Comparative Analysis of Mesenchymal Stem Cell Cultivation in Fetal Calf Serum, Human Serum, and Platelet Lysate in 2D and 3D Systems

In vitro two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cultivation of mammalian cells requires supplementation with serum. Mesenchymal stem cells (MSCs) are widely used in clinical trials for bioregenerative medicine and in most cases, in vitro expansion and differentiation of these cells are required before application. Optimized expansion and differentiation protocols play a key role in the treatment outcome. 3D cell cultivation systems are more comparable to in vivo conditions and can provide both, more physiological MSC expansion and a better understanding of intercellular and cell-matrix interactions. Xeno-free cultivation conditions minimize risks of immune response after implantation. Human platelet lysate (hPL) appears to be a valuable alternative to widely used fetal calf serum (FCS) since no ethical issues are associated with its harvest, it contains a high concentration of growth factors and cytokines and it can be produced from expired platelet concentrate. In this study, we analyzed and compared proliferation, as well as osteogenic and chondrogenic differentiation of human adipose tissue-derived MSCs (hAD-MSC) using three different supplements: FCS, human serum (HS), and hPL in 2D. Furthermore, online monitoring of osteogenic differentiation under the influence of different supplements was performed in 2D. hPL-cultivated MSCs exhibited a higher proliferation and differentiation rate compared to HS- or FCS-cultivated cells. We demonstrated a fast and successful chondrogenic differentiation in the 2D system with the addition of hPL. Additionally, FCS, HS, and hPL were used to formulate Gelatin-methacryloyl (GelMA) hydrogels in order to evaluate the influence of the different supplements on the cell spreading and proliferation of cells growing in 3D culture. In addition, the hydrogel constructs were cultivated in media supplemented with three different supplements. In comparison to FCS and HS, the addition of hPL to GelMA hydrogels during the encapsulation of hAD-MSCs resulted in enhanced cell spreading and proliferation. This effect was promoted even further by cultivating the hydrogel constructs in hPL-supplemented media

Xeno-Free In Vitro Cultivation and Osteogenic Differentiation of hAD-MSCs on Resorbable 3D Printed RESOMER

The development of alloplastic resorbable materials can revolutionize the field of implantation technology in regenerative medicine. Additional opportunities to colonize the three-dimensionally (3D) printed constructs with the patient’s own cells prior to implantation can improve the regeneration process but requires optimization of cultivation protocols. Human platelet lysate (hPL) has already proven to be a suitable replacement for fetal calf serum (FCS) in 2D and 3D cell cultures. In this study, we investigated the in vitro biocompatibility of the printed RESOMER® Filament LG D1.75 materials as well as the osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells (hMSCs) cultivated on 3D printed constructs under the influence of different medium supplements (FCS, human serum (HS) and hPL). Additionally, the in vitro degradation of the material was studied over six months. We demonstrated that LG D1.75 is biocompatible and has no in vitro cytotoxic effects on hMSCs. Furthermore, hMSCs grown on the constructs could be differentiated into osteoblasts, especially supported by supplementation with hPL. Over six months under physiological in vitro conditions, a distinct degradation was observed, which, however, had no influence on the biocompatibility of the material. Thus, the overall suitability of the material LG D1.75 to produce 3D printed, resorbable bone implants and the promising use of hPL in the xeno-free cultivation of human MSCs on such implants for autologous transplantation have been demonstrated

Successive Bacterial Colonisation of Pork and its Implications for Forensic Investigations

Aims: Bacteria are considered one of the major driving forces of the mammalian decomposition process and have only recently been recognised as forensic tools. At this point, little is known about their potential use as ‘post-mortem clocks’. This study aimed to establish the proof of concept for using bacterial identification as post-mortem interval (PMI) indicators, using a multi-omics approach. Methods and Results: Pieces of pork were placed in the University’s outdoor facility and surface swabs were taken at regular intervals up to 60 days. Terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) of the 16S rDNA was used to identify bacterial taxa. It succeeded in detecting two out of three key contributors involved in decomposition and represents the first study to reveal Vibrionaceae as abundant on decomposing pork. However, a high fraction of present bacterial taxa could not be identified by T-RFLP. Proteomic analyses were also performed at selected time points, and they partially succeeded in the identification of precise strains, subspecies and species of bacteria that colonized the body after different PMIs. Conclusion: T-RFLP is incapable of reliably and fully identifying bacterial taxa, whereas proteomics could help in the identification of specific strains of bacteria. Nevertheless, microbial identification by next generation sequencing might be used as PMI clock in future investigations and in conjunction with information provided by forensic entomologists. Significance and Impact of the Study: To the best of our knowledge, this work represents the first attempt to find a cheaper and easily accessible, culture-independent alternative to high-throughput techniques to establish a ‘microbial clock’, in combination with proteomic strategies to address this issue

Die Bedeutung von Leukozyten-Subpopulationen in der Entstehung kardiovaskulärer Ereignisse nach nicht-kardiochirurgischen Operationen

Weltweit werden jährlich mehr als 312 Millionen Operationen durchgeführt und die Tendenz ist weiter steigend. Dabei stellen kardiovaskuläre und zerebrovaskuläre Komplikationen eine der häufigsten Ursachen für perioperative Morbidität und Letalität dar. Insbesondere Patienten mit vorbestehender kardiovaskulärer Grunderkrankung weisen ein vielfach erhöhtes Risiko auf. Eine zuverlässige und präzise Patientenevaluierung erlaubt die Abschätzung des individuellen Risikos, auf dessen Grundlage gezielt Maßnahmen zur Optimierung des Zustandes und der Prävention perioperativer kardiovaskulärer Ereignisse eingeleitet werden können. Eine Vielzahl perioperativ auftretender Myokardinfarkte ist auf die Ruptur atherosklerotischer Plaques zurückzuführen, in deren Folge es zur Ausbildung eines gefäßverschließenden Thrombus kommen kann. Die Ursachen sind multifaktoriell, jedoch scheinen durch perioperativen Stress induzierte immunologische Vorgänge eine wesentliche Rolle in der perioperativen Plaquedestabilisierung einzunehmen. Abseits chirurgischer Eingriffe korrelieren einzelne Leukozyten- Subpopulationen langfristig mit dem Auftreten kardiovaskulärer und zerebrovaskulärer Ereignisse. Ziel der vorgelegten Arbeit war zu untersuchen, ob diese Effekte auch für die Entstehung kardiovaskulärer Komplikationen nach nicht-kardiochirurgischen Operationen eine relevante Bedeutung einnehmen. In der prospektiven Beobachtungsstudie LeukoKAPE-1 wurden 13 Leukozyten-Subpopulationen, dessen Auftreten langfristig mit kardiovaskulären Ereignissen assoziiert ist, in 38 kardialen Risikopatienten, die sich einem nicht-kardiochirurgischen Eingriff unterzogen, bis einschließlich des zweiten postoperativen Tages quantifiziert. Die Kohorte entwickelte unter dem Einfluss perioperativen Stresses eine Tendenz in Richtung eines höheren kardiovaskulären Risikoprofils, was sich in Form einer konsekutiven Zunahme atherogener klassischer und intermediärer Monozyten manifestierte. Nicht-klassische Monozyten sanken hingegen kurzzeitig; lymphoide Zellpopulationen blieben gegenüber ihren präoperativen Ausgangswerten konstant. Der perioperative Monozyten- Anstieg war von einer konstanten Zunahme des Monozyten-Aktivierungsmarkers Presepsin begleitet. Patienten, die den zusammengesetzten primären Endpunkt (kardiovaskulärer Tod, Myokardinfarkt, Myokardischämie und thromboembolischer Schlaganfall) während des 30-tägigen Beobachtungszeitraumes erreichten, wiesen gegenüber Patienten ohne Endpunkt präoperativ höhere Presepsin-Konzentrationen auf. Presepsin oberhalb des abgeleiteten Cut-offs von 184 pg/ml war mit dem Auftreten kardiovaskulärer Komplikationen assoziiert. Diese Ergebnisse ließen sich im Rahmen einer post-hoc Analyse der unabhängigen LeukoKAPE-2 Kohorte (n=222) replizieren. Presepsin >184pg/ml erwies sich unter Berücksichtigung präoperativer Einflussfaktoren als unabhängiger Prädiktor des primären Endpunktes. Sensitivitäts- und Reklassifizierungsanalysen deuteten zudem auf einen prognostischen Mehrwert der präoperativen Presepsin-Bestimmung zur leitliniengerechten Risikoevaluierung für kardiovaskuläre und zerebrovaskuläre Komplikationen nach nicht-kardiochirurgischen Operationen hin. Eine prospektive, multizentrische Beobachtungsstudie wird zeigen (NCT03489486), ob sich Prespesin als Surrogat-Marker der inflammatorischen Disposition eines Patienten für die präoperative kardiovaskuläre Risikoprädiktion qualifiziert. In LeukoKAPE-1 korrelierten präoperative regulatorische T-Zell-Level negativ mit der Inzidenz perioperativer kardiovaskulärer Komplikationen. In Mäusen führt eine anhaltende Reduktion regulatorischer T-Zellen zur Zunahme von Plaquegröße und -vulnerabilität. Umgekehrt geht die Expansion der Zellen mit einer verminderten Bildung atherosklerotischer Plaques sowie einer stabileren Plaquearchitektur einher. Ob präoperative regulatorische T-Zell-Level in einem kausalen Zusammenhang mit der perioperativ auftretenden Destabilisierung atherosklerotischer Plaques stehen, wurde in einem etablierten atherosklerotischen Mausmodell untersucht. Dazu wurden Apolipoprotein E-defiziente Mäuse mit präoperativ moduliertem regulatorischen T-Zell-Level einer Laparotomie mit moderatem Blutverlust unterzogen. Die Antikörper-vermittelte in vivo Modulierung regulatorischer T-Zellen erwies sich als spezifisch und resultierte in einer Reduktion der Zellen um etwa 60 % sowie in einer Expansion zirkulierender regulatorischer T-Zellen um Faktor fünf gegenüber der jeweiligen Kontrollgruppe. Die histomorphometrische Auswertung atherosklerotischer Plaques der Brachiozephalarterien erfolgte am dritten postoperativen Tag. Unabhängig des regulatorischen T-Zell-Levels führte die Intervention zur Abnahme des Plaque-Kollagengehaltes. Operierte Mäuse mit präoperativ reduziertem regulatorischen T-Zell-Level wiesen gegenüber Tieren mit hohem regulatorischen T-Zell-Level tendenziell instabilere Plaques auf, was sich in Form eines höheren Nekrose- und eines niedrigeren Kollagengehaltes manifestierte. Präoperativ niedrige regulatorische T-Zell-Level waren zudem mit einer numerischen Verdopplung der Anzahl verdeckter fibröser Kappen als Zeichen vergangener Plaquerupturen assoziiert. Hingegen konnte kein Effekt des präoperativen regulatorischen T-Zell-Levels auf das postoperative Plaquevolumen, den Anteil glatter Muskelzellen, den Lipidgehalt sowie die Zellularität atherosklerotischer Läsionen nachgewiesen werden. Folgeprojekte werden zeigen, ob die Verlängerung des postoperativen Zeitraumes von drei auf zehn Tage einen deutlicheren Effekt präoperativer Treg-Level auf die perioperative Plaquedestabilisierung hervorbringt. Die in dieser Arbeit dargelegten Ergebnisse geben erstmals Hinweise auf die Implikation von Tregs in der Entstehung perioperativer kardiovaskulärer Komplikationen. Sollte sich in Folgeprojekten ein protektiver Effekt präoperativ hoher Treg-Level auf die perioperative Plaquedestabilisierung bestätigen, könnte dies die Grundlage neuer Therapieansätze zur Prävention kardiovaskulärer Ereignisse nach nicht-kardiochirurgischen Operationen bilden

Successive Bacterial Colonisation of Pork and its Implications for Forensic Investigations

Aims: Bacteria are considered one of the major driving forces of the mammalian decomposition process and have only recently been recognised as forensic tools. At this point, little is known about their potential use as ?post-mortem clocks?. This study aimed to establish the proof of concept for using bacterial identification as post-mortem interval (PMI) indicators, using a multi-omics approach. Methods and Results: Pieces of pork were placed in the University?s outdoor facility and surface swabs were taken at regular intervals up to 60 days. Terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) of the 16S rDNA was used to identify bacterial taxa. It succeeded in detecting two out of three key contributors involved in decomposition and represents the first study to reveal Vibrionaceae as abundant on decomposing pork. However, a high fraction of present bacterial taxa could not be identified by T-RFLP. Proteomic analyses were also performed at selected time points, and they partially succeeded in the identification of precise strains, subspecies and species of bacteria that colonized the body after different PMIs. Conclusion: T-RFLP is incapable of reliably and fully identifying bacterial taxa, whereas proteomics could help in the identification of specific strains of bacteria. Nevertheless, microbial identification by next generation sequencing might be used as PMI clock in future investigations and in conjunction with information provided by forensic entomologists. Significance and Impact of the Study: To the best of our knowledge, this work represents the first attempt to find a cheaper and easily accessible, culture-independent alternative to high-throughput techniques to establish a ?microbial clock?, in combination with proteomic strategies to address this issue

Gelatin-Methacryloyl (GelMA) Formulated with Human Platelet Lysate Supports Mesenchymal Stem Cell Proliferation and Differentiation and Enhances the Hydrogel’s Mechanical Properties

Three-dimensional (3D) cell culture is a major focus of current research, since cultivation under physiological conditions provides more reliable information about in vivo cell behavior. 3D cell cultures are used in basic research to better understand intercellular and cell-matrix interactions. Moreover, 3D cell culture plays an increasingly important role in the in vitro testing of bioactive substances and tissue engineering. Gelatin-methacryloyl (GelMA) hydrogels of different degrees of functionalization (DoFs) are a versatile tool for 3D cell culture and related applications such as bioprinting. Human platelet lysate (hPL) has already demonstrated positive effects on 2D cell cultures of different cell types and has proven a valuable alternative to fetal calf serum (FCS). Traditionally, all hydrogels are formulated using buffers. In this study, we supplemented GelMA hydrogels of different DoF with hPL during adipose tissue-derived mesenchymal stem cell (AD-MSCs) encapsulation. We studied the effect of hPL supplementation on the spreading, proliferation, and osteogenic differentiation of AD-MSCs. In addition, the influence of hPL on hydrogel properties was also investigated. We demonstrate that the addition of hPL enhanced AD-MSC spreading, proliferation, and osteogenic differentiation in a concentration-dependent manner. Moreover, the addition of hPL also increased GelMA viscosity and stiffness