Contribution du couplage CE-ICP/MS dans l'étude des interactions métals-protéine non-covalentes

Le criblage des interactions protéine/métal grâce à l utilisation du couplage CE-ICP/MS a été étudié. La mise au point de ce nouvel outil analytique nécessite, outre un interfaçage de ces deux techniques, ine séparation efficace des protéines et une détection sensible des métaux.L optimisation de la séparation électrophorétique d un mélange de protéines-test a conduit à l utilisation d un tampon borate à pH 9,2, qui minimise l adsorption et permet la séparation de toutes les protéines du mélange avec une bonne reproductibilité des temps de migration.L interfaçage entre l électrophorèse capillaire et l ICP/MS a été réalisé à l aide d une interface avec une solution conductrice. L optimisation des paramètres tels que débits des gaz, débit et composition de la solution conductrice et position du capillaire dans le micronébuliseur a été réalisée afin d obtenir les meilleures sensibilité de détection et efficacité de séparation.Toutefois, ce type d interface entraîne des dilutions importantes des échantillons, qui nous ont conduits à développer un système de préconcentration en ligne afin d améliorer les limites de détection. Le calcul des limites de détection réalisé sur le cuivre et le zinc contenus dans l anhydrase carbonique, protéine la moins efficacement concentrée, montre une amélioration des limites de détection en CE-ICP/MS de 6 fois pour le cuivre et 5 fois pour le zinc.Ce couplage a ensuite été utilisé dans l étude des interactions de trois métaux de transition (Cd, Co et Ni) avec un mélange de protéines constitué de métalloprotéines et protéines majeures du sérum sanguin.Ces études montrent un comportement similaire du cobalt et du nickel, différant totalement de celui du cadmium. Dans le cas des métalloprotéines, le couplage CE-ICP/MS permet également de conclure quant à la nature probable des sites d interaction. De plus, cette méthode a permis d étudier l affinité relative des différents métaux vis-à-vis du mélange de protéines.L aspect dissociatif du couplage a également été exploité pour obtenir des données cinétiques, permettant l accès aux constantes de dissociation des complexes et dans certains cas, à la mise en évidence de sites d interaction multiples.Enfin, la technique a été appliquée à des cations dits durs : lanthanides et uranyle (UO22+). Les premiers résultats démontrent une adsorption massive de ces cations à la surface des capillaires. Néanmoins, les études réalisées sur un mélange de six protéines, préalablement identifiées comme cibles de l uranium, montrent que quatre d entre elles interagissent avec l uranium, parmi lesquelles l albumine et la transferrine.The screening of metal/protein interactions using CE coupled to ICP/MS was investigated. The development of this new analytical tool requires, besides the hyphenation of the two techniques, both an efficient separation of the proteins and a sensitive detection of metals. The optimization of the electrophoretic separation of a protein-test mixture led to the use of a borate buffer, pH 9.2, which both minimizes adsorption and allows the separation of all proteins mixture with a good migration times reproducibility. The hyphenation between capillary electrophoresis and ICP/MS was performed using a sheath flow interface. The optimization of parameters, such as coolant, auxiliary and nebulizer gases, composition and flowrate of the sheath flow solution and position of the capillary in the nebulizer was carried out in order to obtain the best detection sensitivity and separation efficiency. However, this type of interface involves important samples dilutions, which led us to develop an on-line preconcentration technique in order to improve the detection limits. The detection limits calculated for the copper and zinc contained in the carbonic anhydrase, the less efficiently concentrated protein, showed an improvement of the detection limits in CE-ICP/MS of 6 times for copper and 5 times for zinc.CE-ICP/MS was then used in the study of the interactions of three transition metals (Cd, Co and Ni) with a mixture of proteins made of metalloproteins and major blood serum proteins. These studies revealed a similar behavior of cobalt and nickel, completely different from that of cadmium. In the case of the metalloproteins, hyphenated CE-ICP/MS allowed to identify the probable nature of the interaction sites. Moreover, this method allowed studies on the relative affinity of various metals with a mixture of proteins. The dissociative aspect of the separation was also exploited in order to obtain kinetic data which allowed the access to the dissociation constants of the complexes and in certain cases, highlighted the presence of multiple interaction sites.Finally, the technique was applied to so-called hard cations : lanthanides and uranyl ion (UO22+). The first results showed a massive adsorption of these cations on the capillaries surface. Nevertheless, the studies, carried out on a mixture of six proteins, previously identified as uranium-targets, showed that four of them interact with the uranium, among which albumin and transferrin.STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF

Conception de supports monolithiques de silice pour la chromatographie

L objectif de ce travail de thèse a été de développer des colonnes monolithiques, d une part en étudiant les différents paramètres influençant la formation des phases associées et d autre part en développant une méthode de mise en colonne pour permettre leur utilisation en chromatographie. La nouvelle voie de synthèse proposée, utilisant le polymère F68 dans la génération de ces monolithes, s est révélée plus avantageuse que celle du PEG, permettant l obtention de phases de faible taille de domaine et présentant une structure mésoporeuse en l absence de traitement basique. D autre part, une méthode originale de mise en colonne a été développée et a ainsi permis l utilisation de ces monolithes en chromatographie. Les performances obtenues ont été améliorées par rapport à la bibliographie. Cependant, des élargissements de pics liés à l hétérogénéité de ces phases et à leur mise en colonne sont encore présents. La forte perméabilité des colonnes monolithiques a été mise à profit en couplant des colonnes afin de réaliser la séparation efficace de phospholipides de soja.This thesis aimed at developing monolithic phases, on the one hand by studying the different parameters influencing the formation of the monolithic structure and on the other hand by developing a cladding procedure in order to apply these monoliths in chromatography. A new procedure based on the use of the F68 triblock copolymer was compared to the classical PEG, in the formation of silica monoliths, and was demonstrated to be promising since it leads to co-continuous structures presenting both smaller throughpores, in a wider composition range, and mesporous structures without any alkaline treatment. Moreover, an original cladding method was developed and allowed use of such monoliths in chromatography. The obtained separation performances were improved seven times if compared to those reported in the literature. Nevertheless, peak broadening due to phase heterogeneity and cladding still occurs. The high permeability of the columns was used by coupling several columns to achieve the efficiency required for the separation of phospholipids.STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF

Conception d'immunogènes métalliques en vue de la détection du césium par immunoanalyse (Synthèse et caractérisation)

STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF

Développements analytiques pour le criblage d'interactions lanthanides/ligands

Ce travail étudie le potentiel de l'électrophorèse capillaire couplée à la spectrométrie de masse à ionisation par plasma (ICP/MS) pour le criblage d'une bibliothèque de ligands en fonction de leur affinité pour l'europium en milieu hydro-organique. Cette méthode permet, d'une part, d'évaluer l'affinité des ligands phosphorés en moins de deux heures et en utilisant moins de 15 ng de ligand, et d'autre part, de déterminer les constantes de complexation. Les résultats sont en accord avec ceux obtenus par titrage spectrophotométrique.Parallèlement, une bibliothèque de copolymères pour l'extraction solide/liquide de l'europium a été étudiée. Le protocole d'extraction mis au point permet de les classer selon leur affinité pour celui-ci en milieu hydro-organique et en utilisant 60 mg de copolymère. Pour les plus prometteurs, les propriétés de reconnaissance et la sélectivité La3+/Eu3+/Lu3+ ont été évaluées.This work investigates the potential of hyphenated capillary electrophoresis and inductively coupled mass spectrometry to classify different ligands according to their europium binding affinity in a hydro-organic medium. On the one hand, this method enables to evaluate the affinity of phosphorus-containing ligands in less than two hours and using less than 15 ng of ligand. On the other hand, complexation constants could be determined. The results are in excellent agreement with the values obtained by spectrophotometric titrations.Moreover, a library of copolymers for solid/liquid extraction of europium is investigated. The extraction protocol enables to classify copolymers according to their europium affinity in a hydro-organic medium. This screening requires 60 mg of copolymers. For the most promising recognition properties and selectivity La3+/Eu3+/Lu3+ are evaluated.STRASBOURG-Bib.electronique 063 (674829902) / SudocSudocFranceF

Conception de supports greffés imac miniaturisés (Vers un criblage des interactions métal/protéine)

STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF

The Metal Dependence of Pyoverdine Interactions with Its Outer Membrane Receptor FpvA▿

To acquire iron, Pseudomonas aeruginosa secretes the fluorescent siderophore pyoverdine (Pvd), which chelates iron and shuttles it into the cells via the specific outer membrane transporter FpvA. We studied the role of iron and other metals in the binding and transport of Pvd by FpvA and conclude that there is no significant affinity between FpvA and metal-free Pvd. We found that the fluorescent in vivo complex of iron-free FpvA-Pvd is in fact a complex with aluminum (FpvA-Pvd-Al) formed from trace aluminum in the growth medium. When Pseudomonas aeruginosa was cultured in a medium that had been treated with a metal affinity resin, the in vivo formation of the FpvA-Pvd complex and the recycling of Pvd on FpvA were nearly abolished. The accumulation of Pvd in the periplasm of Pseudomonas aeruginosa was also reduced in the treated growth medium, while the addition of 1 μM AlCl3 to the treated medium restored the effects of trace metals observed in standard growth medium. Using fluorescent resonance energy transfer and surface plasmon resonance techniques, the in vitro interactions between Pvd and detergent-solubilized FpvA were also shown to be metal dependent. We demonstrated that FpvA binds Pvd-Fe but not Pvd and that Pvd did not compete with Pvd-Fe for FpvA binding. In light of our finding that the Pvd-Al complex is transported across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa, a model for siderophore recognition based on a metal-induced conformation followed by redox selectivity for iron is discussed

Cytocompatibility / Antibacterial Activity Trade-off for Knittable Wet-Spun Chitosan Monofilaments Functionalized by the In Situ Incorporation of Cu 2+ and Zn 2+

International audienceThe wet spinning of cytocompatible, bioresorbable, and knittable chitosan (CTS) monofilaments would be advantageous for a variety of surgical applications. The complexation capacity of chitosan with Cu2+ or Zn2+ can be leveraged to enhance its antibacterial activity, but not at the expense of cytocompatibility. In this work, a wet-spinning process was adapted for the in situ incorporation of Cu2+ or Zn2+ with chitosan dopes to produce monofilaments at different drawing ratios (τtot) with various cation/glucosamine molar ratios, evaluated in the fibers (rCu,f and rZn,f). Cytocompatibility and antibacterial activity of wet-spun monofilaments were, respectively, quantified by in vitro live-dead assays on balb 3T3 and by different evaluations of the proliferation inhibition of Staphylococcus epidermidis (Gram+) and Escherichia coli (Gram−). Knittability was tested by a specific tensile test using a knitting needle and evaluated with an industrial knitting machine. It was found that rCu,f = 0.01 and rZn,f = 0.03 significantly increase the antibacterial activity without compromising cytocompatibility. Wet spinning with τtot = 1.6 allowed the production of knittable CTS-Cu monofilaments, as confirmed by knitting assays under industrial conditions

Quelle éducation avec la Covid-19

APPEL A CONTRIBUTION : QUE NOUS APPREND LA PANDEMIE? Numéro HS Recherches et Educations (Juillet 2020) (HCERES 70ème section) Qu'est ce que la pandémie nous apprend de nos sociétés, de nos politiques de santé publique, des souverainetés épistémologiques de la recherche et des praxis individuelles et collectives? Solidarités ou/ et d'exclusions? Stratégies d'adaptation au confinement ou de rejet? Comment agit-on dans ce monde incertain, soumis à l'autorité des politiques de gestion d'un virus? Soumission volontaire à l'autorité ou organisation des résistances? Quels sont les savoirs exercés sur quels pouvoirs ? Quelles sont les légitimités et les responsabilités plurielles : individuelles, collectives, politiques et sociales ? Quels sont les usages sociaux et politiques des résultats de la recherche des experts ? Qu’apprenons nous des expériences de prévention individuelles, européennes et internationales ? Comment s’exercent les pouvoirs à partir des savoirs des épistémologies et des évidence-base medecine ? Comment l’histoire des épidémies pourrait répondre à notre présent ? Quel futur pour notre société après la pandémie ? Quelles seront nos inégalités sociales ? Vers quelles écologies ? Quelles résistances ? Quel mode de vie ? Quelles expériences corporelles de l’absence de toucher et de la distanciation ? Quelle croissance ? Quelle décroissance ? Quelles solidarités face à la techno-économique ? La revue Recherches & Educations lance un appel à contribution, multi disciplinaire, sur le « dispositif covid 19 » pendant le confinement imposé aux populations. Elle propose de réunir les textes critiques et réflexifs sur ce que nous apprend l’épidémie et la pandémie de nous même, de notre relation au vivant, à la mondialisation néolibérale, aux souverainetés de santé, au gouvernement des corps, de la psyché et de la vie, aux politiques de prévention, aux représentations de l’épidémie, aux pratiques corporelles visuelles et tactiles, aux modes de résistances et aux praxis du quotidien du présent et de demain. Texte à adresser (avant le 30 mai 2020) en 30.000 signes à [email protected] [email protected] [email protected]