Formulation, characterization and processing of protein-based hydrogels

In den letzten Jahren ist der Bedarf an Materialien aus erneuerbaren Ressourcen gestiegen, was zu großen Fortschritten auf dem Gebiet der proteinbasierten Materialien geführt hat. Derzeit konzentriert sich die Forschung in diesem Feld dabei insbesondere auf Anwendungen im medizinischen Bereich, da Proteine und Peptide in der Regel biokompatibel und biologisch abbaubar sind und über spezifische, auf Stimuli reagierende Materialeigenschaften verfügen. Fortschritte in der Rekombinationstechnologie für Desoxyribonukleinsäure (DNA) ermöglichten die Entwicklung von Polymeren auf Peptidbasis, die auf natürlichen Vorbildern basieren. Ein Beispielmolekül, das in dieser Dissertation verwendet wird, sind elastinähnliche Proteine (ELPs), die das Tropoelastin von Säugetieren nachahmen. Obwohl sie für das Design neuer proteinbasierter Materialien mit gewünschten Eigenschaften von entscheidender Bedeutung sind, sind die Einflussparameter während der Formulierung und Lagerung, die die mechanischen Eigenschaften der gebildeten Hydrogele bestimmen, sowie die der Bildung von Proteinnetzwerken zugrunde liegende Physik nach wie vor kaum verstanden. Das Ziel dieser Arbeit ist es, das Verständnis von proteinbasierten Hydrogelen während ihrer Formulierung, Charakterisierung und Verarbeitung zu verbessern. Neben der Entwicklung von dityrosinvernetzten proteinbasierten Hydrogelformulierungen für Homo- und Copolymere aus natürlich vorkommenden Proteinen und eines künstlich hergestellten ELPs, wurden im Rahmen dieser Arbeit auch verschiedene weitere Herausforderungen im Zusammenhang mit proteinbasierten Hydrogelen behandelt. Damit proteinbasierte Hydrogele aus rekombinant exprimierten ELP gebildet werden können, wurde zunächst deren Herstellung untersucht, indem drei Aufreinigungsprozesse für ein hydrophobes ELP-Konstrukt mit niedrigem Temperaturübergang durchgeführt und bewertet wurden. Im Formulierung- und Prozessierungsteil dieser Arbeit wurde eine neuartige Tinte für den Extrusionsdruck von unmodifiziertem Kasein entwickelt, um die prinzipielle Anwendbarkeit der additiven Fertigung zur Funktionalisierung und Verarbeitung des Hydrogelmaterials zu demonstrieren. Zur Charakterisierung der entwickelten Materialien wurden herkömmliche makroskopische Methoden wie Rheometrie, Kompression und gewichtsbasiertes Quellverhalten angewandt. Mit der Magnetresonanztomographie wurde eine zerstörungsfreie Analysestrategie mit hoher räumlicher Auflösung etabliert, um das Quellverhalten von Hydrogelen zu überwachen. Mit diesem Ansatz konnte die Flüssigkeitsaufnahme und das Quellverhalten von Hydrogelen, die in Flüssigkeiten mit komplexer Zusammensetzung hergestellt und gequollen wurden, sowie das Verhalten komplexer Hydrogelgeometrien beschrieben werden, was besonders für die Charakterisierung funktionalisierter Hydrogelmaterialien nützlich ist. Die drei Themen Formulierung, Charakterisierung und Verarbeitung wurden in insgesamt fünf Studien mit dityrosinvernetzten Hydrogelen auf Proteinbasis aus unterschiedlichen Perspektiven behandelt. In einer ersten Studie wurden drei verschiedene Aufreinigungsprozesse für ein neuartiges, künstlich entwickeltes hydrophobes ELP-Konstrukt, das in Einschlusskörpern in Escherichia coli exprimiert wurde, untersucht. Neben dem Ziel einer hohen Zielausbeute und Reinheit, sowie eines wirtschaftlichen und skalierbaren Prozessdesigns wurden zusätzlich der Salzgehalt der Formulierung und der Nukleinsäuregehalt betrachtet. Die Aufreinigung des mit Hexahistidin markierten ELP-Konstrukts mit einer unteren kritischen Lösungstemperatur (LCST) unterhalb der Raumtemperatur in Wasser wurde durch Homogenisierung und Auflösung der Einschlusskörper begonnen, entweder gefolgt von einer Hochsalzfällung, einer Kombination aus Hochsalzfällung und einem Zyklus des inverse transition cycling (ITC) oder einer immobilisierten Metallaffinitätschromatographie (IMAC) in Kombination mit einer Größenausschlusschromatographie. Die Methode der Hochsalzfällung hatte die höchste Ausbeute an Zielmolekülen, aber eine geringe Reinheit (60 %) und eine höhere Nukleinsäurekontamination und höheren Salzgehalt in der Endformulierung. Die ITC-Methode erhöhte die Reinheit und die Nukleinsäureentfernung, verringerte aber auch die Gesamtausbeute um 17 bis 34 % während des Niedrigtemperaturzentrifugationsschritts in Abhängigkeit von der angewandten Zentrifugationszeit aufgrund der niedrigen LCST-Temperatur des verwendeten ELP-Konstrukts. IMAC hatte eine vergleichbare Reinheit und eine etwas geringere Ausbeute, aber auch eine höhere Nukleinsäureentfernung. Unter Berücksichtigung der skalenabhängigen Kosten und dem Ziel, Material für biomedizinische Anwendungen zu erzeugen, sollte ITC (hohe Prozessierungskosten aufgrund der temperaturabhängigen Zentrifugationsschritte) gegen IMAC (hohe Investitionskosten) abgewogen werden, während die salzinduzierte Fällung aufgrund ihrer hohen Ausbeute und Einfachheit eine Option für Massenanwendungen sein könnte. Vor der Polymerisation von proteinbasierten Hydrogelen aus diesem ELP-Konstrukt, wurde eine Studie mit einem allgemeineren Ansatz durchgeführt. Ziel der Studie war es, zu verstehen, wie die Art und die Eigenschaften des Proteins in Kombination mit den Formulierungsbedingungen die mechanischen Eigenschaften der dityrosinvernetzten Hydrogele beeinflussen. Die unmodifizierten, handelsüblichen Proteine Rinderserumalbumin (BSA) und Kasein wurden unter verschiedenen Bedingungen vernetzt, wobei das photoinitiierende System konstant gehalten wurde. Die resultierenden Hydrogelnetzwerke wurden in Puffersystemen mit oder ohne externe Stimuli gelagert und die Hydrogele auf ihre mechanischen Eigenschaften hin untersucht. Die Proteinfaltung und damit die dreidimensionale (3D) Anordnung und die Oberflächenverfügbarkeit der Aminosäurereste wurden durch Zugabe verschiedener Harnstoffkonzentrationen zum Formulierungspuffer variiert und der Speichermodul sowie der Verlustfaktor mit oszillierender Rheometrie gemessen. Höhere Harnstoffkonzentrationen verstärkten die strukturelle Festigkeit und Elastizität des Hydrogels, wobei die genauen zugrunde liegenden Mechanismen, die für diesen Effekt verantwortlich sind, unklar bleiben. Der Speichermodul, die Bruchdehnung und die Druckfestigkeit nahmen mit der Proteinkonzentration zu, während die Elastizität ein konzentrationsabhängiges Maximum bei 60 mg/ml BSA aufwies und die Bruchdehnung oberhalb von 80 mg/ml BSA nicht weiter anstieg. In der letzten Teilstudie wurden das rheologische Verhalten und das gewichtsbezogene Quellungsverhältnis von Hydrogelen, die entweder 100 mg/ml Casein oder BSA enthielten, in Abhängigkeit von der Harnstoffkonzentration und der Nettoladung des BSA-Proteins bei verschiedenen pH-Werten der Formulierung untersucht. Die sich daraus ergebenden Hydrogeleigenschaften waren vom Protein und vom Lagermedium abhängig, was die Bedeutung der Formulierungskomponenten für die Entwicklung der gewünschten mechanischen Eigenschaften von dityrosinvernetzten Hydrogelen auf Proteinbasis hervorhebt. Um die große Vielfalt der potenziell vernetzbaren Proteine zu demonstrieren, wurden diese Methoden im weiteren Verlauf auf insgesamt vier Proteine angewandt, die vom intrinsisch ungeordneten ELP-Konstrukt bis zu BSA mit einer geordneten Tertiärstruktur reichen. Diese Proteine wurden verwendet, um entweder dityrosinvernetzte Homo- oder Copolymerhydrogele herzustellen, wobei die Proteine in unterschiedlichen Verhältnissen gemischt wurden. Die rheologischen Eigenschaften der resultierenden homopolymeren Hydrogelnetzwerke unterschieden sich je nach Proteincharakteristik, während die Eigenschaften durch Kompressionsversuche für alle Proteinkonstrukte vergleichbar waren. Das zweite Ziel dieser Studie war es, eine Möglichkeit zu finden, die mechanischen Eigenschaften von dityrosinvernetzten Hydrogelen zu modifizieren, ohne den spezifischen Einfluss bestimmter Proteineigenschaften auf das resultierende Hydrogelnetzwerk zu bestimmen, da dies aufgrund der vielen Faktoren, die zwischen den chemisch komplexen Proteinmolekülen variieren, schwierig ist. Zu diesem Zweck wurden Copolymerhydrogele polymerisiert, indem je zwei der vier Proteine vor der Vernetzung in zwei verschiedenen Pufferbedingungen gemischt wurden, wobei die Gesamtsumme der Aminosäuren durch Verwendung gewichtsabhängiger Konzentrationen konstant gehalten wurde. Die rheologischen Eigenschaften dieser copolymeren Hydrogele waren von den gemischten Proteintypen und -konzentrationen abhängig, wobei die Druckfestigkeit und die Zähigkeit des Hydrogels bei kaseinhaltigen Mischungen im Vergleich zu den entsprechenden Homopolymeren am höchsten waren. Insgesamt konnte innerhalb der Grenzen der Studie gezeigt werden, dass es möglich ist, die mechanischen Eigenschaften von dityrosinvernetzten Hydrogelen auf Proteinbasis zu verändern, indem copolymere Hydrogele aus verschiedenen Proteinen mit bekannten Eigenschaften ihrer homopolymeren Hydrogele hergestellt werden. Damit steht mit dieser Methodik ein einfaches Werkzeug für das gezielte Design mechanischer Eigenschaften von Hydrogelen auf Proteinbasis für spezifische Anwendungen zur Verfügung. Für die Verarbeitung biobasierter Materialien ist eine mögliche Option die additive Fertigung, eine Methode zur schichtweisen Herstellung von 3D-Objekten mit komplexen Geometrien. Die meisten Tintenformulierungen für biobasierte Materialien beruhen auf modifizierten chemischen Substanzen. Ein Vorteil der photoinduzierten Dityrosinvernetzung ist, dass dadurch unter anderem der extrusionsbasierte Druck von unmodifizierten Proteinen möglich sein kann. In einer weiteren Studie wurde eine photopolymerisierbare Tintenformulierung auf der Grundlage des natürlich vorkommenden Proteins Kasein für den Extrusionsdruck entwickelt. Diese Tinte wird durch Mischen des Proteins, des Photoinitiatorsystems, eines Puffers und eines Verdickungsmittels zur Erhöhung der Extrudierbarkeit der Tintenlösung hergestellt. Die Studie zeigte, dass die Herstellbarkeit einer solchen Tinte stark von dem verwendeten Verdickungsmittel und dem verwendeten Mischverfahren abhängt. Insgesamt wurden acht verschiedene Verdickungsmittel getestet, um das am besten geeignete zu finden, das die Viskosität der gemischten Tinte erhöht, ohne dass es zu einer irreversiblen Schaumbildung oder einer Hemmung der Polymerisation formstabiler Hydrogele kommt. Für die entwickelte Tintenformulierung erwies sich Natriumalginat als das wirksamste Verdickungsmittel und wurde für den Druck funktionalisierter Hydrogelstrukturen mit bis zu 30 Schichten verwendet.   Neben der Verarbeitung zu funktionalisierten Hydrogelstrukturen ist das Verständnis und die Charakterisierung der zeitabhängigen stimulusabhängigen Verhaltens solcher Hydrogele wichtig in der Entwicklung für ihre potenziellen Anwendungen. Hydrogele können aus mehreren Komponenten bestehen, wobei Salze und Puffersubstanzen mehr als die Hälfte des Trockengewichts des Hydrogels im Ausgangszustand ausmachen können. Diese Eigenschaften können eine aussagekräftige Interpretation gängiger Analysemethoden, wie z. B. gewichtsbasierter Quellungsquotienten, erschweren. Die Magnetresonanztomographie (MRI) ist eine zerstörungsfreie Technik, die eine räumlich aufgelöste 3D-Untersuchung von weichen Materialien ermöglicht. Die zuvor entwickelte Tintenformulierung wurde als eine auxetische Struktur gedruckt, getrocknet, um vergleichbare Probenbedingungen zu schaffen, und ihr Flüssigkeitsaufnahme- und Quellverhalten in verschiedenen Flüssigkeiten mittels MRI untersucht. Es zeigte sich, dass das Verhalten des Hydrogels je nach Flüssigkeit, in die es eingetaucht war, unterschiedlich war. Diese Studie zeigte das Potenzial des Einsatzes von MRI zur Untersuchung komplexer struktureller Veränderungen von Hydrogelen, zur Überwachung der Aufnahme von Flüssigkeit in das Hydrogel und der stimulusabhängigen Hydrogelreaktion. Diese Arbeit hat durch ein tieferes Verständnis der Faktoren, die die Hydrogelformulierung unter Verwendung der durch sichtbares Licht induzierten Dityrosinvernetzung beeinflussen, den Grundstein für die gezielte Entwicklung von Hydrogelen auf Proteinbasis gelegt. Darüber hinaus wurde ein tiefes Verständnis des Produktionsprozesses eines hydrophoben elastinähnlichen Proteins gewonnen, was dazu beitragen wird, die Produktion dieser Proteinklasse effizienter und kostengünstiger zu gestalten. Die maßgeschneiderte Verarbeitung der entwickelten Materialien durch Extrusionsdruck ermöglicht die Herstellung funktionalisierter Hydrogele mit maßgeschneiderten mechanischen Eigenschaften. Um komplexe Prozesse in diesen funktionalisierten Hydrogelen zu untersuchen, kann MRI eingesetzt werden. Ihr Potenzial wurde durch die Überwachung des zeitabhängigen Flüssigkeitsaufnahme und Quellverhaltens von auxetischen Hydrogelstrukturen gezeigt

What Drives the Success of Pop-Up Stores?

Pop-up stores are considered an alternative or a further development of the pioneering flagship store concept. They describe a temporary store concept that displays products in an unexpected way to attract the consumers’ attention (Hutter 2013). So far, this store format has mainly been applied to the USA and the UK, and has been insufficiently studied. This paper summarizes interim results of a pilot study on pop-up stores, which focuses on identifying factors for their success.Pop-up Stores stellen eine konzeptionelle Weiterentwicklung von Flagship Stores dar. Pop-Up Stores beschreiben ein zeitlich limitiertes Storekonzept, bei dem Produkte in einer ungewöhnlichen und finanziell erschwinglichen Art und Weise dem Kunden präsentiert werden (Hutter 2013). Bislang wird dieses neuartige Storekonzept überwiegend in den USA und in UK praktiziert und wissenschaftlich diskutiert. Der vorliegende Beitrag fasst erste Zwischenergebnisse einer Pilotstudie zu den Erfolgsfaktoren von Pop-up Stores zusammen

Ein versicherungsmathematischer Ansatz zur Berechnung von Marktwerten der Deckungsrückstellung in der Lebensversicherung

Zusammenfassung: Basierend auf den bekannten versicherungsmathematischen Berechnungsmethoden zur Bestimmung der Höhe von versicherungstechnischen Verbindlichkeiten für die Lebensversicherung wird eine Lösung zur Kalkulation von Marktwerten vorgestellt, welche den Prinzipien von Solvency II Rechnung trägt. Kernstück dabei ist die Diskontierung von wahrscheinlichkeitsgewichteten künftigen Cashflows, welche durch die Berechnung von aktuarischen Barwerten unter Einbeziehung von Rechnungsgrundlagen 2. Ordnung (Zinskurve, Stornoverhalten, Kosten, Prämienfreistellungsverhalten, etc.) umgesetzt wird. Die Studie enthält sowohl die Herleitung und Diskussion des benötigten Formelwerkes als auch die exemplarische Darstellung anhand ausgewählter Tarifbeispiele. Die besprochenen Prinzipien sind auch maßgeblich für die geplanten IFRS Vorschriften, welche mittlerweile als Exposure Draft vorliege

Practical Usage of OER Material in the EFL Classroom

In this research work, we want to follow the idea of using open educational resources (OER) in a classroom to gather practical experiences. The topic of our choice is English as a foreign language (EFL), because in our opinion a lot of teaching content should be available. The preparation of the lectures, as well as the final lecturing, is described to understand how OER can be used in the EFL classroom. The feedback of the pupils and the lessons learned point out that there are more obstacles than expected, mainly because of the strict copyright law in German-speaking Europe

Die Berichterstattung des ORF über die Olympischen Sommerspiele 2008 in Peking

Wie wirkt sich eine eingeschränkte Meinungs- und Pressefreiheit eines autoritären Landes auf die Berichterstattung von ausländischen JournalistInnen aus? Welche Probleme tauchten hinsichtlich der Berichterstattungen über die Olympischen Spiele in Peking für die JournalistInnen des ORF auf und wie gestaltete sich der Umgang mit chinesischen Sicherheitsorganen? Welche Themen wurden überhaupt im Zusammenhang mit den Olympischen Spielen in die Berichterstattung aufgenommen und welche Nachrichtenfaktoren waren dafür ausschlaggebend? Im Zuge dieser wissenschaftlichen Untersuchung lieferten vor allem die Theorien der Journalismusforschung wie die Gatekeeper-Theorie oder die Nachrichtenwerttheorie den dazu benötigten theoretischen Hintergrund. Drei erfahrene JournalistInnen des ORF wurden mittels eines teilstandardisierten Gesprächsleitfadens bezüglich ihrer Erfahrungen mit der Meinungs- und Pressefreiheit während den Olympischen Spielen von 8. bis 24. August 2008 in Peking befragt. Die Aussagen der ExpertInnen wurden mit Hilfe einer computergestützten qualitativen Inhaltsanalyse ausgewertet. Für eine barrierefreie Berichterstattung der ORF-JournalistInnen war die im Jänner 2007 von der chinesischen Regierung eingeführte Regelung hinsichtlich der Ausweitung der Reise- und Recherchetätigkeit für ausländische JournalistInnen ausschlaggebend, denn vor dem 1.1.2007 machten sich diese noch strafbar, wenn trotz gültiger Journalistenakkreditierung ohne Anmeldung beim Ausländeramt in eine andere Region außerhalb Pekings gereist wurde. Im Zuge der Nachrichtenauswahl gingen vor allem viele negative Themen in die Berichterstattung über die Olympischen Spiele und China ein. Dieses Aufkommen negativer Schlagzeilen lässt sich unter anderem auch auf den ökologisch schlechten Zustand Chinas wie zum Beispiel der Luftverschmutzung zurückführen oder die in diesem Zeitraum vermehrt auftauchenden politischen Vorkommnisse. Andererseits wurde schon im Vorfeld der Olympischen Spiele Druck vonseiten europäischer Medien aufgebaut. So wurden JournalistInnen anlässlich des European Editors Forum 2008 in Wien unter anderem darauf aufmerksam gemacht, die Probleme Chinas zu beleuchten, um eine unmenschliche Entwicklung dieses Landes zu unterbinden. Die empirischen Ergebnisse dieser vorliegenden Arbeit können vor allem in der Journalismusforschung eingesetzt werden, da unter anderem auch aufgezeigt wird, welche rechtlichen Maßnahmen für JournalistInnen in einem Land gegeben sein müssen, um einen freien Nachrichtenfluss national wie international zu gewährleisten bzw. welche wirtschaftlichen Faktoren dabei vonseiten eines Medienunternehmens vorhanden sein müssen, um frei von kommerziellen Zwängen berichten zu können

Changing mechanical properties of photopolymerized, dityrosine-crosslinked protein-based hydrogels

Hydrogels based on renewable resources are a promising class of materials for future applications in pharmaceutics, drug delivery and personalized medicine. Thus, optional adjustments of mechanical properties such as swelling behavior, elasticity and network strength are desired. In this context, hydrogels based on the biological raw materials bovine serum albumin and casein were prepared by dityrosine-crosslinking of their tyrosine residues through visible light-induced photopolymerization. Changing the tyrosine accessibility by urea addition before photopolymerization increased the storage modulus of the hydrogels by 650% while simultaneously being more elastic. Furthermore, contributions of the buffer system composition, variation of protein concentration and storage medium towards mechanical properties of the hydrogel such as storage moduli, elasticity, fracture strain, compressive strength and relative weight swelling ratio are discussed. It could be shown, that changes in precursor solution and storage medium characteristics are crucial parameters towards tuning the mechanical properties of protein-based hydrogels

Magnetic Resonance Imaging: Time-DependentWetting and Swelling Behavior of an Auxetic Hydrogel Based on Natural Polymers

A time-dependent understanding of swelling characteristics and external stimuli behavior is crucial for the development and understanding of functional hydrogels. Magnetic resonance imaging (MRI) offers the opportunity to study three-dimensional (3D) soft materials nondestructively. This technique is already widely used as an image-based medical diagnostic tool and is applied here to evaluate complex structures of a hydrogel—a double network of chemically crosslinked casein enhanced with alginate—fabricated by 3D printing. When hydrogel disks immersed in four different liquid systems were analyzed, the material exhibited distinct system-dependent behavior characterized by rheological and mechanical measurements. Further material functionalization was achieved by macroscopic structuring of the hydrogel as an auxetic material based on a re-entrant honeycomb structure. MRI offers the advantage of monitoring overall changes in the area of the analyzed specimen and internal structural changes simultaneously. To assess the behavior of this complex structure, a series of short MRI measurements, each lasting 1.7 min, captured liquid diffusion and thus structural swelling behavior. A clear dependence of external and internal structural changes as a function of liquid properties causing these changes was observed. In conclusion, this approach might pave the way for prospective applications to monitor liquid diffusion into (e.g., vascularization) and swelling behavior of functional hydrogels

Die Abo-Commerce Landschaft in Deutschland: Eine angebotsbezogene Untersuchung

In den letzten Jahren wurde in der Startup-Szene über eine neuartige Form des Onlinehandels debattiert: Abo-Commerce. Hierbei handelt es sich um ein Geschäftsmodell, bei dem Kunden in regelmäßigen Abständen mit einer online bestellten Ware beliefert werden, ohne dafür erneute Bestellungen aufgeben zu müssen (Warkentin 2013, ExperCash GmbH 2015). Bislang findet Abo-Commerce in der deutschen Wissenschaft noch wenig Beachtung. Der vorliegende Beitrag stellt die Ergebnisse einer inhaltsanalytischen Untersuchung zur Abbildung der Abo-Commerce-Landschaft in Deutschland vor.In recent years, a discussion about a novel form of online-based business models has taken place among young entrepreneurs: online home delivery subscriptions. Thereby, online-subscribers can get convenient home delivery on a continuing basis without reordering (Warkentin 2013, ExperCash GmbH 2015). So far, online home delivery subscriptions have not been intensively researched within the academic field in Germany. The paper presents results on a qualitative research project focusing on mapping the landscape of German companies offering such services