Common Cell Shape Evolution of Two Nasopharyngeal Pathogens

Respiratory infectious diseases are the third cause of worldwide death. The nasopharynx is the portal of entry and the ecological niche of many microorganisms, of which some are pathogenic to humans, such as Neisseria meningitidis and Moraxella catarrhalis. These microbes possess several surface structures that interact with the actors of the innate immune system. In our attempt to understand the past evolution of these bacteria and their adaption to the nasopharynx, we first studied differences in cell wall structure, one of the strongest immune-modulators. We were able to show that a modification of peptidoglycan (PG) composition (increased proportion of pentapeptides) and a cell shape change from rod to cocci had been selected for along the past evolution of N. meningitidis. Using genomic comparison across species, we correlated the emergence of the new cell shape (cocci) with the deletion, from the genome of N. meningitidis ancestor, of only one gene: yacF. Moreover, the reconstruction of this genetic deletion in a bacterium harboring the ancestral version of the locus together with the analysis of the PG structure, suggest that this gene is coordinating the transition from cell elongation to cell division. Accompanying the loss of yacF, the elongation machinery was also lost by several of the descendants leading to the change in the PG structure observed in N. meningitidis. Finally, the same evolution was observed for the ancestor of M. catarrhalis. This suggests a strong selection of these genetic events during the colonization of the nasopharynx. This selection may have been forced by the requirement of evolving permissive interaction with the immune system, the need to reduce the cellular surface exposed to immune attacks without reducing the intracellular storage capacity, or the necessity to better compete for adhesion to target cells

Transcriptional and phenotypic characterizations of dispersed bacteria from biofilm to Klebsiella pneumoniae

Le développement d’un biofilm est un processus complexe qui se décline en plusieurs étapes. L’adhésion initiale des bactéries au support est suivie de la formation de microcolonies, puis de la synthèse d’une matrice extracellulaire qui englobe les bactéries donnant lieu à un biofilm mature. La dernière étape, sans doute la moins bien décrite jusqu’à présent, consiste en la dispersion du biofilm. Ce phénomène, contrôlé génétiquement, est déclenché en réponse à de nombreux signaux physiques et chimiques, telles que la température, la disponibilité en nutriments ou l’accumulation de molécules signal (peptides autoinducteurs du quorum sensing, monoxyde d’azote...). Les bactéries sessiles synthétisent alors une panoplie d’effecteurs qui permettent à certaines cellules de quitter le biofilm pour coloniser de nouveaux environnements. Dans le cadre d’infections liées aux biofilms, ce processus de dispersion est un mécanisme clé permettant la libération dans l’organisme de bactéries à partir de biofilms souvent constitués sur des matériels médicaux invasifs. Cependant, la physiologie des cellules ainsi dispersées reste relativement méconnue mais doit probablement jouer un rôle majeur dans la colonisation ultérieure et l’infection chez l’hôte. L’objectif de ce travail était de caractériser au niveau transcriptionnel et phénotypique les cellules dispersées de biofilms formés par le pathogène opportuniste Klebsiella pneumoniae, et ceci comparativement aux formes planctoniques et sessiles. Une analyse transcriptionnelle a été réalisée à partir des formes planctoniques (exponentielles et stationnaires), sessiles et dispersées, en combinant un modèle expérimental de culture en flux (flow-cell) et un séquençage global des ARN (RNAseq). Les données obtenues ont indiqué que les bactéries dispersées affichaient un profil transcriptionnel unique et distinct des autres formes bactériennes. De plus, cette analyse transcriptionnelle des formes planctoniques, sessiles et dispersées de biofilm a permis de dresser une carte exhaustive du transcriptome de K. pneumoniae au cours des différentes phases de croissance et de dégager des gènes « signatures » de chacune d’elle. Le profil transcriptionnel unique des bactéries dispersées suggère qu’elles possèdent une physiologie spécifique leur permettant de coloniser efficacement de nouveaux environnements. L’analyse des propriétés des bactéries dispersées a ainsi constitué la deuxième partie du projet, en se focalisant sur les mécanismes clés dans la physiopathologie des infections nosocomiales à K. pneumoniae, à savoir les capacités d’adhésion, de colonisation et de virulence. Le profilage phénotypique a montré que les bactéries dispersées de biofilm colonisaient significativement mieux les surfaces biotiques et abiotiques que des bactéries planctoniques. Cette capacité de colonisation accrue ne s’expliquait ni par une meilleure adhésion initiale des bactéries, ni par une activité métabolique supérieure, mais par une capacité des bactéries dispersées à former très rapidement des microcolonies. À ceci s’ajoutait un pouvoir pathogène augmenté des bactéries dispersées comparativement à la forme planctonique, avec notamment une meilleure résistance à l’activité bactéricide des macrophages. La mise au point d’un modèle murin d’infection pulmonaire adapté a été initiée ; il permettra d’analyser la virulence de ces bactéries dispersées. L’ensemble des résultats indique que les bactéries dispersées de biofilm se placent dans un état unique du cycle de vie bactérien, en étant transcriptionnellement différentes des autres formes bactériennes, et avec des propriétés mixtes, se rapprochant à la fois de la forme planctonique (activité métabolique et taux de croissance élevée) et de la forme sessile (fort pouvoir de colonisation et meilleure résistance à la phagocytose). L’ensemble de ces propriétés confère certainement un rôle déterminant dans le déclenchement d’infections liées aux biofilms.Biofilm development is a complex process involving several steps. The bacterial adhesion to the surface is followed by formation of microcolonies and synthesis of extracellular matrix, which encased bacteria giving rise to mature biofilm. The last step, probably the most poorly described, corresponds to biofilm dispersal. This process is genetically controlled and triggered in response to a wide range of physical and chemical signals, such as temperature, nutrients availability or the accumulation of signal molecules (quorum sensing autoinducers, nitric oxide...). In response to these signals, sessile bacteria synthesize various effectors, which allow a subset of cells to leave the biofilm and colonize new environments. In the context of biofilm-related infections, the biofilm dispersal process is a key mechanism for the release of bacteria from biofilms formed on invasive medicals devices. Little is known about the properties of the resulting biofilm-dispersed bacteria, but they probably play a major role in the subsequent colonization and infection processes within the host. The objective of this work was to characterize the transcriptome and the phenotype of biofilm-dispersed bacteria of the opportunist pathogen Klebsiella pneumoniae comparatively to the planktonic and sessile forms. A transcriptional analysis was carried out using planktonic (both exponential and stationary forms), sessile and biofilm-dispersed bacteria by combining a flow-cell experimental model with global RNA sequencing (RNAseq). Results indicated that biofilm- dispersed bacteria displayed a unique transcriptional pattern in the bacterial lifecycle. Furthermore, analysis of the whole transcriptome of planktonic, sessile and biofilm-dispersed bacteria allowed to emphasize the transcriptional changes occurring in the course of K. pneumoniae lifestyle transitions and to select transcriptional signatures genes for the five bacterial physiological states. The unique transcriptional pattern of biofilm-dispersed bacteria suggests that they display specific physiological characteristics required to colonize new environments. The second part of this work consisted in analyzing the properties of biofilm-dispersed bacteria, by focusing on key mechanisms involved in the physiopathology of K. pneumoniae: adhesion, colonization and virulence. Phenotypic profiling showed that biofilm-dispersed bacteria colonized significantly more biotic and abiotic surfaces than their planktonic counterparts. This increased colonization capacity was not due to an enhanced adhesion or a higher metabolic activity but rather to the intrinsic capacity of the biofilm-dispersed bacteria to form rapidly microcolonies. Besides, biofilm-dispersed bacteria were more pathogenic than their planktonic counterparts showing a better resistance to the bactericidal activity of macrophages. The development of a murine pulmonary infection model is in progress and will enable to assess the virulence of biofilm-dispersed bacteria. Our results indicate that biofilm-dispersed bacteria are placed in a unique state in the bacterial lifecycle, being transcriptionally different from other bacterial forms, and with mixed properties, approaching both the planktonic form (elevated metabolic activity and growth rate) and the sessile form (strong colonization power and high resistance to phagocytosis). These properties certainly play a decisive role in the initiation of biofilm-related infections

Caractérisations transcriptionnelle et phénotypique de bactéries dispersées de biofilm à Klebsiella pneumoniae

Biofilm development is a complex process involving several steps. The bacterial adhesion to the surface is followed by formation of microcolonies and synthesis of extracellular matrix, which encased bacteria giving rise to mature biofilm. The last step, probably the most poorly described, corresponds to biofilm dispersal. This process is genetically controlled and triggered in response to a wide range of physical and chemical signals, such as temperature, nutrients availability or the accumulation of signal molecules (quorum sensing autoinducers, nitric oxide...). In response to these signals, sessile bacteria synthesize various effectors, which allow a subset of cells to leave the biofilm and colonize new environments. In the context of biofilm-related infections, the biofilm dispersal process is a key mechanism for the release of bacteria from biofilms formed on invasive medicals devices. Little is known about the properties of the resulting biofilm-dispersed bacteria, but they probably play a major role in the subsequent colonization and infection processes within the host. The objective of this work was to characterize the transcriptome and the phenotype of biofilm-dispersed bacteria of the opportunist pathogen Klebsiella pneumoniae comparatively to the planktonic and sessile forms. A transcriptional analysis was carried out using planktonic (both exponential and stationary forms), sessile and biofilm-dispersed bacteria by combining a flow-cell experimental model with global RNA sequencing (RNAseq). Results indicated that biofilm- dispersed bacteria displayed a unique transcriptional pattern in the bacterial lifecycle. Furthermore, analysis of the whole transcriptome of planktonic, sessile and biofilm-dispersed bacteria allowed to emphasize the transcriptional changes occurring in the course of K. pneumoniae lifestyle transitions and to select transcriptional signatures genes for the five bacterial physiological states. The unique transcriptional pattern of biofilm-dispersed bacteria suggests that they display specific physiological characteristics required to colonize new environments. The second part of this work consisted in analyzing the properties of biofilm-dispersed bacteria, by focusing on key mechanisms involved in the physiopathology of K. pneumoniae: adhesion, colonization and virulence. Phenotypic profiling showed that biofilm-dispersed bacteria colonized significantly more biotic and abiotic surfaces than their planktonic counterparts. This increased colonization capacity was not due to an enhanced adhesion or a higher metabolic activity but rather to the intrinsic capacity of the biofilm-dispersed bacteria to form rapidly microcolonies. Besides, biofilm-dispersed bacteria were more pathogenic than their planktonic counterparts showing a better resistance to the bactericidal activity of macrophages. The development of a murine pulmonary infection model is in progress and will enable to assess the virulence of biofilm-dispersed bacteria. Our results indicate that biofilm-dispersed bacteria are placed in a unique state in the bacterial lifecycle, being transcriptionally different from other bacterial forms, and with mixed properties, approaching both the planktonic form (elevated metabolic activity and growth rate) and the sessile form (strong colonization power and high resistance to phagocytosis). These properties certainly play a decisive role in the initiation of biofilm-related infections.Le développement d’un biofilm est un processus complexe qui se décline en plusieurs étapes. L’adhésion initiale des bactéries au support est suivie de la formation de microcolonies, puis de la synthèse d’une matrice extracellulaire qui englobe les bactéries donnant lieu à un biofilm mature. La dernière étape, sans doute la moins bien décrite jusqu’à présent, consiste en la dispersion du biofilm. Ce phénomène, contrôlé génétiquement, est déclenché en réponse à de nombreux signaux physiques et chimiques, telles que la température, la disponibilité en nutriments ou l’accumulation de molécules signal (peptides autoinducteurs du quorum sensing, monoxyde d’azote...). Les bactéries sessiles synthétisent alors une panoplie d’effecteurs qui permettent à certaines cellules de quitter le biofilm pour coloniser de nouveaux environnements. Dans le cadre d’infections liées aux biofilms, ce processus de dispersion est un mécanisme clé permettant la libération dans l’organisme de bactéries à partir de biofilms souvent constitués sur des matériels médicaux invasifs. Cependant, la physiologie des cellules ainsi dispersées reste relativement méconnue mais doit probablement jouer un rôle majeur dans la colonisation ultérieure et l’infection chez l’hôte. L’objectif de ce travail était de caractériser au niveau transcriptionnel et phénotypique les cellules dispersées de biofilms formés par le pathogène opportuniste Klebsiella pneumoniae, et ceci comparativement aux formes planctoniques et sessiles. Une analyse transcriptionnelle a été réalisée à partir des formes planctoniques (exponentielles et stationnaires), sessiles et dispersées, en combinant un modèle expérimental de culture en flux (flow-cell) et un séquençage global des ARN (RNAseq). Les données obtenues ont indiqué que les bactéries dispersées affichaient un profil transcriptionnel unique et distinct des autres formes bactériennes. De plus, cette analyse transcriptionnelle des formes planctoniques, sessiles et dispersées de biofilm a permis de dresser une carte exhaustive du transcriptome de K. pneumoniae au cours des différentes phases de croissance et de dégager des gènes « signatures » de chacune d’elle. Le profil transcriptionnel unique des bactéries dispersées suggère qu’elles possèdent une physiologie spécifique leur permettant de coloniser efficacement de nouveaux environnements. L’analyse des propriétés des bactéries dispersées a ainsi constitué la deuxième partie du projet, en se focalisant sur les mécanismes clés dans la physiopathologie des infections nosocomiales à K. pneumoniae, à savoir les capacités d’adhésion, de colonisation et de virulence. Le profilage phénotypique a montré que les bactéries dispersées de biofilm colonisaient significativement mieux les surfaces biotiques et abiotiques que des bactéries planctoniques. Cette capacité de colonisation accrue ne s’expliquait ni par une meilleure adhésion initiale des bactéries, ni par une activité métabolique supérieure, mais par une capacité des bactéries dispersées à former très rapidement des microcolonies. À ceci s’ajoutait un pouvoir pathogène augmenté des bactéries dispersées comparativement à la forme planctonique, avec notamment une meilleure résistance à l’activité bactéricide des macrophages. La mise au point d’un modèle murin d’infection pulmonaire adapté a été initiée ; il permettra d’analyser la virulence de ces bactéries dispersées. L’ensemble des résultats indique que les bactéries dispersées de biofilm se placent dans un état unique du cycle de vie bactérien, en étant transcriptionnellement différentes des autres formes bactériennes, et avec des propriétés mixtes, se rapprochant à la fois de la forme planctonique (activité métabolique et taux de croissance élevée) et de la forme sessile (fort pouvoir de colonisation et meilleure résistance à la phagocytose). L’ensemble de ces propriétés confère certainement un rôle déterminant dans le déclenchement d’infections liées aux biofilms

The AL626 antibody recognizes by western blot an ALFA-tagged protein produced in Dictyostelium discoideum

The AL626 antibody against the ALFA tag detects by western blot an ALFA-tagged protein produced in the amoeba Dictyostelium discoideum

RB513, RB514, RB515, RB516, RB517 and RB518 antibodies recognize putative lysosomal proteins from Dictyostelium discoideum by ELISA

The recombinant antibodies RB513, RB514, RB515, RB516, RB517 and RB518 detect by ELISA antigens in a purified mixture of Dictyostelium discoideum putative lysosomal proteins

The AJ520 antibody recognizes the Dictyostelium vacuolar H+-ATPase subunit A by Western blot

The AJ520 antibody, derived from the 221-35-2 hybridoma, detects by Western blot the full-length vacuolar H+-ATPase subunit A from Dictyostelium discoideum

Biofilm dispersal: multiple elaborate strategies for dissemination of bacteria with unique properties

International audienc

The AJ514 antibody recognizes the common antigen 1 from Dictyostelium discoideum by Western blot

The AJ514 antibody, derived from the 221-342-5 hybridoma, detects by Western blot the common antigen 1 from Dictyostelium discoideum