AVALIAÇÃO DE MÉTODOS DE DESCONTAMINAÇÃO PARA OBTENÇÃO DE CULTURAS PURAS DE LEPTOSPIRAS A PARTIR DE AMOSTRAS MISTAS COM Spirillum spp.

It is challenging to obtain pure cultures of Leptospira from environmental samples, mainly due to the presence of accompanying microbiota that can contaminate cultures, highlighting bacteria of the genus Spirillum that have characteristics similar to leptospires. Thus, cannot be eliminated by the most common decontamination techniques during leptospires isolation process. The purpose of this study was to evaluate five decontamination methods to obtain pure cultures of Leptospira from mixed samples with Spirillum spp. We collected ten samples from untreated domestic sewage dumped of to streets in Macapá city – Brazilian Amazon, and submitted to bacteriological culture for Leptospira isolation. The presence of leptospires was confirmed by visualization under dark-field microscopy and by 16S PCR. In the samples in which Spirillum was observed, five methods of decontamination were tested: 1 – Membrane filtration (0.20 μm and 0.22 μm); 2- Culture in selective medium for Leptospira spp.; 3- Centrifugation; 4- Serial dilution and 5- Plating on solid EMJH medium. Out of all 10 samples, five were positive for leptospires and in three there was the simultaneous detection of leptospires and Spirillum. Plating on solid EMJH medium (5) was the most efficient method, decontaminating all three mixed cultures. Only one culture was decontaminated by the technique of culture in selective medium for Leptospira spp. (2), and the other methods were ineffective. In conclusion, plating on solid EMJH medium method can be used to obtain pure cultures of Leptospira spp. from environmental samples containing Spirillum spp.Keywords: Leptospira; decontamination; mixed cultures; Spirillum.É um desafio obter culturas puras de Leptospira a partir de amostras ambientais, principalmente devido à presença de microbiota acompanhante que pode contaminar culturas, destacando bactérias do gênero Spirillum que possuem características semelhantes às leptospiras. Assim, não pode ser eliminado pelas técnicas mais comuns de descontaminação durante o processo de isolamento das leptospiras. O objetivo deste estudo foi avaliar cinco métodos de descontaminação para obter culturas puras de Leptospira a partir de amostras mistas com Spirillum spp. Foram coletadas dez amostras de esgoto doméstico não tratado descartado nas ruas da cidade de Macapá - Amazônia Brasileira, e submetidas à cultura bacteriológica para isolamento de Leptospira. A presença de leptospiras foi confirmada por visualização em microscopia de campo escuro e por 16S PCR. Nas amostras em que Spirillum foi observado, foram testados cinco métodos de descontaminação: 1 - Filtragem por membrana (0,20 μm e 0,22 μm); 2- Cultura em meio seletivo para Leptospira spp.; 3- Centrifugação; 4- Diluição em série e 5- Plaqueamento em meio sólido EMJH. Das 10 amostras, cinco foram positivas para leptospiras e em três houve a detecção simultânea de leptospiras e Spirillum. Plaqueamento em meio sólido EMJH (5) foi o método mais eficiente, descontaminando as três culturas mistas. Apenas uma cultura foi descontaminada pela técnica de cultura em meio seletivo para Leptospira spp. (2), e os outros métodos foram ineficazes. Em conclusão, o método de plaqueamento em meio sólido EMJH pode ser usado para obter culturas puras de Leptospira spp. de amostras ambientais contendo Spirillum spp.Palavras-chave: Leptospira, descontaminação, culturas mistas, Spirillum

Canine leptospirosis in asymptomatic populations from the Southwest Region of São Paulo State, Brazil

A leptospirose é uma enfermidade infectocontagiosa que pode acometer os animais e o homem. Nos países tropicais e em desenvolvimento ocorrem 70% dos casos humanos, com mortalidade variando entre 10 a 70%. Os cães podem se tornar portadores assintomáticos por um longo período, podendo transmitir a Leptospira para humanos. Devido ao intenso convívio com o ser humano, os cães podem servir como sentinelas da contaminação ambiental. Esse trabalho investigou a frequência de ocorrência da leptospirose canina em populações assintomáticas da região sudoeste do estado de São Paulo. Para isso foram examinadas pela técnica de soroaglutinação microscópica (MAT), amostras de sangue provenientes de 572 cães assintomáticos dos municípios de Apiaí, Cananeia, Itapeva e Itu por amostragem de conveniência, oriundos de campanhas de castração. Em Apiaí, foram encontrados 40,5% dos animais reagentes para Leptospira spp.; em Itapeva, 42,6%; em Cananeia, 7,7% e em Itu, 5,1%. Os dados encontrados demonstram que, pelo menos, um animal dos municípios de Itapeva, Apiaí e Cananeia apresentaram título igual ou maior que 800, indicando a circulação da bactéria nessas localidades e que a equipe envolvida nas campanhas de castração precisam ser alertadas sobre o correto uso de equipamento de proteção individual, principalmente no esvaziamento mecânico da bexiga antes do procedimento cirúrgico. O estudo também sugere que as campanhas de castração podem ser estratégicas no monitoramento de doenças zoonóticas e poderiam auxiliar no estabelecimento de ações preventivas para a saúde humana e animal.Leptospirosis is an infectious disease that can affect animals and humans. Distributed worldwide, the disease is more prevalent in tropical regions due to socioenvironmental characteristics. Dogs can serve as sentinels for environmental contamination due to their frequent contact with humans. This study investigated the frequency of occurrence of canine leptospirosis in asymptomatic populations from the Southwest Region of the State of São Paulo, Brazil. Thus, blood samples collected from 572 asymptomatic dogs from the cities of Apiaí, Cananeia, Itapeva, and Itu were tested with a microscopic agglutination test (MAT). A total of 40.5% of animals in Apiaí reacted to Leptospira spp., 42.6% in Itapeva, 7.1% in Cananeia, and 5.1% in Itu. The data from the present study demonstrate that at least one animal from the municipalities of Itapeva, Apiaí, and Cananeia had a titer equal to or higher than 800, indicating that Leptospira is circulating in these municipalities and that the teams working on castration campaigns need to be educated on the correct use of personal protective equipment, especially when mechanically emptying the bladder of these animals. This study also suggests that castration campaigns can strategically monitor zoonotic diseases and assist in establishing preventive strategies for human and animal health

Research of Leptospira spp. in cows belonging to the municipality of Novo Repartimento Pará

O presente estudo objetivou detectar a infecção por Leptospira spp. mediante ensaio sorológico, bacteriológico e molecular em 208 fêmeas bovinas do município de Novo Repartimento e em 58 fetos não abortados destas fêmeas. Em um matadouro municipal da região do Baixo Tocantins - PA foram colhidas amostras de soro sanguíneo, urina e fragmentos dos rins das fêmeas bovinas e amostras de líquidos cavitários, fragmentos dos órgãos e conteúdo gástrico dos fetos. Os testes empregados foram a soroaglutinação microscópica (SAM), o cultivo bacteriológico, a reação em cadeia pela polimerase (PCR) e o sequenciamento de DNA. A frequência de fêmeas bovinas reagentes foi de 65,86% (137/208), com títulos variando de 100 a 3.200, sendo L. interrogans sorovar Hardjoprajitnoe L. borgpetersenii sorovar Hardjobovis os mais prevalentes. Não houve o isolamento de leptospiras, mas o DNA da bactéria foi detectado em 5,76% (12/208) das amostras de rins e em 14,90% (31/208) das amostras de urina. O sequenciamento de DNA direto dos produtos da PCR foi possível em 30 amostras, distribuídas em quatro espécies diferentes: L. borgpetersenii a mais prevalente com 56,70% (17/30), seguida por L. kirschneri com 33,30% (10/30), L. interrogans com 6,70% (2/30) e L. santarosai com 3,30% (1/30). Tanto o genótipo Hardjoprajitno como Hardjobovis foram identificados. Em nenhum dos fetos foi detectado anticorpos anti-Leptospira spp. nos líquidos cavitários e nem o DNA da bactéria no pool de órgãos e conteúdo gástrico, mesmo que em alguns fetos foram observadas alterações patológicas macroscópicas sugestivas de leptospirose. Estes resultados inéditos revelam uma diversidade e peculiaridade para a leptospirose bovina em Novo Repartimento, principalmente pela baixa prevalência de L. santarosai e mais surpreendente, a presença de L. kirschneri, comumente não encontrada em bovinos, diferentemente do que ocorre em outras regiões do país.The present study aimed to detect the infection by Leptospira spp. using serological, bacteriological and molecular assays in 208 bovine females of the municipality of Novo Repartimento and in 58 non-aborted fetuses of these females. At a municipal slaughterhouse in the Baixo Tocantins - PA region were collected samples of blood serum, urine and kidney fragments from bovine females and samples of cavity liquids, fragments of the organs and gastric content of the fetuses. The tests used were microscopic agglutination test (MAT), bacteriological culture, polymerase chain reaction (PCR) and DNA sequencing. The frequency of reactive bovine females was 65.86% (137/208), with titers varying from 100 to 3,200, with L. interrogans serovar Hardjoprajitno and L. borgpetersenii serovar Hardjobovis the most prevalents. There was no isolation of leptospires, but the DNA of the bacterium was detected in 5.76% (12/208) of the kidney samples and in 14.90% (31/208) of the urine samples. Direct DNA sequencing of PCR products was possible in 30 samples, distributed in four different species: L. borgpetersenii, the most prevalent with 56.70% (17/30), followed by L. kirschneri with 33.30% (10 / 30), L. interrogans with 6.70% (2/30) and L. santarosai with 3.30% (1/30). Both genotypes Hardjoprajitno and Hardjobovis were identified. In none of the fetuses was detected antibodies anti-Leptospira spp. in the samples of cavity liquids and neither the DNA of the bacterium in the pool of organs and gastric content, although in some fetuses macroscopic pathological changes suggestive of leptospirosis have been observed. These results reveal a diversity and peculiarity for the bovine leptospirosis in Novo Repartimento, mainly due to the low prevalence of L. santarosai and more surprising, the presence of L. kirschneri, not commonly found in cattle, differrently what happens in other regions of country

Prevalência e fatores de risco para tuberculose bovina no Estado de Mato Grosso do Sul, Brasil

The objective of this study was to describe the epidemiological situation of bovine tuberculosis in Mato Grosso do Sul. The State was divided into three regions, Pantanal, Planalto Norte, and Planalto Sul. In each region, properties were randomly chosen and a pre-established number of animals were also randomly selected; these animals were submitted to the intradermal comparative cervical tuberculin diagnostic test. In total, 17,121 animals from 938 properties were tested. In cases of inconclusive results, the animals were retested with the same diagnostic procedure within a minimum interval of 60 days. An epidemiological questionnaire was administered in the properties sampled to investigate possible risk factors for the disease. In the State, the prevalence of infected herds was 1.3% (95% confidence interval [CI]: 0.72–2.37%) and that of infected animals was 0.035% (95% CI: 0.017–0.069%). Point estimates indicated a higher concentration of infected herds (2.61%; 95% CI: 1.31–5.15%) and infected animals (0.132%; 95% CI: 0.055–0.315%) in the Planalto Sul region, which has a predominance of dairy properties. The prevalence of herds infected with bovine tuberculosis was found to be associated with the production of milk, with technification in the mode of production represented by the use of mechanical milking. Thus, it is recommended that the State adopt strategies for the eradication of bovine tuberculosis, with the structuring of the surveillance system for detection and mitigation of infected herds, incorporating risk-based surveillance elements.O objetivo do presente estudo foi descrever a situação epidemiológica da tuberculose bovina no Mato Grosso do Sul. O estado foi dividido em três regiões, Pantanal, Planalto Norte e Planalto Sul. Em cada região, propriedades foram sorteadas aleatoriamente e, dentro dessas, selecionou-se também de forma aleatória um número pré-estabelecido de animais, os quais foram submetidos ao teste Tuberculínico Cervical Comparativo. No total, foram testados 17.121 animais, provenientes de 938 propriedades. Os animais que resultaram inconclusivos foram retestados com o mesmo procedimento diagnóstico em intervalo mínimo de 60 dias. Nas propriedades amostradas foi aplicado um questionário epidemiológico para averiguar possíveis fatores de risco para a enfermidade. No estado, a prevalência de focos foi de 1,3% [0,72; 2,37%] e a de animais 0,035% [0,017; 0,069%]. As estimativas pontuais indicaram uma maior concentração de focos (2,61% [1,31; 5,15%]) e de animais (0,132% [0,055; 0,315%]) na região Planalto Sul, que tem predomínio de propriedades leiteiras. Verificou-se que a condição do foco de tuberculose bovina está associada à produção de leite, com sofisticação no modo de produção representado pela utilização de ordenha mecânica. Assim, recomenda-se que o estado adote estratégias de erradicação, com a estruturação de sistema de vigilância para detecção e saneamento de focos, incorporando elementos de vigilância baseada em risco

Pulmonary Fibrosis and Hypereosinophilia in TLR9-/- Mice Infected by Cryptococcus gattii

Cryptococcus gattii is a worldwide-distributed basidiomycetous yeast that can infect immunocompetent hosts. However, little is known about the mechanisms involved in the disease. The innate immune response is essential to the control of infections by microorganisms. Toll-like receptor 9 (TLR9) is an innate immune receptor, classically described as a non-methylated DNA recognizer and associated with bacteria, protozoa and opportunistic mycosis infection models. Previously, our group showed that TLR9-/- mice were more susceptible to C. gattii after 21 days of infection. However, some questions about the innate immunity involving TLR9 response against C. gattii remain unknown. In order to investigate the systemic cryptococcal infection, we evaluated C57BL/6 mice and C57BL/6 TLR9-/- after intratracheal infection with 104C. gattii yeasts for 21 days. Our data evidenced that TLR9-/- was more susceptible to C. gattii. TLR9-/- mice had hypereosinophilia in pulmonary mixed cellular infiltrate, severe bronchiolitis and vasculitis and type 2 alveolar cell hyperplasia. In addition, TLR9-/- mice developed severe pulmonary fibrosis and areas with strongly birefringent fibers. Together, our results corroborate the hypothesis that TLR9 is important to support the Th1/Th17 response against C. gattii infection in the murine experimental model