Pitfalls in the synthesis of fluorescent methotrexate oligopeptide conjugates

Abstract Methotrexate (MTX) conjugates with poly[Lys(DL-Alam)] based polymeric polypeptides are efficient against Leishmania donovani parasite infection, but the mechanism of the effect is not known yet. We prepared therefore the 5(6)-carboxyfluorescein (Cf) labelled oligopeptide [Cf-K(AaAa)]† and the correspoding MTX-conjugates [Cf-K(MTX-AaAa)] as model compounds for structure-activity experiments. The conjugate aimed to be synthesized with solid-phase methodology on MBHA resin with Boc strategy, using Fmoc-Lys(Boc)-OH. However, various side-reactions were identified. Here we report three problems observed during the synthesis as well as solutions developed by us: a) Unexpected cyclopeptide-formation with the lactone-carboxylic group of the Cf was detected, when Cf was attached to the α-amino group of the Lys residue on solid phase. This was avoided by changing the order of Cf incorporation with using Fmoc/Dde strategy. Alternatively, we have built the peptide with Fmoc strategy on solid phase first and performed the labelling with Cf-OSu subsequently in solution. b) During HF cleavage of the protected conjugates, MTX was demonstrated to form adducts with anisole and p-cresol scavengers, and the TMSOTf cleavage methodology was also found to be inadequate due to the large number of side products formed. We report here that using Fmoc/Dde strategy is an appropriate method to circumvent the cleavage with HF or TMSOTf. c) During the coupling of MTX with oligopeptide, structural and stereo isomers are formed. We have described here the suitable conditions of HPLC separation of these products

Cellular Uptake Mechanism of Cationic Branched Polypeptides with Poly[L‑Lys] Backbone

Cationic macromolecular carriers can be effective carriers for small molecular compounds, drugs, epitopes, or nucleic acids. Polylysine-based polymeric branched polypeptides have been systematically studied on the level of cells and organisms as well. In the present study, we report our findings on the cellular uptake characteristics of nine structurally related polylysine-based polypeptides with cationic side chains composed of (i) single amino acid (poly[Lys(Xi)], XiK) or (ii) oligo[DL-alanine] (poly[Lys(DL-Alam)], AK) or (iii) oligo[DL-alanine] with an additional amino acid (X) at the terminal position (poly[Lys(Xi-DL-Alam)] (XAK)) or (iv) at the position next to the polylysine backbone (poly[Lys(DL-Alam-Xi)] (AXK)). In vitro cytotoxicity and cellular uptake were characterized on HT-29 human colon carcinoma and HepG2 human hepatocarcinoma cell lines. Data indicate that the polycationic polypeptides studied are essentially nontoxic in the concentration range studied, and their uptake is very much dependent on the side chain structure (length, identity of amino acid X, and distance between the terminal positive charges) and also on the cell lines. Our findings in uptake inhibition studies suggest that predominantly macropinocytosis and caveole/lipid raft mediated endocytosis are involved. The efficacy of their internalization is markedly influenced by the hydrophobicity and charge properties of the amino acid X. Interestingly, the uptake properties of the these polypeptides show certain similarities to the entry pathways of several cell penetrating peptides

NaBH4 – a novel method for the deprotection of Nω-nitro-arginine

The selective deprotection of Nω-nitro-arginine derivatives represents a major preparative challenge. This problem can be circumvented by the use of catalytic hydrogenation, but often high pressure, elevated temperature, and/or long reaction times are needed. In certain cases hydrogenation is not suitable, for example, small-scale reactions, parallel synthesis, or due to selectivity issues. Herein, we demonstrate for the first time, the use of NaBH4 in the presence of a metal ion catalyst for the removal of the Nω-nitro moiety under simple, ‘open-vessel’ conditions. This process using NaBH4 does not remove the benzyloxy-carbonyl-protecting group; thus the method is orthogonal for this protecting scheme

Epitópok illetve antimikrobiális hatású peptidek, peptidszármazékok célzott bevitele makrofág típusú sejtekbe = Targeting of epitope or antimicrobial peptides and derivatives to macrophages

A kutatás során számos olyan új vegyület készült el, amelyek segítségével tisztázni lehet epitóp peptidek és hatóanyagok célsejtbe (makrofágba) juttatásának szerkezeti illetve funkcionális feltételeit. Vizsgálataink fontos eredménye olyan biokonjugátumok előállítása volt, amelyekben az alkotórészek a kémiai kötés kialakítása után is megtartották biológiai funkciójukat (pl. T-sejt válasz indukció, ellenanyagfelismerés, antituberkulotikus hatás). A nagyrészt nívós nemzetközi folyóiratokban közölt eredmények közül kiemelkedik annak a jelenségnek a leírása és sokoldalú bizonyítása, amely szerint a makrofágok polianionos szintetikus makromolekulák felvételére scavenger A receptort ?használnak?. Kimutattuk, hogy efféle molekulához kovalensen kapcsolt riporter egység (fluorofor) bekerül a sejtbe. Ez a megfigyelés, valamint a kemotaxis alapú célbajuttatás jelenségének leírása lényegesek lehetnek makromolekulára alapozott célbajuttató rendszerek kifejlesztésében (makromolekula kiválasztás, intracelluláris kötés stabilitás stb.) és segíthetik új gyógyszerek kifejlesztését. | We have prepared a number of new bioconjugates and their components. These compounds proved to be useful for understanding and identification of structural and functional requirements for targeting macrophages. The components of new conjugates prepared preserved their funcional properties (e.g. T cell response provoking capacity, antibody recognition, antituberculotic activity). Among the most important findings we describe that macrophages could internalize polyanionic, synthetic compounds as well as their conjugates. We found that for this purpose scavenger A receptors are utilised. As another important result of the last few years we also proposed and provided experimental evidence concerning the principle of chemotaxis based drug/epitop delivery. Results achieved were presented in International journals and conferences. Our findings could be considered as useful contribution to the development of macromolecule based targeting for drug research and/or immundiagnostics

Potenciálisan biológiailag aktív fémorganikus vegyületek - ferrocészubsztituált heterociklusok - és peptid-konjugátumaik szintézise, szerkezet-felderítése és komplex nagyműszeres (NMR, IR, UP, Mössbauer spektroszkópiai és Röntgen-diffrakciós) vizsgálata = Synthesis, structure determination and complex instrumental (NMR, IR, UP, Mössbauer spectroscopic and x-ray diffraction) study on organometallic compounds - ferrocenyl-substituted heterocycles - and their peptide derivatives with expected biological

Tanulmányoztuk a ferrocén-szubsztiutució hatását heterociklusok képződésére. Hatástani vizsgálatokhoz változatos szerkezetű fc-származékok előállítására törekedtünk. Előállítottunk (het)aril-fc kalkonokat, s pirazol/in-származékaikat. Etilazido-fc-akrilátból foszforilideken át többféle hetaril-vegyületet nyertünk. Piridazinonil-fc-t és bisz-analógját előállítva, fázistranszfer diallilezést követő metatézissel ferrocenofánokhoz jutottunk. Hidrazinnal két fc-hidas makrociklusokat nyertünk, tanulmányoztuk konformációjukat, s elkészítettük Pd-komplexeiket. Acilferrocének tio/metiltio-szemikarbazonjaiból DMAD-val változatos heterociklusokat kaptunk. Vizsgáltuk diacil-fc-hidrazonok cikloaddícióit. A reaktivitásbeli eltéréseket és NMR-úton igazolt molekuladinamikát számításokkal értelmeztük. Az új vegyületek szerkezetét spektroszkópiával (IR, NMR, MS) és röntgendiffrakcióval tisztáztuk. Az új fc-származék in vitro tumorgátló hatását vizsgáltuk humán leukémia sejteken, a leghatékonyabb vegyületek hatását rezisztens sejteken is és hasonlóan jó növekedésgátlást észleltünk. Oligoarginin komponensekkel előállítottuk a fc-karbonsav és a fc-akrilsav új peptid-konjugátumait és meghatároztuk a sejtnövekedés-gátló hatást HL-60 sejtvonalon. Előállítottunk fc-(glioxil)-aminosav- és -szteroid-kalkon-konjugátumokat Pd-katalizált karbonilezéssel. Módszert dolgoztunk ki heterodiszubsztituált ferrocének 1,1'-dijód-ferrocénből kiinduló homogén katalitikus szintézisére. | The effect of ferrocene (fc) substituent on the formation of heterocycles was studied. For screening we produced a variety of fc compounds. We prepared (het)aryl-fc chalcones and their pyrazol/(in)e derivatives. From ethyl-azido-fc-acrylate some aryl-heterocycles were obtained. We prepared pyridazinonyl-fc and its bis analogue, from which via phase transfer diallylation and metathesis we obtained different ferrocenophanes. The reactions with hydrazine gave macrocycles with two fc bridges. The molecular dynamics was studied and Pd-complexes were prepared. The reactions of DMAD with tio/methylthiosemicarbazones of acyl-fc's yielded new heterorings. We studied the hydrazones and their cycloadditions. The structure-reactivity relationships and the molecular dynamics revealed by NMR were interpreted by calculations. The structures of the novel compounds were cleared by spectroscopy (IR,NMR, MS) and x-ray analysis. The in vitro antitumor activity of novel fc-derivatives were investigated on human leukemia cells. The most effective ones were also studied on resistant cells and gave good results. Using oligoarginin components, peptide conjugates of fc-carboxylic and -acrylic acid were obtained, and their antiproliferative effect was determined on HL-60 cells. Fc-(glyoxyl) amino acid- and steroid-chalcone-conjugates were synthesised by Pd-catalysed carbonylation. We elaborated a homogeneous catalytic route towards heterodisubstituted fc's from 1,1'-diiodo-fc

Allocentrikus és egocentrikus téri referenciakeretek kapcsolata a szorongásos élményekről adott önbeszámolókkal

Véleményünk szerint a különböző szorongásos tünetek jelentős része a környezet neuronális és kognitív reprezentációja során megjelenő zavarokra vezethető vissza. E zavarok térről való élmény és tudás reprezentációjában mutatkozó hibás beállítódásokban is tetten érhetők. A bemutatandó tanulmány a Tárgy Mentális Rotációs Teszt (TMRT), valamint a Kéz Mentális Rotációs Teszt (KMRT) segítségével, a szorongás azon összetevőit tárja fel, melyek összefüggést mutatnak a téri szignálok kezelésének zavaraival. A két teszt hasonló mentális rotációs, döntési és perceptuális folyamatokat igényel. A különbség közöttük a rotáció menetében megalkotott referencia keretek használatában van. Az TMRT esetében allocentrikus, KMRT esetében egocentrikus referencia keret működik aktívabban. A vizsgálatban 38 különböző szorongás értékekkel rendelkező személy vett részt. Eredményeink szerint, az allo cent ri kus és egocentrikus referencia használathoz különböző típusú szimptómák kapcsolódnak. Az allo centri kus referencia domináns használatához a „Mit csinálok a környezetemben?”, míg az egocentrikus referenciákkal dolgozó személyeknél az „Én milyen vagyok, hogyan értékelem magam?” típusú kérdés csoportokban azonosíthatók a szorongásos szimptómák. A mentális reprezentáció biológiai bázisát is be mutató interpretációink jelzik, hogy különböző típusú szorongáshoz különböző típusú téri referenciakeret és a hátterében álló különböző téri reprezentáció áll.Several symptoms encountered in psychological practice, such as anxiety, phobias, depression; they appear to involve abnormalities of the brain’s representation of the outside world. These phenomena undoubtedly include some underlying disturbances of the basic machinery of spatial perception, cognition, and knowledge representation. The aim of the research reported in this paper is to seek anxiety components which may play a role in spatial cognitive functions under different types of dynamic imagery task. The object mental rotation test (MRT) and the hand mental rotation test (HMRT) is frequently used to test the dynamic spatial imagery. The completion of the MRT supported by dominantly allocentric reference frame in contrast the HMRT supported by egocentric references. Studying of anxiety components of allocentric MRT and egocentric HMRT together, the analysis of the items of the anxiety and fear questionnaires show that MRT is connected with those items that give answer to „What does the person do?” question in an allocentric social surrounding. In contrast, at HMRT there are dominantly egocentric questions that show connections with the „What I am like?” type question. Our results demonstrate that different forms of anxiety are connected with preferency of special spatial representation type. We can say, there are a biological based allocentric and egocentric spatial reference balances, which determine the symptoms and cognitive contents of the different kinds of anxiety

Carrier Design: Influence of Charge on Interaction of Branched Polymeric Polypeptides with Phospholipid Model Membranes

Trabajo presentado por primera vez en 3rd International Symposium on Frontiers in Biomedical Applications in conjunction with the Polymer Therapeutics Symposium, celebrado en Shiga (Japón) entre el 23 y el 27 de mayo de 1999.Peer reviewe