Remodeling of the malaria parasite and host human red cell by vesicle amplification that induces artemisinin resistance

Artemisinin resistance threatens worldwide malaria control and elimination. Elevation of phosphatidylinositol-3-phosphate (PI3P) can induce resistance in blood stages of Plasmodium falciparum The parasite unfolded protein response (UPR) has also been implicated as a proteostatic mechanism that may diminish artemisinin-induced toxic proteopathy. How PI3P acts and its connection to the UPR remain unknown, although both are conferred by mutation in P falciparum Kelch13 (K13), the marker of artemisinin resistance. Here we used cryoimmunoelectron microscopy to show that K13 concentrates at PI3P tubules/vesicles of the parasite's endoplasmic reticulum (ER) in infected red cells. K13 colocalizes and copurifies with the major virulence adhesin PfEMP1. The PfEMP1-K13 proteome is comprehensively enriched in multiple proteostasis systems of protein export, quality control, and folding in the ER and cytoplasm and UPR. Synthetic elevation of PI3P that induces resistance in absence of K13 mutation also yields signatures of proteostasis and clinical resistance. These findings imply a key role for PI3P-vesicle amplification as a mechanism of resistance of infected red cells. As validation, the major resistance mutation K13C580Y quantitatively increased PI3P tubules/vesicles, exporting them throughout the parasite and the red cell. Chemical inhibitors and fluorescence microscopy showed that alterations in PfEMP1 export to the red cell and cytoadherence of infected cells to a host endothelial receptor are features of multiple K13 mutants. Together these data suggest that amplified PI3P vesicles disseminate widespread proteostatic capacity that may neutralize artemisinins toxic proteopathy and implicate a role for the host red cell in artemisinin resistance. The mechanistic insights generated will have an impact on malaria drug development

A molecular mechanism of artemisinin resistance in Plasmodium falciparum malaria

Artemisinins are the cornerstone of anti-malarial drugs. Emergence and spread of resistance to them raises risk of wiping out recent gains achieved in reducing worldwide malaria burden and threatens future malaria control and elimination on a global level. Genome-wide association studies (GWAS) have revealed parasite genetic loci associated with artemisinin resistance. However, there is no consensus on biochemical targets of artemisinin. Whether and how these targets interact with genes identified by GWAS, remains unknown. Here we provide biochemical and cellular evidence that artemisinins are potent inhibitors of Plasmodium falciparum phosphatidylinositol-3-kinase (PfPI3K), revealing an unexpected mechanism of action. In resistant clinical strains, increased PfPI3K was associated with the C580Y mutation in P. falciparum Kelch13 (PfKelch13), a primary marker of artemisinin resistance. Polyubiquitination of PfPI3K and its binding to PfKelch13 were reduced by the PfKelch13 mutation, which limited proteolysis of PfPI3K and thus increased levels of the kinase, as well as its lipid product phosphatidylinositol-3-phosphate (PI3P). We find PI3P levels to be predictive of artemisinin resistance in both clinical and engineered laboratory parasites as well as across non-isogenic strains. Elevated PI3P induced artemisinin resistance in absence of PfKelch13 mutations, but remained responsive to regulation by PfKelch13. Evidence is presented for PI3P-dependent signalling in which transgenic expression of an additional kinase confers resistance. Together these data present PI3P as the key mediator of artemisinin resistance and the sole PfPI3K as an important target for malaria elimination

Biochemical, functional and structural characterization of the Plasmodium falciparum site specific recombinase Pf-Int

Plasmodium falciparum est un parasite protozoaire responsable de la forme la plus sévère de la malaria. Depuis quelques années, les cas de résistance aux antipaludiques sont devenus de plus en plus fréquents et de plus en plus répandus. En plus de sa résistance aux drogues actuellement disponibles, ce parasite reste jusqu' à aujourd'hui réfractaire aux vaccinations. L’identification de nouvelles approches basées sur l`inhibition spécifique de certaines de ses cibles moléculaires vitales est devenue une nécessité. La recombinase à site spécifique de P. falciparum (Pf-Int) est un enzyme qui a été récemment identifié dans le laboratoire à partir de PlasmoDB. Cette recombinase à site spécifique joue potentiellement un rôle clé dans le système de recombinaison nécessaire à la viabilité du parasite. Cette protéine de 490 acides aminés, soit ~57 kDa, contient une région C-terminale qui porte les résidus conservés du site catalytique des recombinases à tyrosine R-H-K-R-(H/W)-Y. La prédiction montre une région N-terminale qui ressemble à celle de l’intégrase du phage lambda avec un mélange de structures secondaires α et β.Lors de ces travaux, nous avons d’abord montré par RT-PCR que le gène (MAL13P1.42) qui code pour PF-Int est transcrit pendant le cycle intra-érythrocytaire avec un maximum pendant la phase schizont. Nous avons ensuite essayé de montrer l`implication de Pf-Int dans le cycle parasitaire. Ceci a été réalisé grâce à un parasite (KO: knock-out) dont le gène Pf-Int a été invalidé. Ces analyses montrent que Pf-Int n'a aucun impact apparent sur le cycle de développement intra-érythrocytaire du parasite, en particulier sur la durée du cycle et le taux de croissance. Au niveau moléculaire, nous avons également procédé à la production d'anticorps anti-Pf-Int en utilisant le fragment C-162 (Résidus 162-490). La comparaison des profils de marquage, par cet anticorps, des extraits protéiques du KO et du parasite sauvage par la technique de Western blot n'a pas permis d'identifier la protéine endogène dans le parasite sauvage. Dans le but de déterminer la localisation sub-cellulaire de Pf-Int, nous avons réalisé des essais de sur-expression de différentes protéines de fusion dans le parasite. Nous avons essayé de déterminer l’impact de trois codons d’initiation différents ainsi que l’impact de la présence de la région N-terminale (1-190aa) de Pf-Int sur sa localisation subcellulaire en utilisant une chimère entre la partie N-terminale et la protéine GFP. Lors de ces travaux, nous avons réussi à sur-exprimer différentes régions de Pf-Int sous forme recombinante dans E. coli. Nous l’avons d’abord caractérisé par des études biophysiques. Ainsi nous avons pu déterminer, par dichroïsme circulaire (CD), le contenu en structures secondaires de Pf-Int, qui est proche de celui des autres membres de la même famille. Nous avons également démontré sa stabilité par CD couplé à la dénaturation thermique. Le spectre RMN-1D a aussi pu être enregistré. La troisième partie de nos travaux a concerné l’identification des cibles ADN de Pf-Int. Deux stratégies de recherche de cibles par affinité ont été utilisées au laboratoire en utilisant une première bibliothèque de séquences synthétisées chimiquement et une deuxième bibliothèque formée de fragments d’ADN génomique de P. falciparum. Ces deux approches ont permis l’identification de deux séries de cibles ADN. Grace aux cibles ADN identifiées, nous avons pu démontrer l’interaction de différents fragments de Pf-Int avec ces cibles par des expériences de retard sur gel natif (EMSA). Nous avons aussi pu démontrer que les protéines recombinantes sont actives in vitro. En effet, ces dernières sont capables de former des complexes covalents en présence de l’ADN cible. La conservation de la protéine, ainsi que son expression différentielle nous laisse à penser que son rôle est certes loin d’être élucidé, mais que Pf-Int reste une cible potentielle pour P. falciparum.Plasmodium falciparum is a protozoan parasite responsible for the most severe form of malaria. In recent years, cases of resistance to antimalarial drugs have become increasingly frequent and common. In addition to its resistance to drugs currently available, there is no vaccine available against this parasite till now. The identification of new approaches based on the specific inhibition of some of its molecular targets has become vital.The identification of the Pf-Int site specific recombinase in Plasmodium falciparum by analysis of PlasmoDB is a new opportunity to study the role of genetic variation in this parasite as it needs to adapt to its hosts. This ~ 57 kDa protein contains a C-terminal domain carrying the putative tyrosine recombinase conserved active site residues R-H-K-R-(H/W)-Y, an N-terminus with a predicted alpha-helical bundle and a mixed alpha-beta domain resembling Lambda-Int. Here, we show that the sequence is highly conserved among members of the Plasmodia. It is expressed differentially during distinct life stages as estimated by RT-PCR, namely with a peak in the schizont phase. We then tried to show the involvement of Pf-Int in the parasitic cycle. We were able to create a parasite where the Pf-Int gene was knocked-out. The comparison test showed that Pf-Int has apparently no impact on the intraerythrocytic developmental cycle of the parasite, particularly in the cycle length and the growth rate.At the molecular level, we produced two sets of anti-Pf-Int antibodies using the purified recombinant fragment C-162 (residues 162-490). Comparison of protein extracts from KO and wild parasite by Western blot technique using our antibody has failed to identify the endogenous protein in the wild type parasite.We also tried to determine the subcellular localization of Pf-Int and the role of possible alternate initiation codons by over-expressing different constructs in the parasite Plasmodium falciparum. In order to determine the impact of the N-terminal region (1-190aa) of Pf-Int on its subcellular localization, we also created a chimeric protein using a fusion of Pf-Int(1-190aa) with the GFP. We successfully expressed a variety of the recombinant form of Pf-Int in E. coli. We have first determined its secondary structure content by circular dichroism (CD) and its solution stability by thermal denaturation-CD. An 1-D NMR spectrum was also recorded. The third part of our work has involved the identification of the DNA targets of Pf-Int. Two search strategies conducted in the laboratory using a library of chemically synthesized sequences and a second library made of fragments of genomic DNA of P. falciparum. Both approaches have allowed the identification of two sets of target DNA. Secondly, electrophoretic mobility shift assays (EMSA) were used to show its affinity and specificity for DNA. The recombinant proteins were shown to be functional as they form a covalent complex with DNA. Thus Pf-Int could be a potential agent that binds to and alters DNA, either in a specific or in random fashion. Its conservation and differential expression leads us to conclude that although its role is far from being understood, Pf-Int remains a key target for P. falciparum

Caractérisation biochimique, fonctionnelle et structurale de l'integrase Pf-Int de plasmodium

Plasmodium falciparum is a protozoan parasite responsible for the most severe form of malaria. In recent years, cases of resistance to antimalarial drugs have become increasingly frequent and common. In addition to its resistance to drugs currently available, there is no vaccine available against this parasite till now. The identification of new approaches based on the specific inhibition of some of its molecular targets has become vital.The identification of the Pf-Int site specific recombinase in Plasmodium falciparum by analysis of PlasmoDB is a new opportunity to study the role of genetic variation in this parasite as it needs to adapt to its hosts. This ~ 57 kDa protein contains a C-terminal domain carrying the putative tyrosine recombinase conserved active site residues R-H-K-R-(H/W)-Y, an N-terminus with a predicted alpha-helical bundle and a mixed alpha-beta domain resembling Lambda-Int. Here, we show that the sequence is highly conserved among members of the Plasmodia. It is expressed differentially during distinct life stages as estimated by RT-PCR, namely with a peak in the schizont phase. We then tried to show the involvement of Pf-Int in the parasitic cycle. We were able to create a parasite where the Pf-Int gene was knocked-out. The comparison test showed that Pf-Int has apparently no impact on the intraerythrocytic developmental cycle of the parasite, particularly in the cycle length and the growth rate.At the molecular level, we produced two sets of anti-Pf-Int antibodies using the purified recombinant fragment C-162 (residues 162-490). Comparison of protein extracts from KO and wild parasite by Western blot technique using our antibody has failed to identify the endogenous protein in the wild type parasite.We also tried to determine the subcellular localization of Pf-Int and the role of possible alternate initiation codons by over-expressing different constructs in the parasite Plasmodium falciparum. In order to determine the impact of the N-terminal region (1-190aa) of Pf-Int on its subcellular localization, we also created a chimeric protein using a fusion of Pf-Int(1-190aa) with the GFP. We successfully expressed a variety of the recombinant form of Pf-Int in E. coli. We have first determined its secondary structure content by circular dichroism (CD) and its solution stability by thermal denaturation-CD. An 1-D NMR spectrum was also recorded. The third part of our work has involved the identification of the DNA targets of Pf-Int. Two search strategies conducted in the laboratory using a library of chemically synthesized sequences and a second library made of fragments of genomic DNA of P. falciparum. Both approaches have allowed the identification of two sets of target DNA. Secondly, electrophoretic mobility shift assays (EMSA) were used to show its affinity and specificity for DNA. The recombinant proteins were shown to be functional as they form a covalent complex with DNA. Thus Pf-Int could be a potential agent that binds to and alters DNA, either in a specific or in random fashion. Its conservation and differential expression leads us to conclude that although its role is far from being understood, Pf-Int remains a key target for P. falciparum.Plasmodium falciparum est un parasite protozoaire responsable de la forme la plus sévère de la malaria. Depuis quelques années, les cas de résistance aux antipaludiques sont devenus de plus en plus fréquents et de plus en plus répandus. En plus de sa résistance aux drogues actuellement disponibles, ce parasite reste jusqu' à aujourd'hui réfractaire aux vaccinations. L’identification de nouvelles approches basées sur l`inhibition spécifique de certaines de ses cibles moléculaires vitales est devenue une nécessité. La recombinase à site spécifique de P. falciparum (Pf-Int) est un enzyme qui a été récemment identifié dans le laboratoire à partir de PlasmoDB. Cette recombinase à site spécifique joue potentiellement un rôle clé dans le système de recombinaison nécessaire à la viabilité du parasite. Cette protéine de 490 acides aminés, soit ~57 kDa, contient une région C-terminale qui porte les résidus conservés du site catalytique des recombinases à tyrosine R-H-K-R-(H/W)-Y. La prédiction montre une région N-terminale qui ressemble à celle de l’intégrase du phage lambda avec un mélange de structures secondaires α et β.Lors de ces travaux, nous avons d’abord montré par RT-PCR que le gène (MAL13P1.42) qui code pour PF-Int est transcrit pendant le cycle intra-érythrocytaire avec un maximum pendant la phase schizont. Nous avons ensuite essayé de montrer l`implication de Pf-Int dans le cycle parasitaire. Ceci a été réalisé grâce à un parasite (KO: knock-out) dont le gène Pf-Int a été invalidé. Ces analyses montrent que Pf-Int n'a aucun impact apparent sur le cycle de développement intra-érythrocytaire du parasite, en particulier sur la durée du cycle et le taux de croissance. Au niveau moléculaire, nous avons également procédé à la production d'anticorps anti-Pf-Int en utilisant le fragment C-162 (Résidus 162-490). La comparaison des profils de marquage, par cet anticorps, des extraits protéiques du KO et du parasite sauvage par la technique de Western blot n'a pas permis d'identifier la protéine endogène dans le parasite sauvage. Dans le but de déterminer la localisation sub-cellulaire de Pf-Int, nous avons réalisé des essais de sur-expression de différentes protéines de fusion dans le parasite. Nous avons essayé de déterminer l’impact de trois codons d’initiation différents ainsi que l’impact de la présence de la région N-terminale (1-190aa) de Pf-Int sur sa localisation subcellulaire en utilisant une chimère entre la partie N-terminale et la protéine GFP. Lors de ces travaux, nous avons réussi à sur-exprimer différentes régions de Pf-Int sous forme recombinante dans E. coli. Nous l’avons d’abord caractérisé par des études biophysiques. Ainsi nous avons pu déterminer, par dichroïsme circulaire (CD), le contenu en structures secondaires de Pf-Int, qui est proche de celui des autres membres de la même famille. Nous avons également démontré sa stabilité par CD couplé à la dénaturation thermique. Le spectre RMN-1D a aussi pu être enregistré. La troisième partie de nos travaux a concerné l’identification des cibles ADN de Pf-Int. Deux stratégies de recherche de cibles par affinité ont été utilisées au laboratoire en utilisant une première bibliothèque de séquences synthétisées chimiquement et une deuxième bibliothèque formée de fragments d’ADN génomique de P. falciparum. Ces deux approches ont permis l’identification de deux séries de cibles ADN. Grace aux cibles ADN identifiées, nous avons pu démontrer l’interaction de différents fragments de Pf-Int avec ces cibles par des expériences de retard sur gel natif (EMSA). Nous avons aussi pu démontrer que les protéines recombinantes sont actives in vitro. En effet, ces dernières sont capables de former des complexes covalents en présence de l’ADN cible. La conservation de la protéine, ainsi que son expression différentielle nous laisse à penser que son rôle est certes loin d’être élucidé, mais que Pf-Int reste une cible potentielle pour P. falciparum

Caractérisation biochimique, fonctionnelle et structurale de l'integrase Pf-Int de plasmodium.

Plasmodium falciparum est un parasite protozoaire responsable de la forme la plus sévère de la malaria. Depuis quelques années, les cas de résistance aux antipaludiques sont devenus de plus en plus fréquents et de plus en plus répandus. En plus de sa résistance aux drogues actuellement disponibles, ce parasite reste jusqu' à aujourd'hui réfractaire aux vaccinations. L identification de nouvelles approches basées sur linhibition spécifique de certaines de ses cibles moléculaires vitales est devenue une nécessité. La recombinase à site spécifique de P. falciparum (Pf-Int) est un enzyme qui a été récemment identifié dans le laboratoire à partir de PlasmoDB. Cette recombinase à site spécifique joue potentiellement un rôle clé dans le système de recombinaison nécessaire à la viabilité du parasite. Cette protéine de 490 acides aminés, soit ~57 kDa, contient une région C-terminale qui porte les résidus conservés du site catalytique des recombinases à tyrosine R-H-K-R-(H/W)-Y. La prédiction montre une région N-terminale qui ressemble à celle de l intégrase du phage lambda avec un mélange de structures secondaires a et b.Lors de ces travaux, nous avons d abord montré par RT-PCR que le gène (MAL13P1.42) qui code pour PF-Int est transcrit pendant le cycle intra-érythrocytaire avec un maximum pendant la phase schizont. Nous avons ensuite essayé de montrer limplication de Pf-Int dans le cycle parasitaire. Ceci a été réalisé grâce à un parasite (KO: knock-out) dont le gène Pf-Int a été invalidé. Ces analyses montrent que Pf-Int n'a aucun impact apparent sur le cycle de développement intra-érythrocytaire du parasite, en particulier sur la durée du cycle et le taux de croissance. Au niveau moléculaire, nous avons également procédé à la production d'anticorps anti-Pf-Int en utilisant le fragment C-162 (Résidus 162-490). La comparaison des profils de marquage, par cet anticorps, des extraits protéiques du KO et du parasite sauvage par la technique de Western blot n'a pas permis d'identifier la protéine endogène dans le parasite sauvage. Dans le but de déterminer la localisation sub-cellulaire de Pf-Int, nous avons réalisé des essais de sur-expression de différentes protéines de fusion dans le parasite. Nous avons essayé de déterminer l impact de trois codons d initiation différents ainsi que l impact de la présence de la région N-terminale (1-190aa) de Pf-Int sur sa localisation subcellulaire en utilisant une chimère entre la partie N-terminale et la protéine GFP. Lors de ces travaux, nous avons réussi à sur-exprimer différentes régions de Pf-Int sous forme recombinante dans E. coli. Nous l avons d abord caractérisé par des études biophysiques. Ainsi nous avons pu déterminer, par dichroïsme circulaire (CD), le contenu en structures secondaires de Pf-Int, qui est proche de celui des autres membres de la même famille. Nous avons également démontré sa stabilité par CD couplé à la dénaturation thermique. Le spectre RMN-1D a aussi pu être enregistré. La troisième partie de nos travaux a concerné l identification des cibles ADN de Pf-Int. Deux stratégies de recherche de cibles par affinité ont été utilisées au laboratoire en utilisant une première bibliothèque de séquences synthétisées chimiquement et une deuxième bibliothèque formée de fragments d ADN génomique de P. falciparum. Ces deux approches ont permis l identification de deux séries de cibles ADN. Grace aux cibles ADN identifiées, nous avons pu démontrer l interaction de différents fragments de Pf-Int avec ces cibles par des expériences de retard sur gel natif (EMSA). Nous avons aussi pu démontrer que les protéines recombinantes sont actives in vitro. En effet, ces dernières sont capables de former des complexes covalents en présence de l ADN cible. La conservation de la protéine, ainsi que son expression différentielle nous laisse à penser que son rôle est certes loin d être élucidé, mais que Pf-Int reste une cible potentielle pour P. falciparum.Plasmodium falciparum is a protozoan parasite responsible for the most severe form of malaria. In recent years, cases of resistance to antimalarial drugs have become increasingly frequent and common. In addition to its resistance to drugs currently available, there is no vaccine available against this parasite till now. The identification of new approaches based on the specific inhibition of some of its molecular targets has become vital.The identification of the Pf-Int site specific recombinase in Plasmodium falciparum by analysis of PlasmoDB is a new opportunity to study the role of genetic variation in this parasite as it needs to adapt to its hosts. This ~ 57 kDa protein contains a C-terminal domain carrying the putative tyrosine recombinase conserved active site residues R-H-K-R-(H/W)-Y, an N-terminus with a predicted alpha-helical bundle and a mixed alpha-beta domain resembling Lambda-Int. Here, we show that the sequence is highly conserved among members of the Plasmodia. It is expressed differentially during distinct life stages as estimated by RT-PCR, namely with a peak in the schizont phase. We then tried to show the involvement of Pf-Int in the parasitic cycle. We were able to create a parasite where the Pf-Int gene was knocked-out. The comparison test showed that Pf-Int has apparently no impact on the intraerythrocytic developmental cycle of the parasite, particularly in the cycle length and the growth rate.At the molecular level, we produced two sets of anti-Pf-Int antibodies using the purified recombinant fragment C-162 (residues 162-490). Comparison of protein extracts from KO and wild parasite by Western blot technique using our antibody has failed to identify the endogenous protein in the wild type parasite.We also tried to determine the subcellular localization of Pf-Int and the role of possible alternate initiation codons by over-expressing different constructs in the parasite Plasmodium falciparum. In order to determine the impact of the N-terminal region (1-190aa) of Pf-Int on its subcellular localization, we also created a chimeric protein using a fusion of Pf-Int(1-190aa) with the GFP. We successfully expressed a variety of the recombinant form of Pf-Int in E. coli. We have first determined its secondary structure content by circular dichroism (CD) and its solution stability by thermal denaturation-CD. An 1-D NMR spectrum was also recorded. The third part of our work has involved the identification of the DNA targets of Pf-Int. Two search strategies conducted in the laboratory using a library of chemically synthesized sequences and a second library made of fragments of genomic DNA of P. falciparum. Both approaches have allowed the identification of two sets of target DNA. Secondly, electrophoretic mobility shift assays (EMSA) were used to show its affinity and specificity for DNA. The recombinant proteins were shown to be functional as they form a covalent complex with DNA. Thus Pf-Int could be a potential agent that binds to and alters DNA, either in a specific or in random fashion. Its conservation and differential expression leads us to conclude that although its role is far from being understood, Pf-Int remains a key target for P. falciparum.PARIS11-SCD-Bib. électronique (914719901) / SudocSudocFranceF

Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system

International audienceGenome manipulation in the malaria parasite Plasmodium falciparum remains largely intractable and improved genomic tools are needed to further understand pathogenesis and drug resistance. We demonstrated the CRISPR-Cas9 system for use in P. falciparum by disrupting chromosomal loci and generating marker-free, single-nucleotide substitutions with high efficiency. Additionally, an artemisinin-resistant strain was generated by introducing a previously implicated polymorphism, thus illustrating the value of efficient genome editing in malaria research

Discovery of a novel and conserved Plasmodium falciparum exported protein that is important for adhesion of PfEMP1 at the surface of infected erythrocytes

International audiencePlasmodium falciparum virulence is linked to its ability to sequester in post-capillary venules in the human host. Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 (PfEMP1) is the main variant surface antigen implicated in this process. Complete loss of parasite adhesion is linked to a large subtelomeric deletion on chromosome 9 in a number of laboratory strains such as D10 and T9-96. Similar to the cytoadherent reference line FCR3, D10 strain expresses PfEMP1 on the surface of parasitized erythrocytes, however without any detectable cytoadhesion. To investigate which of the deleted subtelomeric genes may be implicated in parasite adhesion, we selected 12 genes for D10 complementation studies that are predicted to code for proteins exported to the red blood cell. We identified a novel single copy gene (PF3D7_0936500) restricted to P. falciparum that restores adhesion to CD36, termed here virulence-associated protein 1 (Pfvap1). Protein knockdown and gene knockout experiments confirmed a role of PfVAP1 in the adhesion process in FCR3 parasites. PfVAP1 is co-exported with PfEMP1 into the host cell via vesicle-like structures called Maurer's clefts. This study identifies a novel highly conserved parasite molecule that contributes to parasite virulence possibly by assisting PfEMP1 to establish functional adhesion at the host cell surface

First efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Leishmania parasites

Protozoan pathogens that cause leishmaniasis in humans are relatively refractory to genetic manipulation. In this work, we implemented the CRISPR‐Cas9 system in Leishmania parasites and demonstrated its efficient use for genome editing. The Cas9 endonuclease was expressed under the control of the Dihydrofolate Reductase‐Thymidylate Synthase (DHFR‐TS) promoter and the single guide RNA was produced under the control of the U6snRNA promoter and terminator. As a proof of concept, we chose to knockout a tandemly repeated gene family, the paraflagellar rod‐2 locus. We were able to obtain null mutants in a single round of transfection. In addition, we confirmed the absence of off‐target editions by whole genome sequencing of two independent clones. Our work demonstrates that CRISPR‐Cas9‐mediated gene knockout represents a major improvement in comparison with existing methods. Beyond gene knockout, this genome editing tool opens avenues for a multitude of functional studies to speed up research on leishmaniasis

Initial Characterization of the Pf-Int Recombinase from the Malaria Parasite <em>Plasmodium falciparum</em>

<div><h3>Background</h3><p>Genetic variation is an essential means of evolution and adaptation in many organisms in response to environmental change. Certain DNA alterations can be carried out by site-specific recombinases (SSRs) that fall into two families: the serine and the tyrosine recombinases. SSRs are seldom found in eukaryotes. A gene homologous to a tyrosine site-specific recombinase has been identified in the genome of <em>Plasmodium falciparum</em>. The sequence is highly conserved among five other members of Plasmodia.</p> <h3>Methodology/Principal Findings</h3><p>The predicted open reading frame encodes for a ∼57 kDa protein containing a C-terminal domain including the putative tyrosine recombinase conserved active site residues R-H-R-(H/W)-Y. The N-terminus has the typical alpha-helical bundle and potentially a mixed alpha-beta domain resembling that of λ-Int. Pf-Int mRNA is expressed differentially during the <em>P. falciparum</em> erythrocytic life stages, peaking in the schizont stage. Recombinant Pf-Int and affinity chromatography of DNA from genomic or synthetic origin were used to identify potential DNA targets after sequencing or micro-array hybridization. Interestingly, the sequences captured also included highly variable subtelomeric genes such as <em>var</em>, <em>rif</em>, and <em>stevor</em> sequences. Electrophoretic mobility shift assays with DNA were carried out to verify Pf-Int/DNA binding. Finally, Pf-Int knock-out parasites were created in order to investigate the biological role of Pf-Int.</p> <h3>Conclusions/Significance</h3><p>Our data identify for the first time a malaria parasite gene with structural and functional features of recombinases. Pf-Int may bind to and alter DNA, either in a sequence specific or in a non-specific fashion, and may contribute to programmed or random DNA rearrangements. Pf-Int is the first molecular player identified with a potential role in genome plasticity in this pathogen. Finally, Pf-Int knock-out parasite is viable showing no detectable impact on blood stage development, which is compatible with such function.</p> </div