Análisis de la diversidad genética en una colección de poblaciones españolas de "Brachypodium distachyon" como material de base para la mejora y aplicaciones biotecnológica

Contiene: Tesis doctoral. No contiene los 4 ficheros Excel (Matrices), en CD-ROMEn este trabajo se ha llevado a cabo la evaluación de la diversidad genética que encierra una colección de 23 poblaciones naturales de Brachypodium distachyon recogidas en diversas regiones de la Península Ibérica. Se ha utilizado como referencia dos líneas domesticadas y comercializadas. Esta especie presenta variabilidad en el número de cromosomas por lo que el primer objetivo fue el de caracterizar la constitución cromosómica de cada población y estudiar el origen de tal variación, así como su influencia en la variabilidad genética, distribución eco-geográfica, rasgos morfológicos y comportamiento de las muestras en cultivo in vitro. La evaluación de la respuesta al cultivo in vitro de embriones inmaduros de muestras procedentes de todas las poblaciones se abordó en varios medios de inducción de la embriogénesis somática y de regeneración. El análisis de los cariotipos de cada población, permitió clasificar las poblaciones de la colección de B. distachyon en tres grupos, con 10,20 y 30 cromosomas. En base a los resultados de la hibridación in situ de fluorescencia (FISH) con las sondas de los genes ribosomales 5SRDNA y 45SrDNA y de hibridación in situ genómica (GISH) con ADN de los tres citotipos, se demuestra el carácter aditivo de la constitución cromosómica de las poblaciones con 2n=30cromosomas a partir de las de 2n=10 y 2n=20. De este modo, las formas de 2n030 serían aloploides originadas por hibridación y duplicación cromosómica de dos formas diploides de cariotipos y número de cromosomas diferentes, 2n=10 y 2n=20. Estas diferencias cromosómicos apuntan a que las formas vegetales que las representan podrían tratarse de especies diferentes del mismo género Brachypodium, lo que obligaría a una revisión taxonómica del género. El estudio del comportamiento en cultivo in vitro se ha realizado en dos fases. En primer lugar se abordó un estudio del comportamiento de los embriones cigóticos inmaduros de todas las muestras de poblaciones de B.distachyon en dos medios de cultivo: MS y MSm, que se diferencian en la fuente de carbono. Del mismo, se puede deducir que existe una amplia variabilidad en la respuesta al cultivo in vitro, que abarca desde poblaciones recalcitrantes a otras con un nivel de respuesta medio-alto, tanto en la fase de producción de callos embriogénicos como en la capacidad de regeneración de brotes verdes. Los resultados no permiten recomendar un medio idóneo para todas las poblaciones. En una segunda aproximación, se eligieron dos poblaciones de cada grupo cromosómico (Bd160 y ?Zulema?, 2n=10; Bd114 y Bd115, 2n=20 y Bd238 y Bd341, 2n=30) para ensayar 9 medios de cultivos que se diferenciaron en el tipo de fitohormona (2,4-D, Piclorán y Dicamba) incorporada al medio y en su concentración. En la fase de inducción de la embriogénesis somática se observó diferencias significativas en el número de callos totales /total de embriones puestos en cultivo (TC), también el análisis de varianza ANOVA aplicado a la variable número de callos compactos/ total de callos (CC) indicó diferencias altamente significativas entre los diferentes genotipos ensayados y señaló la importancia de la interacción "genotipo x medio" en el éxito de esta primera fase de cultivo. Los medios BR1, BR2 y BR3 preparados con 2,4-D (1 mg/l, 2mg/l y 4mg/l, respectivamente) fueron los mejores para inducir la embriogénesis somática. Sin embargo, los medios preparados con Piclorán y Dicamba fueron los peores, con unos porcentajes de callos blandos muy altos. Se ha observado que las poblaciones con números cromosómicos superiores Bd238 y Bd341 (2n=30) y Bd114 (2n=20) mostraron una buena capacidad embriogénica. Todos los callos se pasaron a un medio de germinación G1, con el fin de producir plántulas verdes. Las poblaciones con 2n=20 (Bd114 y Bd115) no manifestaron la respuesta esperada en base a su alta capacidad para formar callos embriogénicos. Teniendo en cuenta los resultados de ambos ensayos de cultivo in vitro se destaca la interacción "Medio x Genotipo" y el control genético de los mecanismos de inducción de la embriogénesis somática y la regeneración de brotes verdes que parecen estar controladas por sistemas genéticos distintos. El estudio de la diversidad genética interna de cada población y entre las poblaciones se ha llevado a cabo utilizando tres tipos de análisis: proteínas de reserva del endospermo y marcadores moleculares tipo microsatélites (SSR) e inter-microsatélites (ISSR). Los tres tipos de aproximaciones han permitido establecer relaciones se similtud entre las poblaciones. El análisis de la diversidad de las proteínas de reserva del endospermo demuestra el orden creciente de variabilidad genética al aumentar el número de cromosomas de las poblaciones. Se ha llevado a cabo un análisis de similitud utilizando el coeficiente de Jaccard y el agrupamiento de las poblaciones de acuerdo con el método UPGMA. Las poblaciones con el mismo número cromosómico tienden a agruparse entre sí, dentro del mismo clúster, con coeficientes de aproximación variables. Se demuestra la influencia de algunos factores eco-geográficos y climáticos en la distribución de las 23 poblaciones naturales de B. distachyon La aplicación de dos tipos de marcadores moleculares al análisis de la diversidad es revelador de un elevado grado de polimorfismo, tanto interno en cada población como entre poblaciones. Los 156 fragmentos amplificados por los 11 sistemas microsatélites (SSR) estudiadas, permiten una separación perfecta de las poblaciones con respecto a sus números cromosómicos. Los resultados de los 16 marcadores inter-microsatélites (ISSR) seleccionados resultaron especialmente útiles para la estimación de la diversidad intra-poblacional. La variabilidad intra-poblacional e inter-poblacional detectada en las poblaciones analizadas, pone de relieve la amplitud de la base genética disponible en la colección de poblaciones autóctonas españolas de B. destachona. Por el volumen del material analizado y los resultados obtenidos se considera esta colección suficiente y de una gran utilidad potencial para iniciar la selección de líneas útiles para la obtención de cubiertas vegetales de interés agronómico y para aplicaciones biotecnológicas

Análisis de la diversidad genética en una colección de poblaciones españolas de "Brachypodium distachyon" como material de base para la mejora y aplicaciones biotecnológica

Contiene: Tesis doctoral. No contiene los 4 ficheros Excel (Matrices), en CD-ROMEn este trabajo se ha llevado a cabo la evaluación de la diversidad genética que encierra una colección de 23 poblaciones naturales de Brachypodium distachyon recogidas en diversas regiones de la Península Ibérica. Se ha utilizado como referencia dos líneas domesticadas y comercializadas. Esta especie presenta variabilidad en el número de cromosomas por lo que el primer objetivo fue el de caracterizar la constitución cromosómica de cada población y estudiar el origen de tal variación, así como su influencia en la variabilidad genética, distribución eco-geográfica, rasgos morfológicos y comportamiento de las muestras en cultivo in vitro. La evaluación de la respuesta al cultivo in vitro de embriones inmaduros de muestras procedentes de todas las poblaciones se abordó en varios medios de inducción de la embriogénesis somática y de regeneración. El análisis de los cariotipos de cada población, permitió clasificar las poblaciones de la colección de B. distachyon en tres grupos, con 10,20 y 30 cromosomas. En base a los resultados de la hibridación in situ de fluorescencia (FISH) con las sondas de los genes ribosomales 5SRDNA y 45SrDNA y de hibridación in situ genómica (GISH) con ADN de los tres citotipos, se demuestra el carácter aditivo de la constitución cromosómica de las poblaciones con 2n=30cromosomas a partir de las de 2n=10 y 2n=20. De este modo, las formas de 2n030 serían aloploides originadas por hibridación y duplicación cromosómica de dos formas diploides de cariotipos y número de cromosomas diferentes, 2n=10 y 2n=20. Estas diferencias cromosómicos apuntan a que las formas vegetales que las representan podrían tratarse de especies diferentes del mismo género Brachypodium, lo que obligaría a una revisión taxonómica del género. El estudio del comportamiento en cultivo in vitro se ha realizado en dos fases. En primer lugar se abordó un estudio del comportamiento de los embriones cigóticos inmaduros de todas las muestras de poblaciones de B.distachyon en dos medios de cultivo: MS y MSm, que se diferencian en la fuente de carbono. Del mismo, se puede deducir que existe una amplia variabilidad en la respuesta al cultivo in vitro, que abarca desde poblaciones recalcitrantes a otras con un nivel de respuesta medio-alto, tanto en la fase de producción de callos embriogénicos como en la capacidad de regeneración de brotes verdes. Los resultados no permiten recomendar un medio idóneo para todas las poblaciones. En una segunda aproximación, se eligieron dos poblaciones de cada grupo cromosómico (Bd160 y ?Zulema?, 2n=10; Bd114 y Bd115, 2n=20 y Bd238 y Bd341, 2n=30) para ensayar 9 medios de cultivos que se diferenciaron en el tipo de fitohormona (2,4-D, Piclorán y Dicamba) incorporada al medio y en su concentración. En la fase de inducción de la embriogénesis somática se observó diferencias significativas en el número de callos totales /total de embriones puestos en cultivo (TC), también el análisis de varianza ANOVA aplicado a la variable número de callos compactos/ total de callos (CC) indicó diferencias altamente significativas entre los diferentes genotipos ensayados y señaló la importancia de la interacción "genotipo x medio" en el éxito de esta primera fase de cultivo. Los medios BR1, BR2 y BR3 preparados con 2,4-D (1 mg/l, 2mg/l y 4mg/l, respectivamente) fueron los mejores para inducir la embriogénesis somática. Sin embargo, los medios preparados con Piclorán y Dicamba fueron los peores, con unos porcentajes de callos blandos muy altos. Se ha observado que las poblaciones con números cromosómicos superiores Bd238 y Bd341 (2n=30) y Bd114 (2n=20) mostraron una buena capacidad embriogénica. Todos los callos se pasaron a un medio de germinación G1, con el fin de producir plántulas verdes. Las poblaciones con 2n=20 (Bd114 y Bd115) no manifestaron la respuesta esperada en base a su alta capacidad para formar callos embriogénicos. Teniendo en cuenta los resultados de ambos ensayos de cultivo in vitro se destaca la interacción "Medio x Genotipo" y el control genético de los mecanismos de inducción de la embriogénesis somática y la regeneración de brotes verdes que parecen estar controladas por sistemas genéticos distintos. El estudio de la diversidad genética interna de cada población y entre las poblaciones se ha llevado a cabo utilizando tres tipos de análisis: proteínas de reserva del endospermo y marcadores moleculares tipo microsatélites (SSR) e inter-microsatélites (ISSR). Los tres tipos de aproximaciones han permitido establecer relaciones se similtud entre las poblaciones. El análisis de la diversidad de las proteínas de reserva del endospermo demuestra el orden creciente de variabilidad genética al aumentar el número de cromosomas de las poblaciones. Se ha llevado a cabo un análisis de similitud utilizando el coeficiente de Jaccard y el agrupamiento de las poblaciones de acuerdo con el método UPGMA. Las poblaciones con el mismo número cromosómico tienden a agruparse entre sí, dentro del mismo clúster, con coeficientes de aproximación variables. Se demuestra la influencia de algunos factores eco-geográficos y climáticos en la distribución de las 23 poblaciones naturales de B. distachyon La aplicación de dos tipos de marcadores moleculares al análisis de la diversidad es revelador de un elevado grado de polimorfismo, tanto interno en cada población como entre poblaciones. Los 156 fragmentos amplificados por los 11 sistemas microsatélites (SSR) estudiadas, permiten una separación perfecta de las poblaciones con respecto a sus números cromosómicos. Los resultados de los 16 marcadores inter-microsatélites (ISSR) seleccionados resultaron especialmente útiles para la estimación de la diversidad intra-poblacional. La variabilidad intra-poblacional e inter-poblacional detectada en las poblaciones analizadas, pone de relieve la amplitud de la base genética disponible en la colección de poblaciones autóctonas españolas de B. destachona. Por el volumen del material analizado y los resultados obtenidos se considera esta colección suficiente y de una gran utilidad potencial para iniciar la selección de líneas útiles para la obtención de cubiertas vegetales de interés agronómico y para aplicaciones biotecnológicas

In vitro culture of inmature embryos in three cytotypes of Brachypodium distachyon (L.) P. Beauv.

15 Pags., 3 Figs., 5 Tabls.[ES] En este trabajo se ha analizado la respuesta al cultivo in vitro de muestras de seis poblaciones de Brachy- podium distachyon (dos por cada uno de los citotipos 2n = 10; 2n = 20; 2n = 30), para lo cual se ha par- tido de embriones cigóticos inmaduros que fueron sembrados en nueve medios de inducción de callos (BR1 a BR9), que se diferenciaban entre sí en el regulador de crecimiento utilizado (Ácido 2,4-Diclorofenoxia- cético (2,4-D), Piclorán o Dicamba) y en su concentración (1, 2 ó 4 mg/l). Para cada uno de los medios uti- lizados se han realizado cuatro repeticiones de 20 embriones por tratamiento. Los resultados obtenidos fueron analizados posteriormente mediante un análisis de la varianza (ANOVA) de las variables: nº de ca- llos totales/nº total de embriones (TC); nº de callos compactos/nº total de callos (CC); nº de callos blandos/nº total de callos (SC). La respuesta ha sido muy variable, tanto para el número como para el tipo de callo formado, dependiendo de la población y el medio de cultivo empleado. Así, las muestras con 2n = 30 cro- mosomas son las que han dado lugar a un mayor número de callos totales y también de callos embrio- génicos. La mejor respuesta se obtuvo en aquellos medios de cultivos que contenían 2,4-D, con indepen- dencia de la concentración. Los callos obtenidos se distribuyeron al azar en cuatro grupos y se sembraron en un medio de regeneración (G1) conteniendo BAP (0,5 mg/l) y se incubaron en una cámara climática con un fotoperiodo de 14 h de luz y 22ºC de temperatura constante. Al cabo de un mes se contabilizó el nú- mero de brotes formados (verdes o albinos) y se calcularon las siguientes variables: nº de brotes totales (verdes+ albinos)/nº total de callos (TSV), nº de brotes verdes/nº total callos (TSVC), nº de brotes verdes a partir de callos compactos/nº total callos compactos (SCC), nº de brotes verdes a partir de callos blandos/nº total callos blandos (SSC) y nº total brotes verdes/nº total embriones (R). Los ANOVA de estas variables, re- velaron diferencias significativas entre las poblaciones para cada una de las variables estudiadas. Los seis genotipos han sido clasificados en función de su aptitud para la regeneración de plantas a par- tir del cultivo in vitro de embriones inmaduros (variable R). Así, las dos poblaciones con 2n = 30 cro- mosomas, Bd238 y Bd341, fueron las de mejor comportamiento mientras que las poblaciones Bd160 y ‘Zulema’ con 2n = 10 cromosomas, mostraron la respuesta más baja.[EN] In this work the in vitro culture response of six population samples of Brachypodium distachyon (two by each one of the cytotypes of 2n = 10 2n = 20; 2n = 30) has been analyzed. Immature zygotic embryo were seeded for callus induction in nine culture media (BR1 to BR9), that were different to each other in the growth regulator kind of (2, 4-dichlorophenoxyacetic acid (2, 4-D), Picloran or Dicamba) and con- centration (1, 2 or 4 mg/l), with four repetitions with 20 embryos per treatment. Results were subse- quently analyzed using an ANOVA test for the following variables:TC = total calluses number / total em- bryos number; CC = compact calluses number / total calluses number; SC = soft calluses number/ total calluses number. A very different response among them, as much for the number as for the type of cal- lus developed, has been observed, based on the genotype and culture medium used. Thus, the sam- ples with 2n = 30 chromosomes gave rise to a greater number of total calluses and embryogenic cal- luses. The culture mediums that induced the best response were those that contained 2, 4-D in all the concentrations tested. The obtained calluses were distributed in four repetitions and they were seeded in the regeneration media containing N6-benzyl-aminopurine BAP (0.5 mg/l) and were transferred to a chamber growth with a photoperiod of 14 h light and a constant temperature of 22ºC. After a month, the number of developed buds (green or albinos) was counted and were estimated the following vari- ables: TSV = total number of buds (green + albinos) / total number of calluses; TSVC = number of green buds / total number of calluses; SCC = number of green buds from compact calluses / total number of compact calluses; SSC = number of green buds from soft calluses /total number of soft calluses; Total green buds/total immature embryos (R). The ANOVA test for each one of the variables revealed sig- nificant differences between the populations. The study of the variable R, that summarizes the response of the in vitro culture, has allowed classifying the six populations based on its aptitude for the regen- eration of plants from the in vitro culture of immature embryos. Thus, two populations of 2n = 30 chro- mosomes, Bd238 and Bd341 were those of the best behavior, whereas the populations Bd160 and `Zulema’ with 2n = 10 chromosomes, showed the lowest response.Este trabajo ha sido realizado gracias a la financiación del Ministerio de Ciencia e Innovación (proyectos AGL2006-09018-C02-01GL; AGL-2009-10373), R. Hammami, agradece al Ministerio de Educación y Ciencia la beca concedida para la realización de este trabajo (BES-2007-14361).Peer reviewe

Durum Wheat Couscous Grains: An Ethnic Mediterranean Food at the Interface of Traditional Domestic Preparation and Industrial Manufacturing

International audienceCouscous is the product prepared from durum wheat semolina that agglomerates by adding water and undergoes physical and thermal treatment. Couscous is a traditional food from Mediterranean countries consumed for many centuries. Between ancestral domestic practices and industrial performance, the diversity of methods for couscous processing meets the needs of different consumers, whether they are concerned about preserving family culinary traditions or discovering innovative foods that respond to changing consumption patterns. In this work, we present the story of durum wheat couscous through several complementary visions and approaches: a “historical and societal“ approach to discover the origins of couscous, its migrations and its unifying role in Mediterranean societies; a “physicochemical” approach to describe the role of wheat components at the heart of couscous grains; a “technological” approach to compare domestic and industrial production of couscous; a “food science” approach to understand organoleptic characteristics of couscous grains; and a “consumer” approach to understand the motivations associated with the consumption of couscou

Caracterización de exudados peptídicos de raíz en condiciones de estrés salino en Prunus

Resumen del trabajo presentado en la X Reunión de la Sociedad Española de Cultivo In Vitro de Tejidos Vegetales (SECIVTV), celebrada en Zaragoza (España), del 23 al 24 de octubre de 2013El cultivo in vitro de raíces aisladas resultó adecuado para el estudio de la tolerancia a la salinidad de patrones de frutales de hueso, de manera que los más tolerantes crecían más y a mayor concentración de sal. Aparte de un aumento de la concentración de prolina, tanto en el exudado de las raíces, como en sus tejidos, la sal produjo otros cambios morfológicos, como la acumulación de almidón en la zona de maduración del ápice de la raíz. En este trabajo estudiamos cambios en los péptidos exudados por las raíces del patrón de cerezo `Masto de Montañana¿ (P. cerasus), que es poco tolerante a la sal, en cultivo in vitro de raíces aisladas bajo estrés salino (60 mM NaCl). El análisis mediante HPLC de los péptidos exudados reveló diferencias importantes en los cromatogramas respecto al control sin sal añadida, mostrando diferencias en los picos encontrados así como en su tamaño. La evaluación de la respuesta al estrés salino de `Masto de Montañana¿ analizando la composición de los exudados puede llevar a la identificación de marcadores bioquímicos relacionados con la tolerancia a la salinidad en Prunus.Este trabajo ha sido parcialmente financiado por el proyecto INIA-FEDER RTA2010-00053-C03-03 y por el Grupo de Excelencia A43 (Gobierno de Aragón). RH disfrutó de un contrato de Movilidad de Investigadores financiado por el Gobierno de Aragón entre Mayo y Diciembre de 201