to non-potable. For example, around 60% of Po-210 adsorbed onto (APP1) deposit at pH 2.3. The adsorption occurs most likely via chemisorption as these radionuclides did not desorb with KOH, NaHC03 or CaCi solutions. Adsorption experiments with a small-scale piping system support these results as only 3.4% of initial Po-210 was found in deposits and 7.5% in the whole system after a day. Moreover, most radionuclides flowed directly through the system.Mahdollinen radiologinen isku vedenjakeluverkostoon on vakava uhka yhteiskunnalle. Tässä diplomityössä tutkittiin Po-210, Am-241 ja Sr-90 radionuklidien adsorptiota kolmeen mineraalisakkaan, jotka on kerätty eri vesijohtoputkista. Työn aikana rakennettiin myös pienen mittakaavan vesijohtoverkosto, jonka tavoitteena oli tutkia elävän biofilmin ja veden virtauksen mahdollista vaikutusta poloniumin adsorptioon putkistosakkaan. Kaikkien tutkittujen radionuklidien adsorptio kaikkiin kolmeen mineraalisakkaan oli merkityksetöntä juotavassa vedenlaadussa. Radionuklidien spesies ei suosi adsorboitumista, sillä nuklidit muodostavat juotavassa vedessä (pH 6,5 - 9,5) heti muun muassa stabiileja yhdisteitä, esimerkiksi hydroksideja. Vedenlaadun muuttaminen juomakelvottomaksi mahdollistaa radionuklidien adsorboitumisen sakkoihin. Esimerkiksi noin 60 % poloniumista adsorboitui (APP1) sakkaan pH:ssa 2.3. Poloniumin adsorptio oli todennäköisesti kemisorptiota, sillä nuklidit eivät desorboituneet KOH-, NaHCO3 tai CaCi-liuoksilla. Adsorptiokokeet pienen mittakaavan vesijohtoverkostossa tukevat näitä tuloksia. Vain 3,4 % poloniumin alkuperäisaktiivisuudesta löydettiin putkistosakoista ja 7,5 % koko verkostosta päivän jälkeen. Suurin osa poloniumista virtasi suoraan verkoston läpi