Biochemische und strukturelle Untersuchungen der Biosynthese unnatürlicher Aminosäuren als Bausteine nicht-ribosomaler Peptide

Nicht-ribosomal synthetisierte Peptide weisen eine hohe strukturelle Vielfalt auf, die durch die Anwesenheit vieler nicht-proteinogener Bausteine hervorgerufen wird. Es wurde gezeigt, dass diese Bausteine oft essentiell für die Bioaktivität des jeweiligen Naturstoffs sind, jedoch ist die Biosynthese vieler dieser Bausteine weitestgehend nicht verstanden. Die hier vorgestellte Arbeit beschäftigt sich mit drei chemisch anspruchsvollen Modifikations-reaktionen an freien Aminosäuren, die effektiv durch so genannte Modifikationsenzyme durchgeführt werden. Die ungewöhnlichen, modifizierten Aminosäuren dienen dann als Synthesebausteine für die nicht-ribosomale Peptidsynthese. Im ersten Teil der Arbeit wird der Biosyntheseweg von Nδ-hydroxylierten und Nδ formylierten Ornithin-Resten in vitro untersucht. Diese Bausteine werden für die Biosynthese des Tris-Hydroxamat-Siderophors Coelichelin benötigt, in dem sie für die Komplexierung von Eisen(III)-Ionen verantwortlich sind. Für die Untersuchungen wurden die Flavin-abhängige Monooxygenase CchB und die Formyltransferase CchA aus Streptomyces coelicolor rekombinant hergestellt und biochemisch charakterisiert. Für CchB konnte, im Gegensatz zu CchA, Aktivität in vitro nachgewiesen werden. Da das Enzym ausschließlich freies L-Ornithin hydroxylierte, konnte gezeigt werden, dass diese Hydroxylierungsreaktion den ersten Schritt in der Biosynthese von Coelichelin darstellt und somit essentiell für dessen Produktion ist. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der stereospezifischen Cβ-Hydroxylierung von L Arginin, die von einem organisch-synthetischen Standpunkt aus betrachtet sehr aufwendig ist. Diese Reaktion wird von der nicht-Häm Eisen(II)- und α-Ketoglutarat-abhängigen Mono-oxygenase VioC aus Streptomyces vinaceus katalysiert und resultiert in dem Baustein erythro-β-Hydroxy-Arginin. Dieser wird nach einer weiteren Modifikationsreaktion in das Peptidgerüst des Antibiotikums Viomycin eingebaut. Interessanterweise katalysiert der Großteil von nicht-Häm Eisen(II)-/α-Ketoglutarat-abhängigen Monooxygenasen die Bildung von threo Diastereomeren. Neben der biochemischen Charakterisierung von VioC wurde in dieser Arbeit auch die Lösung der Kristallstruktur der Monooxygenase durchgeführt. Anhand der erhaltenen Daten konnten die unerwartete Substrattoleranz von VioC und die für diese Enzymklasse ungewöhnliche erythro Stereochemie erklärt werden. Eine weitere Cβ-Funktionalisierung einer freien Aminosäure wird im dritten Teil dieser Arbeit untersucht. Der nicht-proteinogene Vorläuferbaustein (2S,3S)-β-Methyl-Phenylalanin, dessen chemische Synthese sehr anspruchsvoll ist, wird in das Glykopeptid-Antibiotikum Mannopeptimycin in Streptomyces hygroscopicus eingebaut. Um den Biosyntheseweg zu untersuchen, wurde die S-Adenosylmethionin-abhängige Methyltransferase MppJ in vitro auf Aktivität getestet. Es konnte gezeigt werden, dass nicht wie erwartet Phenylalanin direkt methyliert wird, sondern dass die α-Ketosäure Phenylpyruvat von MppJ zu β-Methyl-Phenylpyruvat konvertiert wird. Eine anschließende Transaminierungsreaktion mit der Pyridoxal-5’-Phosphat-abhängigen Aminotransferase IlvE aus dem Primärmetabolismus von Streptomyces coelicolor resultierte in der Bildung der beiden Diastereomere (2S,3S)- und (2S,3R)-β-Methyl-Phenylalanin. Es konnte nicht endgültig gezeigt werden, ob die MppJ-katalysierte Methylierungsreaktion stereospezifisch verläuft oder nicht. Allerdings wurden in dieser Arbeit neue Erkenntnisse bezüglich der Cβ-Funktionalisierung von Phenylalanin bzw. Phenylpyruvat erhalten

Praxis: An Editorial Statement

Praxis: An Editorial Statemen

Synthesis of 5-Hydroxyectoine from Ectoine: Crystal Structure of the Non-Heme Iron(II) and 2-Oxoglutarate-Dependent Dioxygenase EctD

As a response to high osmolality, many microorganisms synthesize various types of compatible solutes. These organic osmolytes aid in offsetting the detrimental effects of low water activity on cell physiology. One of these compatible solutes is ectoine. A sub-group of the ectoine producer's enzymatically convert this tetrahydropyrimidine into a hydroxylated derivative, 5-hydroxyectoine. This compound also functions as an effective osmostress protectant and compatible solute but it possesses properties that differ in several aspects from those of ectoine. The enzyme responsible for ectoine hydroxylation (EctD) is a member of the non-heme iron(II)-containing and 2-oxoglutarate-dependent dioxygenases (EC 1.14.11). These enzymes couple the decarboxylation of 2-oxoglutarate with the formation of a high-energy ferryl-oxo intermediate to catalyze the oxidation of the bound organic substrate. We report here the crystal structure of the ectoine hydroxylase EctD from the moderate halophile Virgibacillus salexigens in complex with Fe3+ at a resolution of 1.85 Å. Like other non-heme iron(II) and 2-oxoglutarate dependent dioxygenases, the core of the EctD structure consists of a double-stranded β-helix forming the main portion of the active-site of the enzyme. The positioning of the iron ligand in the active-site of EctD is mediated by an evolutionarily conserved 2-His-1-carboxylate iron-binding motif. The side chains of the three residues forming this iron-binding site protrude into a deep cavity in the EctD structure that also harbours the 2-oxoglutarate co-substrate-binding site. Database searches revealed a widespread occurrence of EctD-type proteins in members of the Bacteria but only in a single representative of the Archaea, the marine crenarchaeon Nitrosopumilus maritimus. The EctD crystal structure reported here can serve as a template to guide further biochemical and structural studies of this biotechnologically interesting enzyme family

Improvement of Perception and Cognition in Synthetic Spatial Environments

The objective of this thesis is the development of a terrain presentation for a synthetic flight guidance system that takes human requirements into account. The thesis is separated into three major chapters. Analysis, Design and Evaluation. In the first part of chapter 1 the environment in which a cockpit crew operates is analysed from different points of view after a short description of the environmentitself. Special attention will be given to the cognitive aspects concerning conventional flight guidance. Based on this foundation, a new flight guidance concept -theCavok flight guidance displays- will be described in detail. They have been tested in flight and will be considered as state of the art. While information requirements and perceptive requirements are excellently realised in the Cavok flight guidance displays, tertiary or cognitive requirements arenot sufficiently taken into account. A detailed description of deficiencies concerning mental information processing will be given and will serve as a base for furtheranalysis. The inability of the human to become familiar with this synthetic environment seems to stem from the lack of tertiary information to be taken into accountin the development phase of the Cavok flight guidance displays. In the last part of the Analysis chapter, cognitive mapping will be looked at. Current methods of terrain visualisation do not provide the pilot with landmarks andthis may be the reason that they have trouble becoming familiar with the environment. Landmarks as the foundation for cognitive mapping seem to be missing sincethere are no other indications why it should be impossible to get familiar with synthetic environment. Similar examples will be mentioned that indicate that cognitivemapping in virtual worlds is possible. Finally the Cavok flight guidance displays will be analysed under these aspects. A foundation for the creation of maps, charts and electronic devices will be given at the beginning of the Design chapter. After a short description of thecartographic design process a new concept taking primary and secondary as well as tertiary requirements into account will be proposed. This concept changes thegeometrical structure of digital terrain data in order to adapt it to human perception and allow cognitive mapping in a synthetic environment. A detailed descriptionof the necessary complex processing will be given. At the end of the Design chapter a first indication of perceptive and cognitive as well as technical improvementswill be summarised. In the last chapter, Evaluation, the new terrain depiction will be treated. Extensive experiments prove that the terrain conversion process significantly improves theperception and cognition. Necessary time for perception and mental rotation decreased tremendously while the number of hits increased