Analysis of Hox10 specific peptide motifs in their patterning functions of the axial skeleton

Tese de mestrado, Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento), 2009, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasHox genes play a fundamental role in anterior-posterior patterning and are remarkably conserved throughout evolution (Slack et al., 1993). Their products are transcription factors that regulate a specific set of genes with essential functions in development. Although different Hox genes show a notable functional specificity in vivo, they demonstrate a surprisingly low DNA-binding specificity in vitro. Sequence analysis can provide a way to understand how Hox genes achieve their biological specificity (Prince, 2002). Genetic experiments revealed that Hox genes are involved in global patterning processes in the axial skeleton to produce the axial formulae. Hox group 10 genes, in particular, have been shown to repress thoracic rib formation, since their overexpression in the presomitic mesoderm causes a ribless phenotype and their global inactivation resulted in extra ribs (Wellik et al., 2003, Carapuço et al., 2005). Two peptide domains were identified in Hox10 proteins which are conserved among all the Hox 10 members and are absent from all other Hox proteins. One of these is an octapeptide located just N-terminal to the homeodomain. The purpose of this work is to understand the role of this octapeptide in Hox10 protein function. This is being approached by the genesis and functional analysis of transgenic mice expressing mutant Hoxa10 proteins that contain specific deletions or amino acid changes in this domain. In previous transgenic assays, the overexpression of Hoxb9 gene in the presomitic mesoderm did not produce an abnormal axial skeleton phenotype. For this reason, this gene was used to generate chimeric contructs with the Hoxa10 gene. The results obtained show that the removal of the octapeptide is sufficient to block the rib-repressing activity of Hoxa10 when expressed in the presomitic mesoderm. In addition, introduction of this peptide motif, as well as the whole Hoxa10 sequence N-terminal to it, into the Hoxb9 protein produced a partial ribless phenotype. These results indicate that the octapeptide is necessary for the rib-repressing activity of Hoxa10 but it does not seem to be sufficient for this function, at least individuallyResumo alargado em português disponível no document

Análise das capturas de concursos de pesca desportiva na Costa Algarve

Dissertação de mest., Biologia Marinha (Ecologia e Conservação Marinha), Faculdade de Ciências do Mar e do Ambiente, Universidade do Algarve, 2007O presente trabalho teve como objectivo o estudo da abundância, biomassa e diversidade das capturas de concursos de pesca desportiva na Costa Algarvia, nomeadamente, através de uma monitorização, que decorreu entre 24 de Fevereiro e 16 de Junho de 2007, em 4 praias Algarvias, e pela análise dos registos destes concursos realizados em 21 locais, entre 1995-2007. Durante a sub-amostragem dos campeonatos, foram realizados inquéritos aos participantes, e identificados, pesados e medidos, cada um dos exemplares pertencentes às capturas de alguns participantes. Identificaram-se 13 taxa pertencentes a 8 famílias, sendo os taxa principais Belone belone, Mugilidae e Scomber spp. Amostraram-se 564 exemplares, correspondendo a biomassa total a 79.75 Kg, com uma captura média por pescador de 0.6 Kg (± 0.5), encontrando-se este valor bem distante do limite máximo de captura diária legal, pelo que demonstra a ineficácia desta medida, dado não estar a limitar as capturas. A análise de similaridades demonstrou haver uma semelhança significativa entre os índices CPUEn e CPUEp médio dos taxa capturados na praia da Lota – Manta Rota, para os campeonatos da FPPD, demonstrando uma certa especialização quanto às espécies capturadas pelos mesmos e/ou uma composição específica desta praia diferente. A análise de variância demonstrou haver uma diferença muito significativa (p <0,0001) entre o CPUEn e CPUEp médio entre Provas da Associação Regional de Pesca Desportiva do Algarve (ARPDA) e Federação Portuguesa de Pesca Desportiva (FPPD) (AF), e as Provas privadas de Clubes (PP). Cada um dos campeonatos AF e PP, apresentaram também diferenças muito significativas (p <0,0001) entre praias e entre anos a nível do CPUEn e do CPUEp médio. Observaram-se diferenças entre o L50 das espécies capturadas e o seu respectivo TML e TMP, salientando-se Dicentrarchus labrax, com quase todos os seus exemplares abaixo do seu respectivo L50, e constituindo a maioria das rejeições, para a praia da Rocha Baixinha no mês de Março. Foram propostas algumas medidas para uma melhor gestão e protecção dos recursos explorados

Development of polysaccharide-based carriers for pulmonary tuberculosis therapy

A tuberculose é uma doença infeciosa provocada pelo Mycobacterium tuberculosis. A transmissão da bactéria ocorre por via inalatória, após o que a mesma se aloja nos macrófagos existentes na região alveolar. A bactéria tem a capacidade de sobreviver e multiplicar-se mesmo depois de fagocitada pelos macrófagos alveolares, podendo ficar em estado latente por vários meses e até anos. Apesar de existir uma vacina contra a doença, a denominada BCG, de Bacillus Calmette-Guérin, esta não é totalmente eficaz e muitas pessoas desenvolvem a doença apesar de imunizadas. A tuberculose continua a ser a principal causa de morte evitável a nível mundial e está a reaparecer na Europa, estando muito associada aos casos de co-morbilidade com o vírus da imunodeficiência humana (VIH). Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), a terapia da tuberculose é obrigatoriamente combinada, para potenciar a eficácia do tratamento. Neste contexto, a isoniazida (INH) e a rifabutina (RFB) são dois dos fármacos de primeira linha utilizados, a última usada particularmente nos casos em que o doente apresenta também infeção por VIH. Estas moléculas apresentam características diferentes, nomeadamente em termos de massa molecular e afinidade aquosa. A INH é uma molécula hidrofílica com 137 g/mol, enquanto a RFB tem 847 g/mol e é hidrofóbica, exigindo solventes orgânicos ou soluções ácidas para dissolver. Considerando a tuberculose pulmonar como a principal manifestação da doença, a administração direta de antibióticos ao pulmão e, particularmente, aos alvéolos, onde residem os macrófagos que atuam como hospedeiros da bactéria, compreende uma abordagem muito promissora, permitindo a entrega de fármacos no local primário da infeção. Esta estratégia implica o desenvolvimento de formulações para inalação, requerendo o uso de transportadores de fármacos que exibam propriedades aerodinâmicas adequadas para alcançar a região alveolar, onde residem os macrófagos que podem, assim, internalizar os fármacos. A literatura mostra que, para alcançar esta zona do pulmão, os transportadores devem ter um diâmetro aerodinâmico entre 1 e 5 μm. Na realidade, devido à geometria dos pulmões, as partículas a utilizar como transportadores precisam de ter um tamanho suficientemente pequeno para entrar nas vias aéreas inferiores, mas a sua massa deve ser suficiente para impedir que sejam exaladas juntamente com o ar expirado, o que justifica o intervalo de diâmetros referido anteriormente e a frequente utilização de micropartículas para inalação. A opção pela utilização de transportadores como veículos dos fármacos requer também que a matriz constituinte das partículas seja o mais inerte possível, não induzindo toxicidade ou reações de inflamação. Neste sentido, os materiais de origem natural e, particularmente, os polímeros como os polissacáridos, são reportados como tendo maior probabilidade de exibir biocompatibilidade e biodegradabilidade, duas características essenciais para uma aplicação na área da administração de fármacos. Considerando que o agente patogénico se aloja nos macrófagos alveolares, os fármacos devem alcançar este compartimento intracelular antes de ocorrer a sua libertação a partir do transportador inalado, o que ficará facilitado pela internalização dos próprios transportadores pelas células. Para melhorar este processo de internalização, alguns trabalhos reportam a funcionalização da superfície das partículas com ligandos que são reconhecidos pelos recetores dos macrófagos. Alguns polímeros naturais apresentam uma importante vantagem a esse respeito, sendo compostos por unidades estruturais que são reconhecidas diretamente por vários recetores dos macrófagos. O sulfato de condroitina (ChS) e a k-carragenina (CRG) são dois exemplos desses polímeros naturais. O primeiro é composto por unidades alternadas de N-acetilgalactosamina e ácido glucurónico, enquanto o último contém resíduos de galactose-4-sulfato e galactose anidra. Ambos estão reportados como sendo reconhecidos especificamente pelos macrófagos, bem como por proporcionarem a ativação destas células. Neste trabalho, foram produzidas micropartículas por um processo de atomização, as quais contêm os fármacos modelo (INH e RFB) de forma combinada, respeitando assim as indicações da Organização Mundial da Saúde. Os fármacos foram sempre associados às micropartículas numa razão de massa polímero/INH/RFB de 10/1/0.5. À formulação produzida com CRG, adicionou-se um outro polímero de matriz de forma a mitigar o potencial inflamatório que tem sido reportado para a CRG na literatura. As micropartículas foram, neste caso, preparadas com uma relação de massa de amido/CRG de 8/2. Esta formulação obteve um rendimento de produção de 70% e associou efetivamente 96% da INH e 74% da RFB. Ao analisar o diâmetro aerodinâmico foi verificado que este variou entre 3.3 μm e 3.9 μm e obteve-se uma percentagem de partículas finas de 32% - 38%. Estes valores seriam satisfatórios não fosse a deposição de aproximadamente 50% das partículas na zona correspondente à garganta. Por esse motivo, identificou-se a necessidade de aperfeiçoamento desta formulação para utilização futura. Por outro lado, para as micropartículas compostas por ChS como material de matriz, foram testados dois solventes (etanol e ácido clorídrico) para solubilização da RFB, avaliando-se qual dos dois conduz à obtenção de partículas com melhores características. Ambas as formulações evidenciaram micropartículas de forma esférica, com uma superfície tendencialmente mais rugosa após a associação dos fármacos. Os rendimentos de produção foram bastante satisfatórios, na ordem dos 80%, e os fármacos foram associados com eficácia de 95% para INH e 59-69% para RFB. Apesar de ambas as formulações apresentarem diâmetros aerodinâmicos semelhantes (3.8 – 4.0 μm), as micropartículas produzidas com etanol demonstraram melhores resultados, registando uma maior percentagem de partículas finas (43% contra 35% nas micropartículas preparadas com HCl), o que reflete melhor capacidade para alcançar a região respiratória e uma maior dose de fármaco contida na fração de partículas finas que alcançarão a zona alveolar. Acresce que esta formulação permitiu ainda maior controlo sobre a libertação dos fármacos associados, nomeadamente da RFB. Desta forma, a formulação de micropartículas em que o etanol foi utilizado como solvente, foi selecionada para prosseguir os ensaios de biocompatibilidade em células. Na formulação de micropartículas com matriz à base de amido/CRG não foi possível testar a utilização de etanol, uma vez que o protocolo de preparação implica o recurso a um banho de água quente durante o processo de atomização, o qual levaria à evaporação do solvente. Assim se justifica que essas micropartículas tenham sido produzidas unicamente com ácido clorídrico como co-solvente. A atividade inibitória dos fármacos modelo contra a M. bovis BCG foi mantida após o processo de microencapsulação por atomização em todas as formulações, independentemente dos materiais de matriz e dos solventes utilizados, o que indica a adequação do método de produção das micropartículas. Por forma a avaliar o perfil de citotoxicidade das micropartículas desenvolvidas, foram realizados ensaios em diferentes linhas celulares humanas, variando concentrações e tempos de exposição (até 24 h). As micropartículas foram testadas em células epiteliais alveolares (A549) e em macrófagos derivados de monócitos (dTHP-1), ambos de grande relevância no contexto da tuberculose pulmonar. Verificou-se que as micropartículas compostas por amido/CRG podem apresentar algumas limitações, com algum nível de toxicidade indesejável, ao contrário das micropartículas com matriz de ChS, que mantiveram os níveis de viabilidade celular acima de 70% em todas as condições testadas. Os macrófagos derivados de monócitos foram ainda utilizados para testar quer a capacidade das células para capturar as micropartículas, quer a capacidade das últimas para induzir a ativação dos macrófagos. O ensaio de captura macrofágica demonstrou que, em comparação, as micropartículas de ChS conseguem um maior nível de internalização para um tempo de exposição e uma dose semelhante. Por outro lado, a produção de interleucinas (TNF-α e IL-8) pelas células foi mais pronunciada após contacto com as micropartículas de amido/CRG, indicando uma maior apetência destas para ativar os macrófagos mesmo a concentrações mais baixas. Considerando os bons resultados obtidos com as micropartículas com matriz de ChS, a avaliação do seu perfil toxicológico foi aprofundada por meio da realização de um estudo multiparamétrico, o qual recorreu à utilização de macrófagos de ratinho (células J774A.1). O estudo envolveu a incubação das células com concentrações não tóxicas dos materiais, realizando-se posteriormente, por microscopia de fluorescência, uma análise de conteúdos específicos que indicam a resposta celular. Os parâmeros analisados foram a atividade mitocondrial, a área da célula, a área do núcleo, a permeabilidade da membrana, o conteúdo de fosfolípidos (fosfolipidose) e o conteúdo de lípidos neutros (esteatose). Após incubação com as micropartículas de ChS (produzidas com etanol), não foi verificada nenhuma alteração nos parâmetros estudados. Apenas para a RFB na forma livre se verificou uma alteração da quantidade de fosfolípidos existentes quando comparado com o controlo de células não expostas. Contudo, estas alterações apenas se verificaram em concentrações de fármaco muito mais elevadas do que as presentes nas micropartículas, pelo que se acredita que a níveis terapêuticos não ocorrerão as alterações verificadas, o que foi sugerido também quando se testaram as micropartículas com fármaco. Foi realizado também um estudo preliminar in vivo em ratinhos BALB/c, no qual os animais foram expostos a micropartículas sem fármaco. Devido ao facto dos materiais de matriz utilizados neste trabalho, o sulfato de condroitina e o amido/CRG, não terem utilização reportada para via inalatória, considerou-se relevante fazer uma análise preliminar da resposta dos animais ao contacto com os mesmos. Foram testadas as micropartículas quer de ChS, quer de amido/CRG, as quais foram administradas aos ratinhos por inalação, num total de dez aplicações num intervalo temporal de duas semanas. Após o sacrifício dos animais foi avaliado o índice tecidular de diferentes órgãos, nomeadamente fígado, pulmão e rim, e realizada a análise de esfregaços sanguíneos, de modo a verificar o tipo de leucócitos presentes. Não foram observadas alterações do índice tecidular de nenhum dos órgãos analisados, nem se registaram modificações das percentagens dos vários leucócitos constituintes do sangue, para nenhuma das formulações de micropartículas. Os níveis séricos de ALT, AST e LDH, marcadores de alterações tecidulares, também não demonstraram alterações significativas, o que indica a tolerância dos animais ao contacto com as micropartículas e os seus materiais constituintes. As formulações desenvolvidas ao longo deste trabalho demonstraram possuir características adequadas para a entrega de fármacos por via inalatória, com o propósito de alcançar a região alveolar e proporcionar um direcionamento para os macrófagos. No geral, a formulação com matriz de sulfato de condroitina (ChS/INH/RFB), produzida utilizando etanol como co-solvente, foi a que demonstrou melhores propriedades, sendo aquela identificada como tendo mais potencial.Tuberculosis remains a leading cause of death, with therapeutic failure being mainly due to non-compliance with prolonged treatments, often associated with severe side-effects. New therapeutic strategies are demanded and, considering that the lung is the primary site of infection, direct lung delivery of antibiotics is an interesting and, possibly, effective approach. Therapeutic success in this context depends on suitable carriers that reach the alveoli where Mycobacterium hosts (macrophages) reside, as well as on their ability to promote macrophage capture and intracellular accumulation of drugs. In this work, we propose inhalable polymeric microparticles produced by spray-drying and tailored to suitable aerodynamic properties to reach the alveoli. Macrophage targeting will be driven by microparticle composition based on chondroitin sulphate or k-carrageenan. Both are sulphated polymers composed by moieties preferentially recognised by macrophage surface receptors. The spray-dried microparticles successfully associated two first-line antitubercular drugs (isoniazid and rifabutin). Furthermore, starch/CRG and ChS microparticles presented satisfactory aerodynamic properties, compatible with deep lung deposition. In ChS microparticles, ethanol and HCl were tested as co-solvents to aid the solubilisation of RFB and microparticles produced with ethanol general revealed the best features, being selected for further assessment. ChS-based formulations evidenced absence of toxicity in alveolar epithelial cells and macrophages (human and mouse). Starch/CRG formulation exhibited some toxicity, especially in mouse macrophages. The latter further elicited stronger production of interleukins from human macrophages, compared with the mild response to ChS microparticles, which reflects the ability to activate macrophages. ChS microparticles also evidenced better ability to undergo macrophage uptake and were, thus, further evaluated in a high content analysis (HCA) assay evaluating the response of mouse macrophages to exposure (lipid accumulation, nuclei area, etc.). The results revealed no subtoxic effects after 48 h exposure. Free RFB demonstrated some phospholipid accumulation, which was overpassed upon microencapsulation. Considering the general trend of the results, good indications are given that encourage the continuation of the studies in order to establish the potential of these microparticles as inhalable carriers in tuberculosis treatment

Contribution to unveiling the roles played by small non-coding RNAs in the biology and pathogenesis of Burkholderia cepacia complex bacteria

Tese de mestrado, Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2017The development of high-throughput sequencing techniques and continued decrease of associated costs, together with advances in bioinformatics and increasing availability of powerful software for nucleotide and amino acid sequence analyses contributed to the exponential increase of available microbial genomes. These developments have unveiled several novel sequences presenting a size within the range of 50-500 nucleotides (nt) and encoding the now called small non-coding regulatory RNAs (sRNAs). These sRNAs are frequently encoded in intergenic regions, often partially overlapping with the 5’ or 3’ untranslated regions of the vicinal genes or annotated-opening reading frames (ORFs). The current known function for some sRNAs comprises the gene expression regulation through interference RNA mechanisms, mainly at the posttranscriptional level. Bacterial sRNAs may regulate their targets (messenger RNAs) through positive or negative regulation mechanisms. To carry out a negative regulation, the sRNA base pairs with its target in the region containing the initiation codon and/or the ribosome-binding site (RBS), precluding the ribosome binding and consequently preventing the mRNA translation. The Burkholderia cepacia (Bcc) complex comprises nowadays 20 validated and phylogenetically-related species of Gram-negative bacteria. These bacteria are phenotypically similar and genotypically distinct, being widely distributed in different ecological niches such as soil, water, plants, animals and in humans. Some Bcc bacteria have potential application as bioremediation and biocontrol/biopesticides agents due to their unusual metabolic abilities, which include xenobiotics metabolism, production of antifungal compounds and promotion of plant growth. However, Burkholderia species have emerged in 1980s as important opportunistic pathogens, especially to cystic fibrosis (CF) patients. Bcc bacteria have gained the attention of medical and scientific community because they can cause in CF patients a rapid evolving clinical state known as the cepacia syndrome, which can cause a fast and necrotizing pneumonia, septicemia and ultimately results in the patient early death. Bcc bacteria produce a wide variety of virulence factors, possessing intrinsic resistance mechanisms to different antibiotics which lead to a difficult eradication. Over the last years, some Bcc species have also been recognized as emerging nosocomial pathogenic agents in hospitalized non-CF patients, particularly in cancer patients. To identify potential genes involved in the Bcc bacteria virulence, researchers from iBB (Instituto de Bioengenharia e Biociências) prepared mutant libraries derived from B. contaminans IST408 and B. cenocepacia J2315 by random plasposon mutagenesis. This work aims to characterize a mutant derived from B. cenocepacia J2315, identified in an attenuated virulence screening using as model of infection the nematode Caenorhabditis elegans. This mutant, B. cenocepacia SJ2, contains the plasposon inserted in the intergenic region of B. cenocepacia J2315 chromosome 1, located between the coding gene of DNA gyrase subunit A (GyrA) enzyme and the coding gene of an outer membrane protein of the OmpA family. Bioinformatic and Southern blot analyses allowed the identification of the plasposon insertion in the mutant B. cenocepacia SJ2. The plasposon is located 8 nucleotides (nt) after the predicted 5’ UTR beginning of the B. cenocepacia J2315 OmpA-like protein. Therefore, the presence and functionality of the transcript ompA were evaluated by RT-PCR and Western blot, respectively. The results obtained indicated that the plasposon insertion did not affect ompA mRNA transcription or functionality. Bioinformatic analyses also led to the identification of a possible opening reading frame (ORF) in the complementary strand (named ORF3) and encoding a 93 amino acids protein. The presence of this ORF was supported by Northern blot assays previously performed. These assays allowed the identification of a transcript from the complementary strand. However, the amplification of complementary DNA ends (5’ and 3’ RACE) using specific primers for ORF3 region demonstrated that the transcript in study has a 5’ end with a lower size than the expected transcript of the potential protein (ORF3). A transcript containing approximately 179 base pairs and non-interrupted by the plasposon was identified. In the presence of these results, primers for the potential DNA sequence of ORF3 were designed and the results showed that this is the region interrupted by the plasposon. Due to the absence of initiation and termination codons in the region closer to the 179 base pairs transcript, it was hypothesized that the transcript corresponds to a sRNA (MavA). In this work, the presence of two genetic elements, a sRNA and a protein, in the intergenic region of B. cenocepacia J2315 chromosome 1 is described. The coding sequences of both the sRNA and protein are overlapped in, at least, 100 nucleotides. Bioinformatic analysis of the genetic elements showed that they are conserved among the Burkholderia genus. Moreover, the sequence of ORF3 protein also showed to be identical to the sequence of one protein encoded by an annotated ORF in the B. multivorans genome and to five proteins of B. pseudomallei. The assays performed with the strain containing the ORF3 interrupted by the plasposon revealed the involvement of this protein in the resistance of B. cenocepacia J2315 strain to heat-shock stress (50 ºC), susceptibility to the detergent sodium dodecyl sulphate (SDS), biofilms formation, cellular hydrophobicity and antibiotics resistance (imipenem, ceftazidime and tetracycline). In general, these results suggest that this protein is likely involved in the maintenance of the outer membrane integrity and virulence of B. cenocepacia J2315 towards the nematode C. elegans. MavA sRNA identified in the work herein presented was predicted to be a functional homologue of IstR-2 sRNA of Escherichia coli K-12 MG1655. Preliminary results of the MavA sRNA overexpression characterization indicate a possible direct or indirect role in the overexpression of ribosomal protein S12. Phenotypic analysis also showed the involvement in the swimming motility of B. cenocepacia J2315 strain and in resistance to thermal (50 ºC) stress. In addition, this sRNA is not involved in the virulence of B. cenocepacia J2315 towards the C. elegans nematode. Overall, the results presented in this study contribute to a better knowledge of the intergenic region under study and to the identification of a putative ORF and a sRNA, contributing to a better understanding of the biology of Bcc bacteria and the role of sRNAs in the regulation of the expression of putative virulence factors. The identification of MavA sRNA and ORF3 protein highlight the importance of these studies in identifying genetic elements that might be exploited as targets for the development of effective treatments to the B. cenocepacia J2315 strain infections.O recente desenvolvimento de técnicas de elevado rendimento para sequenciar genomas e a diminuição contínua do custo associado, conjuntamente com os avanços na bioinformática e a disponibilidade de número crescente de ferramentas bioinformáticas para análise de sequências nucleotídicas e aminoacídicas, tornou possível o aumento exponencial dos genomas microbianos disponíveis. Consequentemente, têm vindo a ser descobertos diversos pequenos transcritos com ação regulatória denominados de pequenos RNAs reguladores não codificantes (sRNAs), com tamanhos compreendidos entre 50-500 nucleótidos. Estes sRNAs têm sido identificados essencialmente em regiões intergénicas, junto a genes ou grelhas de leitura (ORFs) anotadas. A função conhecida de um grupo importante desses sRNAs consiste na regulação da expressão génica, principalmente ao nível pós-transcricional, por mecanismos de interferência de RNA. Os sRNAs bacterianos podem exercer nos seus alvos (RNAs mensageiros) uma regulação positiva ou negativa. No caso de ser exercida uma regulação negativa o sRNA estabelece com o seu alvo um emparelhamento na região que contém o codão de iniciação e/ou a região de ligação do ribossoma (RBS), tornando este local inacessível para a ligação do ribossoma e impedindo, assim, a tradução do mRNA. O complexo Burkholderia cepacia (Bcc) é atualmente constituído por 20 espécies de bactérias Gram-negativas validadas e filogeneticamente próximas. As bactérias que compõem este grupo são fenotipicamente semelhantes e genotipicamente distintas, podendo ser isoladas de várias fontes. São exemplo de fontes o solo, a água, a rizosfera de plantas, animais e Humanos. Devido às suas capacidades metabólicas invulgares, algumas estirpes do Bcc apresentam um elevado potencial de aplicação ao nível do biocontrolo, biorremediação e agricultura, pois são capazes de metabolizar xenobióticos, produzir compostos com atividade antifúngica e promover o crescimento de plantas. Contudo, na década de 80 as bactérias incluídas no género Burkholderia, incluindo as englobadas no complexo Bcc, emergiram como agentes patogénicos oportunistas em indivíduos com fibrose quística (FQ). O facto de as bactérias deste complexo produzirem vários fatores de virulência, apresentarem mecanismos de resistência a um largo espetro de antibióticos sendo difíceis de erradicar e de causarem em doentes com FQ infeções por vezes acompanhadas por um estado clínico de evolução rápida que inclui pneumonia necrotizante e septicémia, levando à morte do doente – síndrome cepacia -, faz com que tenham merecido uma elevada atenção da comunidade médica e científica. Acresce que algumas espécies do Bcc têm vindo a ser reconhecidas nos últimos anos como sendo agentes patogénicos nosocomiais emergentes em doentes hospitalizados, principalmente em doentes oncológicos. Com o objetivo de identificar possíveis genes envolvidos na virulência de bactérias do Bcc, investigadores do iBB (Instituto de Bioengenharia e Biociências) construíram bibliotecas de mutantes de B. contaminans IST408 e B. cenocepacia J2315 utilizando plasposões. As bibliotecas de mutantes foram rastreadas tendo como objetivo a identificação de mutantes que exibiam virulência atenuada, utilizando como modelo de infeção o nemátodo Caenorhabditis elegans. O trabalho aqui apresentado teve como objetivo a caracterização de um mutante identificado no rastreio acima mencionado, contendo um plasposão inserido na região intergénica do cromossoma 1 de B. cenocepacia J2315, localizada entre o gene codificante da subunidade A da enzima ADN girase (GyrA) e o gene codificante de uma proteína da membrana externa do tipo A (OmpA). Através de análises bioinformáticas e experimentais, foi possível localizar no mutante B. cenocepacia SJ2 a inserção do plasposão 8 nucleótidos (nt) após o início da região 5’ não traduzida (5’ UTR) do gene que codifica a proteína do tipo OmpA. Neste sentido, foram avaliados a presença e a funcionalidade do transcrito ompA por ensaios de RT-PCR e Western blot, respetivamente. Os resultados obtidos confirmaram que a inserção do plasposão não afetou a transcrição nem a funcionalidade do transcrito correspondente ao gene ompA. As análises bioinformáticas realizadas permitiram ainda a identificação de uma possível grelha de leitura aberta (ORF) na cadeia complementar da região intergénica (designada de ORF3), codificando para uma proteína de aproximadamente 93 aminoácidos. A confirmação da presença desta ORF foi suportada por ensaios de Northern blot realizados anteriormente e que permitiram a identificação de um transcrito a partir da cadeia complementar. No entanto, análises de amplificação em cadeia pela polimerase (PCR) das extremidades do ADN complementar (5’ e 3’ RACE) com sequências oligonucleotídicas iniciadoras específicas para a região da ORF3 demonstraram que o transcrito em causa possui uma extremidade 5’ menor que o esperado para o transcrito da possível proteína (ORF3), permitindo assim a identificação de um transcrito com cerca de 179 pares de bases que se verificou não ser interrompido pelo plasposão. Deste modo, tendo em conta os resultados aqui apresentados foram desenhadas sequências oligonucleotídicas iniciadoras específicas para a sequência de ADN da possível ORF3, tendo-se verificado que esta era a região interrompida pelo plasposão. Devido à ausência de codões de iniciação e de terminação na região próxima do transcrito de 179 pares de base, colocou-se a hipótese deste transcrito corresponder a outro elemento genético, nomeadamente um sRNA, que se denominou de MavA. Neste trabalho é descrita a existência de dois elementos genéticos na região intergénica do cromossoma 1 de B. cenocepacia J2315, um sRNA e um gene que codifica uma proteína, sendo que as sequências codificantes de ambos encontram-se parcialmente sobrepostas em, pelo menos, 100 nucleótidos. As análises bioinformáticas realizadas dos elementos genéticos permitiram a sua identificação como sendo ambos conservados no género Burkholderia. Além disso, demonstraram também que a proteína ORF3 é idêntica à sequência de uma proteína codificada por uma ORF anotada no genoma de B. multivorans e à de cinco proteínas de B. pseudomallei. Ensaios realizados com a estirpe contendo o plasposão a interromper a ORF3 demonstraram que esta proteína está envolvida na resistência da estirpe B. cenocepacia J2315 a choque térmico (50 ºC), suscetibilidade à presença do detergente dodecil sulfato de sódio (SDS), capacidade para formação de biofilmes e hidrofobicidade das células, bem como na resistência a antibióticos (imipeneme, ceftazidima e tetraciclina). De um modo geral, estes resultados apontam para que esta proteína esteja envolvida na manutenção da integridade da membrana externa e virulência da estirpe B. cenocepacia J2315 para o nemátodo C. elegans. O sRNA MavA identificado neste trabalho foi bioinformaticamente previsto como tendo como seu homólogo funcional o sRNA IstR-2 de Escherichia coli K-12 MG1655. Os resultados preliminares da caracterização do sRNA MavA através da sua sobrexpressão demonstram um possível envolvimento direto ou indireto na sobrexpressão da proteína ribossomal S12. As análises fenotípicas mostraram ainda o seu envolvimento na mobilidade da estirpe B. cenocepacia J2315 por swimming e na resistência ao choque térmico (50 ºC). Os resultados obtidos, baseados em ensaios de morte lenta do nemátodo C. elegans sugerem que este sRNA não está envolvido na virulência de B. cenocepacia J2315 neste modelo animal de infeção. Os resultados obtidos no presente trabalho contribuem para um conhecimento mais aprofundado da região intergénica estudada, tendo permitido identificar 2 elementos genéticos parcialmente sobrepostos que codificam uma proteína e um sRNA. Este trabalho constitui assim um contributo para o melhor conhecimento da biologia das bactérias do complexo Bcc e do papel dos sRNAs na regulação da expressão de fatores de virulência. A identificação do sRNA MavA e da proteína ORF3 realça a importância deste tipo de estudos na identificação de elementos genéticos que possam ser explorados como alvos para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficazes com vista ao tratamento das infeções causadas pela estirpe B. cenocepacia J2315

A stochastic approach to standardized precipitation index class transitions

Floods and droughts are natural phenomena of difficult prevision. Awareness, mitigation and water resource management, depend upon timely information on the beginning of a dry or wet period and on their extension in time and space. This study predicts SPI steady state class probabilities in the Douro region, Portugal, through an empirical and Markov chain approach, expected residence time in each class of severity; expected first passage time, recurrence time and class prediction in a short-term basis. It was verified that all these variables are useful for water resources management. Cheias e secas são fenómenos naturais de difícil previsão. O conhecimento, mitigação e gestão dos recursos hídricos depende de informação sobre o início dos períodos secos ou húmidos e a sua extensão no tempo e no espaço. Este estudo prevê as probabilidades das classes do índice SPI, na região do Douro, Portugal, através das séries de Markov e de um método empírico, tempo de residência esperada em cada classe, tempo médio de transição entre classes pela primeira vez, tempo de recorrência e previsão de classes a curto prazo. Verificou-se que todas as variáveis são convenientes para a gestão dos recursos hídricos

A stochastic approach to standardized precipitation index class transitions

Floods and droughts are natural phenomena of difficult prevision. Awareness, mitigation and water resource management, depend upon timely information on the beginning of a dry or wet period and on their extension in time and space. This study predicts SPI steady state class probabilities in the Douro region, Portugal, through an empirical and Markov chain approach, expected residence time in each class of severity; expected first passage time, recurrence time and class prediction in a short-term basis. It was verified that all these variables are useful for water resources management. Cheias e secas são fenómenos naturais de difícil previsão. O conhecimento, mitigação e gestão dos recursos hídricos depende de informação sobre o início dos períodos secos ou húmidos e a sua extensão no tempo e no espaço. Este estudo prevê as probabilidades das classes do índice SPI, na região do Douro, Portugal, através das séries de Markov e de um método empírico, tempo de residência esperada em cada classe, tempo médio de transição entre classes pela primeira vez, tempo de recorrência e previsão de classes a curto prazo. Verificou-se que todas as variáveis são convenientes para a gestão dos recursos hídricos

Processo de mudança na terapia para as fobias de afetos na perspetiva do cliente: um estudo qualitativo

A pertinência do estudo da perspetiva do cliente é cada vez mais reconhecida como um meio de compreensão do modo como a psicoterapia funciona e de validação dos modelos terapêuticos. A mudança através do Modelo para o Tratamento das Fobias de Afetos (MTFA) ocorre quando os clientes aprendem a reconhecer e a comunicar as suas emoções – fator fundamental para que haja saúde mental. Contudo, as pesquisas sobre os mecanismos envolvidos no processo de mudança desta terapia são ainda muito escassas. Nesse sentido, pretendemos identificar qual a perspetiva dos clientes acerca do seu processo de mudança pelo MTFA. Para o efeito, foram realizadas entrevistas semiestruturadas a oito clientes que concluíram um processo terapêutico. A análise das entrevistas foi realizada através de uma abordagem qualitativa, com base na Análise Temática, recorrendo ao software nVivo. Foram identificados dois temas, 10 categorias e 14 subcategorias. De forma geral, observa-se que os participantes atribuem a sua mudança a ganhos ao nível da compreensão, expressão e equilíbrio das suas emoções. Ao longo do processo, são referidos aspetos importantes como a proximidade terapêutica e experiência de libertação emocional. Os resultados são consistentes com os estudos qualitativos anteriores e com os estudos sobre o MTFA. As principais descobertas são discutidas com base na literatura atual sobre o processo de mudança em psicoterapia de acordo com a perspetiva dos clientes.The relevance of studying the client's perspective is increasingly recognized as a mean of comprehending how psychotherapy works and how it validates therapeutic models. Change through the Model for the Treatment of Affect Phobia (APT) occurs when clients learn to recognize and communicate their emotions – a fundamental factor for a good mental health. However, research on the mechanisms involved in the change process of this therapy is still very scarce. To clarify this, we intend to identify the client's perspective on their process of change by the APT. For this purpose, semi-structured interviews were carried out with eight clients, who had completed the therapeutic process. The analysis of the interviews was carried out through a qualitative approach, based on Thematic Analysis, using the nVivo software. Two themes, 10 categories and 14 subcategories were identified. In general, is observed that the participants attribute their process of change to gains in comprehension, expression, and balance of their emotions. Throughout the process important aspects were mentioned, such as therapeutic proximity and the experience of emotional release. The results are consistent with previous qualitative studies, and studies on the APT. The main results are discussed based on the current literature on the process of change in psychotherapy through the perspective of clients

Indoor air quality in healthcare units - a systematic literature review focusing recent research

The adequate assessment and management of indoor air quality in healthcare facilities is of utmost importance for patient safety and occupational health purposes. This study aims to identify the recent trends of research on the topic through a systematic literature review following the preferred reporting items for systematic reviews and meta-analyses (PRISMA) methodology. A total of 171 articles published in the period 2015–2020 were selected and analyzed. Results show that there is a worldwide growing research interest in this subject, dispersed in a wide variety of scientific journals. A textometric analysis using the IRaMuTeQ software revealed four clusters of topics in the sampled articles: physicochemical pollutants, design and management of infrastructures, environmental control measures, and microbiological contamination. The studies focus mainly on hospital facilities, but there is also research interest in primary care centers and dental clinics. The majority of the analyzed articles (85%) report experimental data, with the most frequently measured parameters being related to environmental quality (temperature and relative humidity), microbiological load, CO2 and particulate matter. Non-compliance with the WHO guidelines for indoor air quality is frequently reported. This study provides an overview of the recent literature on this topic, identifying promising lines of research to improve indoor air quality in healthcare facilities.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Um paradigma do sensualismo na cidade contemporânea

Propõem-se uma análise da dinâmica de produção do espaço urbano na medida em que esta deve ser um produto da acção humana, numa perspectiva da cidade entendida como um local de antagonismos entre a arquitectura e os corpos, local de mobilidade, de passagens e de fronteiras, de espaços símbolo, território de trocas, de consumo. Tentar-se-á encontrar o sentido destes elementos e as novas formas de pensar a cidade. O flâneur surge como um modelo do indivíduo moderno, (Baudelaire) (Benjamin), como uma relação entre sujeito e obra na perspectiva de receptor da experiência estética (aesthesis) numa escala urbana, onde o homem contemporâneo segue o fluxo da multidão. Também posteriormente, os situacionistas estabeleceram uma cartografia da imaginação em que seriam tidos em conta os percursos do flâneur. A observação da vida quotidiana, desses fluxos de massas humanas que são a expressão natural de uma criatividade colectiva contribuem para uma análise da arquitectura urbana onde o funcionalismo expõe o desencantamento. Para, assim, criar uma nova arquitectura das cidades do futuro, onde a compreensão da emoção, do sensualismo, pode ser a referência espacial para o desenho da cidade, acreditando na capacidade do homem mudar a sua vida em sociedade (Ramalho). Rompendo assim com a homogeneização do desenho da cidade pelas tendências de uniformização do capitalismo. Onde a necessidade de construir a cidade a grande velocidade sobrepõe qualquer pensamento sobre a experiência do espaço quando esta deveria ser mais basilar que as formas construídas. Neste projecto priorizar-se-á o estudo das formas do comportamento (Constant, New Babylon) ao invés das formas meramente racionais e funcionais

Formação de novos negócios num contexto de redes : estudos de caso

Mestrado em Gestão e Estratégia IndustrialQualquer negócio existe num contexto e a entrada de um novo negócio numa rede envolve, sempre, um processo de inserção num contexto ou sistema pré-existente. Se o sistema for encarado como uma rede, o processo de inserção é uma ação contínua (em vez de um ato único) envolvendo a co-construção de uma identidade e em simultâneo com o estabelecimento de relacionamentos com vários atores como fornecedores e, pelo menos, um primeiro cliente. Através do estudo de caso da incubadora EDP Starter e de dois novos negócios do seu programa, EIDT e EGG Electronics, pretende-se analisar os processos de inserção (emergência) dos negócios, considerando a natureza e funções dos relacionamentos desenvolvidos com vários atores na rede. Conclui-se que os relacionamentos iniciais se revelaram, de formas diversas, relevantes para o processo de inserção dos negócios em estudo na rede. Destaca-se, a este respeito, o estabelecimento de uma combinação de funções diretas e indiretas, asseguradas por um ou vários relacionamentos. Destaca-se que os relacionamentos com a incubadora evidenciam-se pelas suas funções indiretas, incluindo o seu papel na construção inicial da identidade e atratividade dos novos negócios como parceiros de trocas, nos respetivos contextos de rede.Any business exists in a context so the entrance of a new business in a network, always, involves a process of insertion into a pre-existing system. If that specific system is seen as a network, this insertion process works as a continuous action (rather than a single act), involving the co-construction of an identity and, simultaneously, the establishment of relationships with various stakeholders, including suppliers and at least a first client. Throughout the case study of the incubator EDP Starter and the two new businesses of the program, EIDT and EGG Electronics, we intend to analyse the insertion process (emergency) of those businesses, considering the nature and functions of the developed relationships with the various actors in the network. It is concluded that the initial relationships have proved, in various forms, relevant to the insertion process of those businesses in the network. In fact, it stands out the establishment of a combination of direct and indirect functions insured by one or more relationships. In particular, its relationships with the incubator are evidenced by its indirect functions, including its role in the initial construction of identity and attractiveness of the new business as trading partners in its respective network contexts