Metabolic 13 C-flux analysis : from isotopic steady state to unsteady state

Die Untersuchung der Stoffwechselvorgänge von Mikroorganismen in Produktionsprozessen mit einem sich zeitlich ändernden metabolischen Zustand war mit der etablierten Methode der 13C-Stoffflussanalyse (SFA) auf Grund der langen Markierungszeiten bisher nicht möglich. Die fortschreitende Entwicklung auf dem Gebiet der massenspektrometrischen Analyse ermöglicht es heute, die Markierung direkt in den Metaboliten des Zentralstoffwechsels zu messen, wo sich ein isotopisch stationärer Zustand schon nach deutlich kürzerer Zeit einstellen kann. Übergreifendes Ziel dieser Arbeit war es, diese Markierungsdaten zu nutzen und die Dauer der Markierungszeit soweit zu verkürzen, dass der Stoffwechsel von Bakterien in Produktionsprozessen - Batch- oder Fedbatch-Prozessen - untersucht werden kann. Im ersten Teil der Arbeit wird die isotopisch stationäre SFA auf Basis der Markierungsdaten der intrazellulären Metabolite des Zentralstoffwechsels für den E. coli K12 Wildtyp und einen Produktionsstamm betrachtet. Bei Zugabe markierter Glukose direkt zu Beginn der Kultivierung und mehrstündiger Markierung in der exponentiellen Wachstumsphase (Batch) wurden mit dem Wildtyp zu Literaturdaten vergleichbare Stoffflüsse bestimmt. Zur Untersuchung der Stoffwechselveränderungen im Produktionsprozess von (3R,4R)-Dihydroxy-3,4-Dihydrobenzoesäure wurde mit Hilfe des Sensorreaktors (El Massaoudi 2004) zu verschiedenen Zeitpunkten des Fedbatch Prozesses markiert. Bei der SFA zeigten sich große Abweichungen zwischen den gemessenen und angepassten Markierungsdaten. Die Erweiterung des metabolischen Modells um zusätzliche unmarkierte Zuflüsse führte zu einer wesentlich besseren Anpassung und biologisch erklärbaren Stoffflüssen. Auf Basis des Vergleichs mit optimalen Flüssen (Flux Balance Analyse) wurden genetische Optimierungspotentiale abgeleitet. Im zweiten Teil der Arbeit wird die SFA auf Basis von isotopisch instationären Markierungsdaten untersucht. Es wird die Entwicklung einer schnellen Probenahmetechnik zur Gewinnung von zeitlich aufgelösten Markierungsdaten vorgestellt. Es wurden verschiedene in der Literatur beschriebene Methoden zur Extraktion der Metabolite untersucht und die Ergebnisse werden hier diskutiert. Mit einem E. coli Wildtyp wurden zwei Markierungsexperimente durchgeführt und die Markierungsanreicherung und Metabolitkonzentrationen im Zentralstoffwechsel gemessen. In der Glykolyse wird wie erwartet schon nach wenigen Sekunden ein isotopisch stationärer Zustand erreicht. Die Markierungsanreicherung im Zitronensäurezyklus ist hingegen sehr viel langsamer. Als mögliche Ursache wird ein Rückfluss aus Speicherpools außerhalb des Zentralstoffwechsels diskutiert. Durch die Berücksichtigung von unmarkierten Rückflüssen in den Zentralstoffwechsel im metabolischen Modell kann eine gute Anpassung der Markierungsverläufe erreicht werden. Verschiedene Modellvarianten wurden untersucht und werden hier diskutiert. Im Vergleich zur isotopisch stationären SFA wurde festgestellt, dass die Standardabweichung der berechneten Flüsse vielfach geringer ist. Insbesondere die anaplerotischen Flüsse und die Austauschflüsse sind wesentlich besser bestimmt. In dieser Arbeit wird prinzipiell gezeigt, dass auf Basis der Daten aus einem Markierungsexperiment mit sehr kurzen Markierungszeiten von wenigen Sekunden Dauer mit Hilfe der isotopisch instationären SFA zuverlässig die Stoffflüsse im Zentralstoffwechsel bestimmt werden können. Es werden das Potenzial aber auch die notwendigen Weiterentwicklungen der neuen Methode diskutiert.With the established tools of 13C-Metabolic Flux Analysis (MFA) up to now it is not possible to analyse the metabolism of microorganisms in biotechnological production processes because of the long labelling time. Due to the proceeding development in mass spectrometry it is now possible to measure the 13C-labelling directly in the intracellular metabolites of the central metabolism (glycolysis, pentose-phosphate-pathway and citric acid cycle). Here it is assumed that an isotopic steady state will be reached in a much shorter time. Main objective of this work was to use this data and reduce the labelling time to make it possible to analyse the cell metabolism in production processes that are mainly batch and fed batch processes. In the first part of this work the isotopic stationary MFA based on the labelling data of intra cellular metabolites will be investigated for an E. coli K12 wildtype and a production strain. By adding 13C-labelled glucose at the beginning of the cultivation and labelling for several hours in a batch experiment comparable results with literature data are found for the wildtype. For investigation of metabolic changes in the production process of (3R,4R)-Di-hydroxy-3,4-di-hydrobenzoic acid the cells were labelled for different time periods of the fed batch process by using the sensor reactor (El Massaoudi 2004). The MFA showed big differences between the measured and fitted labelling data. By expansion of the metabolic model with unlabelled fluxes into the metabolic network the calculated data matched much better and biological meaningful metabolic fluxes are calculated. Based on the comparison with optimal fluxes (Flux Balance Analysis) potentials for genetic optimization are presented. In the second part of this work the use of isotopic instationary data for MFA is investigated. The development of a fast sampling device for mapping the labelling enrichment is presented. Different methods for metabolite extraction described in literature are tested and the results are discussed. Two labelling experiments were performed during the cultivation of the E. coli K12 wildtype and the labelling enrichment and the metabolite pool sizes of the central metabolism were measured. As expected in glycolysis an isotopic steady state is reached after a few seconds. In the citric acid cycle the labelling enrichment is much slower. As a possible reason for that a reflux of unlabelled metabolites from large pools outside of the central metabolism is discussed. After incorporation of unlabelled refluxes into the metabolic network model a good fitting of the labeling enrichment is reached. Several model variants were analyzed and are discussed here. In comparison with the isotopic stationary MFA the standard deviation of the calculated fluxes is generally lower. Particularly the anaplerotic fluxes and the exchange fluxes are better determined. In this work it is in principle shown that with the isotopic instationary MFA the metabolic fluxes of the central metabolism can be determined with a good reliability based on the data of a very short labelling experiment with a few seconds duration. The potential of this new method and the necessary further developments are discussed

Russische Quellenpublikationen in deutschen Übersetzungen: Eine thematisch geordnete Auswahl aus dem Verzeichnis vom verlag ernst kuhn berlin

In der Sowjetunion hatte die Musikwissenschaft zwei Seite

The lung function profile of once-daily tiotropium and olodaterol via Respimat® is superior to that of twice-daily salmeterol and fluticasone propionate via Accuhaler® (ENERGITO® study)

Background: Tiotropium + olodaterol has demonstrated improvements beyond lung function benefits in a large Phase III clinical program as a once-daily maintenance treatment for COPD and may be a potential option for the initiation of maintenance treatment in COPD. Despite guideline recommendations that combined long-acting beta(2)-agonists and inhaled corticosteroids should only be used in individuals at high risk of exacerbation, there is substantial use in individuals at lower risk. This raises the question of the comparative effectiveness of this combination as maintenance treatment in this group compared to other combination regimens. Objective: The study aimed to assess the effect on lung function of once-daily tiotropium + olodaterol versus twice-daily salmeterol + fluticasone propionate in all participants with Global initiative for chronic Obstructive Lung Disease 2 or 3 (moderate to severe) COPD. Methods: This was a randomized, double-blind, double-dummy, four-treatment, complete crossover study in which participants received once-daily tiotropium + olodaterol (5/5 mu g and 2.5/5 mu g) via Respimat (R) and twice-daily salmeterol + fluticasone propionate (50/500 mu g and 50/250 mu g) via Accuhaler (R) for 6 weeks. The primary end point was change in forced expiratory volume in 1 second (FEV1) area under the curve from 0 hour to 12 hours (AUC(0-12)) relative to the baseline after 6 weeks. Results: Tiotropium + olodaterol 5/5 mu g and 2.5/5 mu g demonstrated statistically significant improvements in FEV1 AUC(0-12) compared to salmeterol + fluticasone propionate (improvements from baseline were 317 mL and 295 mL with tiotropium + olodaterol 5/5 mu g and 2.5/5 mu g, and 188 mL and 192 mL with salmeterol + fluticasone propionate 50/500 mu g and 50/250 mu g, respectively). Tiotropium + olodaterol was superior to salmeterol + fluticasone propionate in lung function secondary end points, including FEV1 area under the curve from 0 hour to 24 hours (AUC(0-24)). Conclusion: Once-daily tiotropium + olodaterol in participants with moderate-to-severe COPD provided superior lung function improvements to twice-daily salmeterol + fluticasone propionate. Dual bronchodilation can be considered to optimize lung function in individuals requiring maintenance treatment for COPD

Pëtr Il'ic Cajkovskij. Zabymoe i novoe [Vergessenes und Neues]: Almanach, Heft 1, Moskau 1995 [Rezension]

Unmittelbar nach Cajkovskijs Cholera-Tod setzte die Ikonisierung des Komponisten ein

Metabolische 13C-Stoffflussanalyse - vom isotopisch stationären zum instationären Fall

With the established tools of $^{13}$C-Metabolic Flux Analysis (MFA) up to now it is not possible to analyse the metabolism of microorganisms in biotechnological production processes because of the long labelling time. Due to the proceeding development in mass spectrometry it is now possible to measure the $^{13}$C-labelling directly in the intracellular metabolites of the central metabolism (glycolysis, pentose-phosphate-pathway and citric acid cycle). Here it is assumed that an isotopic steady state will be reached in a much shorter time. Main objective of this work was to use this data and reduce the labelling time to make it possible to analyse the cell metabolism in production processes that are mainly batch and fed batch processes. [...

Glinkas Bearbeitungen von Aljab'evs Romanze Die Nachtigall

Die traditionelle Vorliebe der Russen für vokale Formen führte Anfang des 19. Jahrhunderts zur Entstehung der sogenannten \"russischen Romanze\" (einem nationalen Äquivalent zum deutschen Kunstlied)

Die Tschaikowsky-Gesellschaft e. V. Tübingen

Aus Anlaß des 100. Todestags von Pëtr Ilʹič Čajkovskij fand Ende Oktober 1993 in Tübingen ein von Konzerten und Ausstellungen begleitetes internationales Symposium statt, auf dem Musikwissenschaftler aus Rußland, Deutschland, Großbritannien, den USA und Japan neueste Forschungsergebnisse über den russischen Komponisten austauschten. In diesem - zunächst sehr kleinen - Kreis war man sich rasch einig, daß in Sachen Čajkovskij Handlungsbedarf bestand und gründete die "Tschaikowsky-Gesellschaft e. V.". Dem mittlerweile von 29 auf 124 Mitglieder angewachsenen Verein geht es um die wissenschaftliche Aufbereitung und intensive Förderung von Čajkovskijs musikalischem und literarischem Nachlaß

Moskau in der russischen Oper

Zum Thema „Moskau in der russischen Oper“ gibt es wohl kaum ein eindrucksvolleres Beispiel als die Krönungsszene aus dem Prolog zu Modest Mussorgskis Oper Boris Godunow: Ein Chor jubelt lautstark „Slava!“ (also „Ehre!“ oder „Ruhm!“), außerdem erklingen ein orchesterbegleiteter Hymnus, Blechbläserfanfaren und - vor allem und immer wieder - Glockengeläut

The 24-h lung-function profile of once-daily tiotropium and olodaterol fixed-dose combination in chronic obstructive pulmonary disease

Background: This study investigated the effects on 24-h lung function and lung volume of a once-daily fixed-dose combination (FDC) of the long-acting muscarinic antagonist tiotropium and the long-acting beta(2)-agonist olodaterol in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Methods: This was a randomised, double-blind, placebo-controlled, Phase III trial with an incomplete crossover design. Patients received four of the following six treatment options for 6 weeks each: placebo, olodaterol 5 mu g, tiotropium 2.5 mu g, tiotropium 5 mu g, tiotropium + olodaterol FDC 2.5/5 mu g and tiotropium + olodaterol FDC 5/5 mu g, all delivered via the Respimat (R) inhaler. The primary end point was forced expiratory volume in 1 s (FEV1) area under the curve from 0 to 24 h (AUC(0-24)) response after 6 weeks of treatment; key secondary end points were FEV1 AUC from 0 to 12 h and AUC from 12 to 24 h, and further end points included lung-volume parameters measured using body plethysmography (subset of patients), measures of peak and trough FEV1, and incidence of adverse events. Results: A significant improvement in FEV1 AUC(0-24) response was observed with tiotropium + olodaterol 5/5 mu g and 2.5/5 mu g versus placebo and monotherapies after 6 weeks of treatment; mean response with tiotropium + olodaterol 5/5 mu g versus placebo was 0.280 L (p < 0.0001). Differences to monotherapies with tiotropium + olodaterol 5/5 mu g were 0.115 L versus olodaterol 5 mu g, 0.127 L versus tiotropium 2.5 mu g and 0.110 L versus tiotropium 5 mu g (p < 0.0001 for all comparisons). Secondary end points supported these data. No safety concerns were identified. Conclusions: Overall, this study demonstrated improvements in lung function over 24 h with an FDC of tiotropium + olodaterol over tiotropium or olodaterol alone, with no observed difference in tolerability. ClinicalTrials.gov number: NCT01559116

Colorimetric Measurement of Triglycerides Cannot Provide an Accurate Measure of Stored Fat Content in Drosophila

Drosophila melanogaster has recently emerged as a useful model system in which to study the genetic basis of regulation of fat storage. One of the most frequently used methods for evaluating the levels of stored fat (triglycerides) in flies is a coupled colorimetric assay available as a kit from several manufacturers. This is an aqueous-based enzymatic assay that is normally used for measurement of mammalian serum triglycerides, which are present in soluble lipoprotein complexes. In this short communication, we show that coupled colorimetric assay kits cannot accurately measure stored triglycerides in Drosophila. First, they fail to give accurate readings when tested on insoluble triglyceride mixtures with compositions like that of stored fat, or on fat extracted from flies with organic solvents. This is probably due to an inability of the lipase used in the kits to efficiently cleave off the glycerol head group from fat molecules in insoluble samples. Second, the measured final products of the kits are quinoneimines, which absorb visible light in the same wavelength range as Drosophila eye pigments. Thus, when extracts from crushed flies are assayed, much of the measured signal is actually due to eye pigments. Finally, the lipoprotein lipases used in colorimetric assays also cleave non-fat glycerides. The glycerol backbones liberated from all classes of glycerides are measured through the remaining reactions in the assay. As a consequence, when these assay kits are used to evaluate tissue extracts, the observed signal actually represents the amount of free glycerols together with all types of glycerides. For these reasons, findings obtained through use of coupled colorimetric assays on Drosophila samples must be interpreted with caution. We also show here that using thin-layer chromatography to measure stored triglycerides in flies eliminates all of these problems