Multiplexed pancreatic genome engineering and cancer induction by transfection-based CRISPR/Cas9 delivery in mice

Mouse transgenesis has provided fundamental insights into pancreatic cancer, but is limited by the long duration of allele/model generation. Here we show transfection-based multiplexed delivery of CRISPR/Cas9 to the pancreas of adult mice, allowing simultaneous editing of multiple gene sets in individual cells. We use the method to induce pancreatic cancer and exploit CRISPR/Cas9 mutational signatures for phylogenetic tracking of metastatic disease. Our results demonstrate that CRISPR/Cas9-multiplexing enables key applications, such as combinatorial gene-network analysis, in vivo synthetic lethality screening and chromosome engineering. Negative-selection screening in the pancreas using multiplexed-CRISPR/Cas9 confirms the vulnerability of pancreatic cells to Brca2-inactivation in a Kras-mutant context. We also demonstrate modelling of chromosomal deletions and targeted somatic engineering of inter-chromosomal translocations, offering multifaceted opportunities to study complex structural variation, a hallmark of pancreatic cancer. The low-frequency mosaic pattern of transfection-based CRISPR/Cas9 delivery faithfully recapitulates the stochastic nature of human tumorigenesis, supporting wide applicability for biological/preclinical research

Multiplexed pancreatic genome engineering and cancer induction by transfection-based CRISPR/Cas9 delivery in mice.

Mouse transgenesis has provided fundamental insights into pancreatic cancer, but is limited by the long duration of allele/model generation. Here we show transfection-based multiplexed delivery of CRISPR/Cas9 to the pancreas of adult mice, allowing simultaneous editing of multiple gene sets in individual cells. We use the method to induce pancreatic cancer and exploit CRISPR/Cas9 mutational signatures for phylogenetic tracking of metastatic disease. Our results demonstrate that CRISPR/Cas9-multiplexing enables key applications, such as combinatorial gene-network analysis, in vivo synthetic lethality screening and chromosome engineering. Negative-selection screening in the pancreas using multiplexed-CRISPR/Cas9 confirms the vulnerability of pancreatic cells to Brca2-inactivation in a Kras-mutant context. We also demonstrate modelling of chromosomal deletions and targeted somatic engineering of inter-chromosomal translocations, offering multifaceted opportunities to study complex structural variation, a hallmark of pancreatic cancer. The low-frequency mosaic pattern of transfection-based CRISPR/Cas9 delivery faithfully recapitulates the stochastic nature of human tumorigenesis, supporting wide applicability for biological/preclinical research

A functional characterisation of early endosomal SNARE-proteins

Ein Großteil des intrazellulären Transports erfolgt über das Abschnüren, den Transport und die anschließende Fusion von Vesikeln, wobei dieser letzte Schritt von SNARE-Proteinen bewerkstelligt wird. Neben deren Funktion in der Fusion wird schon seit einiger Zeit auch über eine Beteiligung an dem, der Fusion vorausgehenden Prozess des Docking, d.h. der stabilen Verknüpfung der Organellen spekuliert. Diese Frage wurde in der vorliegenden Arbeit an frühen Endosomen untersucht. Frühe Endosomen bilden ein zentrales Sortierungskompartiment, in dem die meisten Endozytoserouten zusammenlaufen und können untereinander fusionieren, was sie zu einem viel genutzten Modellsystem gemacht hat. Um den Einfluss der SNARE-Proteine auf das Docking von frühen Endosomen analysieren zu können, musste zunächst ein geeignetes Assay entwickelt werden, da sich das für das vakuoläre System bekannte Aggregationsassay als nicht geeignet herausstellte. Mit dem neuen Assay konnte gezeigt werden, dass zwar EEA1 und Rab5 wie erwartet wichtig für das Docking von frühen Endosomen sind, dass dieses aber von einer SNARE-Funktion unabhängig ist, da weder das Verhindern der SNARE-Aktivierung durch mutiertes alphaSNAP, noch die Zugabe von löslichen SNARE-Fragmenten oder gegen die SNAREs gerichteter Fab-Fragmente einen großen Einfluss auf das Docking hatte, während die Fusion signifikant inhibiert wurde. Versuche, die SNARE-Regulation über die Rekonstitution der endosomalen SNAREs in Liposomen und anschließende Fusion mit frühen Endosomen zu analysieren, haben sich als sehr schwierig herausgestellt. Das Problem lag hierbei nicht etwa darin, dass keine Fusion erzielt worden wäre, sondern im Gegenteil daran, dass selbst proteinfreie Liposomen mit Endosomen fusionierten und zwar in vergleichbarem Umfang und praktisch identischer Kinetik wie SNARE-haltige Liposomen. Durch die Vergrößerung der Liposomen (und den dadurch reduzierte Krümmungsstress) stieg die Spezifität der Reaktion etwas an, so dass Proteoliposomen doppelt so stark mit Endosomen fusionierten wie proteinfreie Liposomen. Der vielversprechendste Weg scheint jedoch ein top-down Ansatz zu sein, d.h. Endosomen zu solubilisieren, einzelne Proteine über Immundepletion aus dieser Mischung zu entfernen und aus den verbleibenden Proteinen und Lipiden ueber Detergenzentfernug Proteoliposomen mit sehr endosomenähnlicher Zusammensetzung zu erzeugen. Für das Docking und die Fusion von Endosomen ist das Zusammenwirken von zahlreichen Faktoren erforderlich, welche in der Regel in spezialisierten Membrandomänen konzentriert vorliegen. Die Regulation dieser Domänen ist jedoch noch weitgehend unklar und wurde daher im letzten Teil der vorliegenden Arbeit für SNAREs und Synaptophysin untersucht. Bisher war es aufgrund der geringen Größe von Endosomen (ungefähr 200 nm Durchmesser) sehr schwer, Aussagen über unterschiedliche endosomale Domänen zu treffen, da sie im Bereich der Auflösungsgrenze konventioneller Lichtmikroskopie liegen. Für die vorliegende Studie konnte jedoch auf die neuentwickelte STED-Mikroskopie zurückgegriffen werden, wobei das verwendete kommerziell erhältliche Gerät eine Auflösung von 70-90 nm besitzt und die endosomale Membran dadurch einer Analyse zugänglich machte. Das im zweiten Abschnitt gewonnene Wissen über die Fusion von Liposomen mit Endosomen konnte hier genutzt werden, um über diese Fusion die Lip! idzusammensetzung der Endosomen zu verändern. Allerdings führten weder erhöhte Cholesterinkonzentrationen noch die Zufuhr von PI und PIP2 zu einer Veränderung in der Zahl der Cluster, was auf eine relative Stabilität dieser hindeutet. Interessanterweise scheinen auch die als Membranorganisatoren ins Spiel gebrachten Rab-Proteine keineswegs essentiell für diese Domänen zu sein, da die Extraktion der Rab-Proteine durch GDI praktisch keinen Einfluss auf die Domänenanzahl der untersuchten Proteine hatte

IL7-IL12 Engineered Mesenchymal Stem Cells (MSCs) Improve A CAR T Cell Attack Against Colorectal Cancer Cells

Chimeric antigen receptor (CAR) redirected T cells are efficacious in the treatment of leukemia/lymphoma, however, showed less capacities in eliminating solid tumors which is thought to be partly due to the lack of cytokine support in the tumor lesion. In order to deliver supportive cytokines, we took advantage of the inherent ability of mesenchymal stem cells (MSCs) to actively migrate to tumor sites and engineered MSCs to release both IL7 and IL12 to promote homeostatic expansion and Th1 polarization. There is a mutual interaction between engineered MSCs and CAR T cells; in presence of CAR T cell released IFN-gamma and TNF-alpha, chronic inflammatory Th2 MSCs shifted towards a Th17/Th1 pattern with IL2 and IL15 release that mutually activated CAR T cells with extended persistence, amplification, killing and protection from activation induced cell death. MSCs releasing IL7 and IL12 were superior over non-modified MSCs in supporting the CAR T cell response and improved the anti-tumor attack in a transplant tumor model. Data demonstrate the first use of genetically modified MSCs as vehicles to deliver immuno-modulatory proteins to the tumor tissue in order to improve the efficacy of CAR T cells in the treatment of solid malignancies

Local Intracerebral Immunomodulation Using Interleukin-Expressing Mesenchymal Stem Cells in Glioblastoma

Purpose: Mesenchymal stem cells (MSCs) show an inherent brain tumor tropism that can be exploited for targeted delivery of therapeutic genes to invasive glioma. We assessed whether a motile MSC-based local immunomodulation is able to overcome the immunosuppressive glioblastoma microenvironment and to induce an antitumor immune response. Experimental Design: We genetically modified MSCs to coexpress high levels of IL12 and IL7 (MSCIL7/12, Apceth-301). Therapeutic efficacy was assessed in two immunocompetent orthotopic C57BL/6 glioma models using GL261 and CT2A. Immunomodulatory effects were assessed by multicolor flow cytometry to profile immune activation and exhaustion of tumor-infiltrating immune cells. Diversity of the tumor-specific immune response as analyzed using T-cell receptor sequencing. Results: Intratumoral administration of MSCIL7/12 induced significant tumor growth inhibition and remission of established intracranial tumors, as demonstrated by MR imaging. Notably, up to 50% of treated mice survived long-term. Rechallenging of survivors confirmed long-lasting tumor immunity. Local treatment with MSCIL7/12 was well tolerated and led to a significant inversion of the CD4(+)/CD8(+)n T-cell ratio with an intricate, predominantly CD8(+) effector T-cell-mediated antitumor response. T-cell receptor sequencing demonstrated an increased diversity of TILs in MSCIL7/12-treated mice, indicating a broader tumor-specific immune response with subsequent oligoclonal specification during generation of long-term immunity. Conclusions: Local MSC-based immunomodulation is able to efficiently alter the immunosuppressive microenvironment in glioblastoma. The long-lasting therapeutic effects warrant a rapid clinical translation of this concept and have led to planning of a phase I/II study of apceth-301 in recurrent glioblastoma

The invariant chain transports TNF family member CD70 to MHC class II compartments in dendritic cells

CD70 is a TNF-related transmembrane molecule expressed by mature dendritic cells (DCs), which present antigens to T cells via major histocompatibility complex (MHC) molecules. In DCs, CD70 localizes with MHC class II molecules in late endosomal vesicles, known as MHC class II compartments (MIICs). MIICs are transported to the immune synapse when a DC contacts an antigen-specific CD4(+) T cell. Consequently, MHC class II and CD70 are simultaneously exposed to the T cell. Thereby, T-cell activation via the antigen receptor and CD70-mediated co-stimulation are synchronized, apparently to optimize the proliferative response. We report here that the invariant chain (Ii), a chaperone known to transport MHC class II to MIICs, performs a similar function for CD70. CD70 was found to travel by default to the plasma membrane, whereas Ii coexpression directed it to late endosomes and/or lysosomes. In cells containing the MHC class II presentation pathway, CD70 localized to MIICs. This localization relied on Ii, since transport of CD70 from the Golgi to MIICs was impeded in Ii-deficient DCs. Biophysical and biochemical studies revealed that CD70 and Ii participate in an MHC-class-II-independent complex. Thus, Ii supports transport of both MHC class II and CD70 to MIICs and thereby coordinates their delivery to CD4(+) T cell

New Director of Campus Safety Appointed

Story at: http://digitalcommons.andrews.edu/campus-news/vol2015/iss5/14/https://digitalcommons.andrews.edu/campus-news-images/1093/thumbnail.jp