Targeting the glycation defenses as a protective strategy for Parkinson's disease

Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017O aumento da esperança média de vida tem-se traduzido no envelhecimento progressivo da população mundial e consequente aumento da incidência de doenças associadas ao envelhecimento, tais como as doenças neurodegenerativas de Alzheimer ou de Parkinson. A doença de Parkinson é a segunda doença neurodegenerativa mais comum, a seguir à doença de Alzheimer, e é caracterizada pela degeneração progressiva de neurónios dopaminérgicos na substantia nigra pars compacta. Uma das características mais comuns desta doença é a formação de corpos de Lewy, estruturas maioritariamente compostas por a-sinucleína agregada. A perda dos neurónios dopaminérgicos conduz à redução da produção de dopamina, um neurotransmissor essencial à sinalização do movimento voluntário. Tal facto é responsável por várias manifestações motoras apresentadas pelos doentes. Estas incluem tremores, bradicinesia e rigidez muscular. Os doentes de Parkinson também podem manifestar sintomas não motores como a psicose, depressão, hiposmia e cognição comprometida. A maioria dos casos de Parkinson tem origem desconhecida, sendo o envelhecimento o seu maior fator de risco. A diabetes tem vindo a ser sugerida como um fator de risco importante para o aparecimento/desenvolvimento desta doença. Nomeadamente, cerca de 80% dos doentes de Parkinson apresentam intolerância à glucose; proteínas modificadas por açúcares nos seus cérebros; e falhas nas defesas contra os açucares. A hiperglicemia, consequência da diabetes, promove o aumento dos níveis de açúcares redutores no cérebro, tais como o metilglioxal. Este composto é um metabolito secundário, proveniente de diferentes vias metabólicas e, como outros açúcares redutores, pode reagir com proteínas numa reação denominada de glicação. A glicação é um processo que compreende uma série de reações entre açúcares redutores e grupos amina de proteínas, lípidos ou nucleótidos. Quando em reação com proteínas, formam como produto final os denominados produtos avançados de glicação (do inglês advanced glycation endproducts – AGEs). A glicação pode promover diversas alterações a diferentes níveis celulares, tais como disfunção mitocondrial, alteração de degradação proteica, ou até promoção de processos de inflamação. No contexto de modelos de Parkinson, verificou-se que a glicação induz o aumento da agregação e da toxicidade da a-sinucleína, provocando efeitos negativos em diversos processos celulares. Em particular, a glicação da a-sinucleína induzida pelo metilglioxal, altera o seu clearance, e afeta o proteossoma, macro-autofagia e também a secreção, levando à sua acumulação. A glicação pelo metilglioxal conduz também à perda de neurónios dopaminérgicos na substantia nigra e no estriado em ratinhos, modelos da doença de Parkinson. Enquanto que a formação do metilglioxal é inevitável, este pode ser catabolizado por diferentes vias, sendo o sistema dos glioxalases um dos mais eficientes. Para além de processos enzimáticos, existem também compostos capazes de sequestrar metilglioxal e impedir que este reaja com as proteínas. Existem também compostos que inibem o processo de glicação, ou que têm capacidade de remover os AGEs das proteínas. Assim, coloca-se por hipótese que os compostos que previnam a glicação possam ser benéficos na prevenção ou tratamento da agregação e citotoxicidade da a-sinucleína. Tendo em conta que o metilglioxal assume um papel importante na doença de Parkinson, neste estudo foi avaliado o potencial terapêutico de diversos compostos supressores de glicação tais como a metformina, pioglitazona, sulforafane, resveratrol, carnosina e aminoguanidina. A atividade destes compostos foi avaliada pela sua capacidade em proteger dos efeitos deletérios induzidos pela glicação. Nomeadamente, em reduzir a citotoxicidade da a-sinucleína/metilglioxal; os níveis de a-sinucleína; a agregação de a-sinucleína; os níveis gerais de AGEs; bem como de potenciar o clearance de asinucleína. O potencial de proteção foi avaliado de forma preventiva (antes do insulto) ou restaurativa (após insulto com metilglioxal). Para este efeito, foi utilizado como modelo de estudo células H4 (neuroglioma) a sobre-expressar a-sinucleína. Os compostos a avaliar foram incubados na ausência e/ou presença metilglioxal. A citotoxicidade foi avaliada pela perda de integridade da membrana citoplasmática, medida pela actividade do enzima lactato desidrogenase libertado. Os níveis de asinucleína foram avaliados por Western blot. A solubilidade de proteínas em Triton X-100 permitiu estudar a solubilidade da a-sinucleína proveniente de um extrato nativo de células que expressam SynT, uma variante da a-sinucleína com maior tendência para agregar. Na presença deste detergente, as proteínas mais solúveis, após uma centrifugação a alta velocidade por um período longo de tempo, permanecem na fração solúvel, enquanto que as insolúveis ficam precipitadas na base do tubo de centrifugação (fração insolúvel). À fração insolúvel correspondem proteínas agregadas. A agregação da a-sinucleína foi também avaliada por imunocitoquímica. Ao hibridar a a-sinucleína com um anticorpo secundário fluorescente, é possível, recorrendo a um microscópio de fluorescência, visualizar a presença de agregados intracelulares. O “clearance” da a-sinucleína foi estudado pela monitorização dos níveis desta proteína por western blot, de extratos proteicos de células cuja síntese proteica de novo foi inibida (pelo uso de cicloheximida) em diferentes momentos no decurso do tempo. Os resultados obtidos neste estudo revelaram que a metformina, a carnosina e a aminoguanidina, nas concentrações testadas, não apresentam citotoxicidade num contexto basal. O mesmo se verifica quando as células expressam a a-sinucleína e/ou quando a glicação é induzida pelo metilglioxal. A metformina, a carnosina e a aminoguanidina apresentaram capacidade de reduzir a citotoxicidade induzida pelo metilglioxal em células que sobre-expressam a a-sinucleína. Tal verificou-se num contexto preventivo bem como restaurativo. A metformina e a carnosina são igualmente capazes de prevenir o aumento dos níveis gerais de AGEs e de a-sinucleína/SynT, induzido pelo metilglioxal. No entanto, o mesmo não foi observado num contexto restaurativo, onde apenas a carnosina reduziu os níveis de AGEs em células que expressam a variante SynT, e por isso num contexto em que a agregação da a-sinucleína está potenciada. No que diz respeito ao perfil de solubilidade da a-sinucleína, a metformina solubilizou a proteína num contexto preventivo, o que sugere que tenha capacidade de prevenir a agregação da SynT. Por outro lado, a carnosina não parece modular a solubilidade da SynT. Num contexto restaurativo, nenhum dos compostos testados mostrou potencial para alterar a solubilidade da a-sinucleína. A agregação desta proteína foi também avaliada por imunocitoquímica. Uma vez que os compostos não apresentaram potencial restaurativo, a sua eficácia foi apenas avaliada num contexto preventivo. Os resultados preliminares revelam que tanto o tratamento com a metformina como com a carnosina resultam numa diminuição do número de células com agregados. Estes resultados estão em concordância com os observados nos testes de solubilidade. No que diz respeito ao clearance da a-sinucleína, os resultados preliminares sugerem que a metformina, não só previne contra os efeitos do metilglioxal (que impede o clearance da a-sinucleína) como potencia o clearance da a-sinucleína. Em suma, os resultados obtidos neste estudo sugerem que a metformina e a carnosina apresentam elevado potencial de proteção contra a citotoxicidade da a-sinucleína (30% e 20%, respetivamente), principalmente num contexto de glicação. A sua eficácia é maior num contexto preventivo, em modelos que apresentam maior agregação da proteína, bem como em condições de glicação induzida pelo metilglioxal. Em contexto preventivo, tanto a metformina como a carnosina diminuem os níveis gerais de glicação, o que está em concordância com o facto destes compostos serem sequestradores de metilglioxal. A carnosina também apresentou capacidade de reduzir os níveis de a-sinucleína ou SynT em células glicadas com metilglioxal. Ainda num contexto preventivo, tanto a metformina como a carnosina preveniram a agregação da SynT. A metformina apresenta ainda potencial para aumentar o clearance da a-sinucleína. É importante referir que no que diz respeito aos estudos de agregação (imunocitoquímica), bem como os de clearance da a-sinucleína, os resultados apresentados nesta tese são preliminares, e carecem por isso de confirmação com experiências adicionais. De futuro, pretende-se ainda testar o efeito da carnosina no clearance da a-sinucleína. Com este estudo conclui-se que a metformina e a carnosina são compostos com elevado potencial de proteção/prevenção contra os efeitos citotóxicos da a-sinucleína, particularmente em condições de glicação induzida pelo metilglioxal. Sugere-se, por isso, que estes compostos são potenciais fármacos para o tratamento da doença de Parkinson.Parkinson’s disease is the second most common neurodegenerative disorder, characterized by the loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta, leading to several features of the disease such as abnormal motor performance and, at later stages, cognitive impairment. The main hallmark of this disease is the presence of Lewy bodies, which are primarily composed of a-synuclein. Diabetes has been associated as a risk factor for the development of Parkinson’s disease, and recently, glycation was suggested as the missing link between the two diseases. Reducing sugars, such as methylglyoxal, intervene in this reaction, leading to the formation of advance glycation end-products, which promote protein cross-linking. a-synuclein is an appealing target of glycation, since more than 10% of its residues are putative targets of this post-translational modification. Glycation is thought to play a key role in the aggregation of a-synuclein, as it promotes its aggregation and toxicity. As such, modulation of glycation defenses in Parkinson’s disease can represent a new therapeutic approach to delay or prevent the disease progression. This study aimed to evaluate the therapeutic potential of metformin, pioglitazone, sulforaphane, carnosine, and aminoguanidine, compounds already shown to protect against glycation toxic effects. To this purpose, the selected pharmacological compounds activity was tested, in a preventive or restorative paradigm, in cellular models of Parkinson’s disease under methylglyoxal-induced glycation. Regarding a-synuclein/methylglyoxal associated toxicity assessment, metformin and carnosine were the most active compounds. They were able to decrease toxicity both in a preventive and restorative manner. Moreover, these agents were also able to decrease the formation of advance glycation endproducts in cells treated with methylglyoxal. Carnosine, in a preventive manner, decreased a-synuclein protein levels. On the other hand, metformin is able to maintain a-synuclein (SynT) solubility. Preliminary data suggests that metformin not only decreases the number of cells with a-synuclein aggregates, but also promotes its clearance. In contrast, under a restorative paradigm, neither metformin nor carnosine modulate a-synuclein levels. In summary, metformin and carnosine have a protective potential against methylglyoxal-induced asynuclein glycation in a cellular model of Parkinson’s disease, making these a novel potential therapeutic approach to Parkinson’s disease

Ensinando enfermagem de família em contexto hospitalar recorrendo a um instrumento lúdico

Este trabalho consiste no relato de uma experiência na utilização de um jogo para refletir na Família como Foco dos Cuidados de Enfermagem em Meio Hospitalar. Cientes da importância da inclusão da família no contexto de cuidados, foi planeado um programa educativo num grupo de duzentos enfermeiros de um hospital, com a inclusão de um jogo. Esta estratégia fundamenta-se na crença da existência de uma relação entre o jogo e a aprendizagem. O jogo causa prazer, interacção no grupo e desafia, permitindo a aprendizagem através da própria descoberta e provocando curiosidade e pesquisa. O jogo intitulado Family Nursing Game tem como finalidade o ensino sobre Enfermagem de Família, divulgando a implementação do Modelo de Calgary de Avaliação e Intervenção em Família (MCAIF).This paper reports an experiment in using a game to reflect on the Family as a Focus of Nursing in Hospital Environment. Realizing the importance of including the family in the context of care, an educational program was planned in a group of two hundred nurses of a hospital, with the inclusion of a game. This strategy is based on the belief of the existence of a relationship between play and learning. The game is pleasurable, promotes group interaction and challenges, enabling learning through self-discovery and provoking curiosity and research. The game entitled Family Nursing game aims to teach about Family Nursing, promoting the implementation of Model Calgary Family Assessment and Intervention (MCAIF).info:eu-repo/semantics/publishedVersio

A Importância das Famílias nos Cuidados de Enfermagem: Atitudes dos Enfermeiros em Meio hospitalar

Enquadramento: A atitude dos enfermeiros para com as famílias é determinante para a qualidade dos cuidados de enfermagem, facilitando os processos de transição saúde/doença vivenciadas pela família no hospital. Objetivos: O objetivo deste estudo consiste em identificar a atitude dos enfermeiros de diferentes contextos de cuidados hospitalares sobre a importância de incluir a família nos cuidados de Enfermagem. Metodologia: É um estudo de natureza quantitativa, exploratório e descritivo, integrando 160 enfermeiros de diversos contextos de um hospital, através de uma amostra por conveniência. Este estudo recorre à utilização de um questionário, integrando uma avaliação sociodemográfica e a aplicação da escala A importância das famílias nos cuidados de Enfermagem – IFCE-AE. Resultados: Os resultados obtidos da aplicação da escala IFCE-AE revelam scores médios elevados. Contudo, os resultados não evidenciam correlações significativas que justifiquem a influência das variáveis exploradas. Conclusão: Os enfermeiros possuem um grau de concordância elevado sobre a importância das famílias nos cuidados de enfermagem, no que se refere aos diferentes contextos de cuidados.Theoretical framework: Nurses’ attitudes towards families are essential to the quality of nursing care, facilitating the health/ disease transition processes experienced by the family in the hospital. Objectives: The aim of this study is to identify the attitudes of nurses in different hospital settings about the importance of including the family in nursing care. Methodology: A quantitative, exploratory and descriptive study was conducted with a convenience sample of 160 nurses from different units in a hospital. This study used a questionnaire, which included a sociodemographic evaluation and the scale Families’ Importance in Nursing Care - Nurses Attitudes (FINC-NA). Results: The results obtained by applying the FINC-NA scale revealed high mean scores. However, the results showed no significant correlations to justify the influence of the analysed variables. Conclusion: Nurses show a high level of agreement about the importance of families in nursing care within the various contexts of care.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Ancianos residentes en la comunidad: conocer para defender un programa de enfermería de rehabilitación

To analyze the socio-demographic and health conditions of the elderly living in the community and describe the pillars for the design of a rehabilitation nursing program in the community.Objetivo: Analisar as condições sociodemográficas e de saúde dos idosos residentes na comunidade e descrever os pilares para a concepção de um programa de enfermagem de reabilitação na comunidade. Métodos: Estudo descritivo, transversal, com participação de 48 idosos selecionados por amostragem de conveniência. A coleta de dados realizou-se entre setembro de 2018 e julho de 2019, numa unidade de saúde do norte de Portugal, usando um formulário. Resultados: Todos os idosos têm processos patológicos e excesso de peso. Majoritariamente são sedentários, apresentam sentimentos de solidão e comportamentos relacionais inapropriados. Nos últimos seis meses, 25% caíram pelo menos uma vez, tendo sido notórias alterações no equilíbrio, estilos de vida e percepção do estado de saúde. Conclusão: Evidenciou-se a necessidade de os enfermeiros de reabilitação conceberem e implementarem programas de envelhecimento ativo que garantam acompanhamento individual dos idosos valorizando estilos de vida, treino de equilíbrio e promoção da participação social.Objetivo: Analizar las condiciones sociodemográficas y de salud de ancianos residentes en la comunidad y describir los pilares para la concepción de un programa de enfermería de rehabilitación en la comunidad. Métodos: Estudio descriptivo, transversal, con participación de 48 ancianos seleccionados por muestreo de conveniencia. La recogida de datos se realizó entre septiembre de 2018 y julio de 2019, en unidad de salud del norte de Portugal, usando un formulario. Resultados: Todos los ancianos tienen procesos patológicos y sobrepeso. Mayoritariamente son sedentarios, sienten soledad y comportamientos relacionales inapropiados. En los últimos seis meses, 25% cayeron por lo menos una vez, siendo notorias alteraciones en el equilibrio, estilos de vida y percepción en la salud. Conclusión: Se evidenció la necesidad de los enfermeros de rehabilitación concebir e implementar programas de envejecimiento activo que garantizan acompañamiento individual de ancianos valorizando estilos de vida, ejercicios de equilibrio y promoción de la participación social.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Production of high-quality SARS-CoV-2 antigens for vaccine development and serological assays implementation

The development of novel and/or improved vaccines as well as the establishment of tools to monitor vaccine responses are two key factors to control COVID-19 pandemic, often requiring the manufacturing of significant amounts of high-quality SARS-CoV-2 antigens. In this work, we produced SARS-CoV-2 Spike (S) and the receptor binding domain (RBD) proteins in human or insect cell lines to be further used in (i) the implementation of serological assays for detection of antibodies against SARS-CoV-2 virus in the Portuguese population, and (ii) the development of a virosome-based COVID-19 vaccine candidate. Please click Download on the upper right corner to see the full abstract

Insect Cells for High-Yield Production of SARS-CoV-2 Spike Protein: Building a Virosome-Based COVID-19 Vaccine Candidate.

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) homotrimeric spike (S) protein is responsible for mediating host cell entry by binding to the angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor, thus being a key viral antigen to target in a coronavirus disease 19 (COVID-19) vaccine. Despite the availability of COVID-19 vaccines, low vaccine coverage as well as unvaccinated and immune compromised subjects are contributing to the emergence of SARS-CoV-2 variants of concern. Therefore, continued development of novel and/or updated vaccines is essential for protecting against such new variants. In this study, we developed a scalable bioprocess using the insect cells-baculovirus expression vector system (IC-BEVS) to produce high-quality S protein, stabilized in its pre-fusion conformation, for inclusion in a virosome-based COVID-19 vaccine candidate. By exploring different bioprocess engineering strategies (i.e., signal peptides, baculovirus transfer vectors, cell lines, infection strategies and formulation buffers), we were able to obtain ~4 mg/L of purified S protein, which, to the best of our knowledge, is the highest value achieved to date using insect cells. In addition, the insect cell-derived S protein exhibited glycan processing similar to mammalian cells and mid-term stability upon storage (up to 90 days at -80 and 4 °C or after 5 freeze-thaw cycles). Noteworthy, antigenicity of S protein, either as single antigen or displayed on the surface of virosomes, was confirmed by ELISA, with binding of ACE2 receptor, pan-SARS antibody CR3022 and neutralizing antibodies to the various epitope clusters on the S protein. Binding capacity was also maintained on virosomes-S stored at 4 °C for 1 month. This work demonstrates the potential of using IC-BEVS to produce the highly glycosylated and complex S protein, without compromising its integrity and antigenicity, to be included in a virosome-based COVID-19 vaccine candidate

A produção científica sobre inovação: análise da base SciELO no período de 2005 a 2012

This article reviewed the scientific literature on innovation recorded and made available in the basis SciELO for the period 2005-2012. The government speeches of recent years have highlighted the need for innovation as a path for industry growth and for national competitiveness. Initiatives such as the implementation of the Technological Innovation Survey, whose first edition took place in 2000, the recognition of the Center for Management and Strategic Studies under the Ministry of Science, Technology and more recently including Innovation as a locus of reflection and guidance for national technology strategy in 2002, the creation of the FINEP innovation Award, among many other initiatives provide a picture of the importance of this research in our times. Being the scientific area a diffuser of new knowledge and SciELO a base of qualified and multidisciplinary data, this article takes SciELO as a reference to examine the characteristics of published studies related to innovation. Thus, it is a qualitative, documentary research, with the delineation of a bibliometric study. The survey results identified 213 journals with 604 publications that include the term “innovation” among the keywords. Research findings indicates that the areas which a wider approach in Innovation are respectively: Innovation in Medicine and Health, 33%; Innovation in Administration, Accounting and Economics, 30%; areas focused on overall innovation, 20%; Innovation in Technology and Products Development, 13%, studies on innovation in other areas, 4%. The results of this research contribute to increase the knowledge about the literature generated, to examine the diffusion of concepts and to establish a route by which the subject “innovation” travels in different areas of knowledge.Keywords: innovation, bibliometric research, scientific production.Este artigo analisou a produção científica sobre inovação registrada e disponibilizada na base SciELO no período de 2005 a 2012. Os discursos governamentais dos últimos anos têm destacado a inovação como um caminho necessário para o crescimento da indústria e da competitividade nacional. Iniciativas como a implantação da Pesquisa de Inovação Tecnológica, cuja primeira edição ocorreu em 2000; o reconhecimento do Centro de Gestão e Estudos Estratégicos, vinculado ao Ministério de Ciência, Tecnologia e, mais recentemente, Inovação, como um lócus de reflexão e de orientação da estratégia tecnológica nacional em 2002; a criação do Prêmio FINEP de inovação, entre várias outras iniciativas, oferecem um quadro da importância e da contemporaneidade desta pesquisa. Sendo a área científica um difusor de novos conhecimentos e sendo a SciELO uma base de dados qualificada e multidisciplinar, este artigo a toma como referência para examinar as características dos trabalhos publicados relacionados à inovação. Dessa forma, trata-se de uma pesquisa qualitativa, documental, com delineamento de estudo bibliométrico. O resultado da pesquisa identificou 213 periódicos com 604 publicações que incluem em suas palavras-chave o termo “inovação”. Verificou-se que as áreas de maior investigação sobre o tema são: inovação em Medicina e Saúde, 33%; inovação em Administração, Contabilidade e Economia, 30%; enfoque especializado sobre inovação, 20%; inovação em Tecnologia e Produtos, 13%; estudos sobre inovação em outras áreas, 4%. Os resultados desta pesquisa contribuem para aumentar o conhecimento sobre a literatura gerada, examinar como os conceitos vêm sendo difundidos e estabelecer uma rota pela qual o tema “inovação” trafega nas diferentes áreas do conhecimento.Palavras-chave: inovação, pesquisa bibliométrica,produção científica

COCRIANDO VALOR NA AMAZÔNIA BRASILEIRA POR MEIO DO COMPARTILHAMENTO: ESTUDO NA CADEIA DO AÇAÍ FAIR TRADE

O objetivo desta pesquisa foi analisar o processo de cocriação de valor na cadeia do açaí fair trade e os benefícios gerados para os cooperados da Cooperativa Agroextrativista Veneza do Marajó. Esta é uma pesquisa descritiva de natureza quantitativa, nesse sentido, as técnicas usadas foram: qui-quadrado de ajustamento, teste de correlação e o teste T-Student. Os cooperados que participaram da pesquisa foram 15; para a análise dos dados utilizou-se o SPSS e o SCRIPT em R. Como resultado, destaca-se que, por meio da integração e compartilhamento de recursos físicos e estruturais da cooperativa, associados às competências individuais dos cooperado e à consultoria técnica do SEBRAE, conseguiram cocriar valor, o que teve como consequência a obtenção do selo fair trade. Assim, pode-se inferir que o processo de certificação pode ter sido o maior ponto de cocriação e no qual os extrativistas cooperados perceberam de fato um valor adicional, pois o açaí certificado é vendido com um ágil de 30% em relação ao produto não certificado. Além do ganho econômico, destaca-se o ganho ambiental contemplado pela ação da cocriação, os quais geraram benefícios à comunidade marajoara