Modelos celulares de enfermedad mitocondrial causada por mutaciones en POLG

Las enfermedades mitocondriales constituyen un grupo de trastornos originados por una deficiente síntesis de ATP por el sistema OXPHOS. Mutaciones en la DNA polimerasa mitocondrial gamma (POLG), única DNA polimerasa mitocondrial humana conocida y esencial para la replicación y reparación del DNA mitocondrial, producen diversas enfermedades mitocondriales con manifestaciones clínicas muy heterogéneas. Sin embargo, estas mutaciones tienen en común la presencia de diversos grados de afectación neuronal, que lleva a neurodegeneración. A pesar de que el cerebro representa solo el 2 % del peso corporal, consume el 20 % de la energía corporal. La mayor parte de esta energía es consumida por las neuronas y es el sistema OXPHOS el que la produce. Con el objetivo final de caracterizar el efecto de mutaciones patológicas de la DNA polimerasa mitocondrial gamma en la diferenciación neuronal y en el sistema OXPHOS de neuronas maduras, en este trabajo, se han caracterizado a nivel genético, molecular y funcional líneas celulares derivadas de neuroblastoma (que pueden diferenciarse a neurona) sobreexpresando POLG silvestre, POLG con una variante portadora de una mutación autosómica dominante o POLG con una variante previamente asociada a Parkinson. Con estos estudios, hemos comprobado que la sobreexpresión de la mutación patológica afecta a la replicación del DNA mitocondrial en la línea SH-SY5Y en cultivo, quedando disponible para comenzar los estudios de diferenciación neuronal. Por otro lado, se han caracterizado a nivel genético y molecular 3 líneas cíbridas para los haplogrupos mitocondriales: H, UK y J, derivadas de neuroblastoma sobreexpresando POLG silvestre, o la variante de POLG previamente asociada a Parkinson. Una vez caracterizadas se estudiará el efecto combinado que pueden tener variaciones genéticas mitocondriales y nucleares en la diferenciación a neurona dopaminérgica

Mutaciones nucleares que afectan al sistema de fosforilación oxidativa

Las mitocondrias son orgánulos dinámicos que albergan rutas metabólicas esenciales para la vida. Entre ellas, la fosforilación oxidativa (OXPHOS) que proporciona la mayor parte de la energía útil a las células del cuerpo. Los defectos en su funcionamiento generan las enfermedades de la cadena respiratoria, difíciles de diagnosticar debido a la gran heterogeneidad clínica que presentan los pacientes. La utilización de las técnicas modernas de secuenciación masiva ha permitido identificar variaciones genéticas en el genoma de muchos pacientes. Esto no siempre lleva a un diagnóstico molecular porque la interpretación de las variaciones en el DNA puede resultar muy compleja. En algunos casos afectan a proteínas cuya función no se conoce o no se relaciona con la ruta biológica afectada.En este trabajo se han estudiado los defectos moleculares causados por mutaciones encontradas en genes nucleares de pacientes diagnosticados con enfermedad mitocondrial, siendo el objetivo principal la obtención de un diagnóstico genético-molecular de estos pacientes. Se han analizado fibroblastos derivados de tres pacientes con mutaciones en los genes POLG, NDUFAF6 y ATAD3C respectivamente.Se describe el caso de una paciente, diagnosticada con enfermedad mitocondrial, con dos mutaciones en heterocigosis compuesta en POLG. El estudio clínico, junto con las diferencias in vitro en la cinética de recuperación del mtDNA de las células de control y de paciente, sugieren que los síntomas de enfermedad mitocondrial fueron precipitados por una infección por Borrelia y, posiblemente, empeoraron por el tratamiento farmacológico. Este estudio demuestra la importancia de diagnósticos genéticos tempranos de los pacientes y la necesidad de considerar los riesgos y beneficios en la selección de tratamientos farmacológicos para pacientes con sospecha de desórdenes mitocondriales.A continuación, se describen tres hermanos diagnosticados con el Síndrome de Leigh con dos mutaciones en heterocigosis compuesta en NDUFAF6, factor esencial para la maduración y actividad del complejo I de la cadena de transporte de electrones. Los ensayos funcionales de complementación genética permitieron obtener la evidencia conclusiva de la patogenicidad en esta familia.Por último, se describe el estudio del primer caso de mutaciones en el gen ATAD3C en un paciente diagnosticado con enfermedad mitocondrial. La asociación de su fenotipo con las mutaciones es un reto, debido a que existe muy poca información sobre ATAD3C en la literatura, podría ser un pseudogén y no hay casos previos descritos. En este trabajo, se ha confirmado que ATAD3C genera una proteína mitocondrial que se localiza en la membrana mitocondrial interna, que es capaz de oligomerizar de la misma manera que ATAD3A, y que puede interaccionar con el complejo que forma ATAD3A regulando su función. Estos hallazgos proporcionan un posible mecanismo por el que mutaciones en ATAD3C puedan llevar a patología en humanos<br /

Uridine Prevents Negative Effects of OXPHOS Xenobiotics on Dopaminergic Neuronal Differentiation

Neuronal differentiation appears to be dependent on oxidative phosphorylation capacity. Several drugs inhibit oxidative phosphorylation and might be detrimental for neuronal differentiation. Some pregnant women take these medications during their first weeks of gestation when fetal nervous system is being developed. These treatments might have later negative consequences on the offspring’s health. To analyze a potential negative effect of three widely used medications, we studied in vitro dopaminergic neuronal differentiation of cells exposed to pharmacologic concentrations of azidothymidine for acquired immune deficiency syndrome; linezolid for multidrug-resistant tuberculosis; and atovaquone for malaria. We also analyzed the dopaminergic neuronal differentiation in brains of fetuses from pregnant mice exposed to linezolid. The drugs reduced the in vitro oxidative phosphorylation capacity and dopaminergic neuronal differentiation. This differentiation process does not appear to be affected in the prenatally exposed fetus brain. Nevertheless, the global DNA methylation in fetal brain was significantly altered, perhaps linking an early exposure to a negative effect in older life. Uridine was able to prevent the negative effects on in vitro dopaminergic neuronal differentiation and on in vivo global DNA methylation. Uridine could be used as a protective agent against oxidative phosphorylation-inhibiting pharmaceuticals provided during pregnancy when dopaminergic neuronal differentiation is taking place

Brain pyrimidine nucleotide synthesis and Alzheimer disease

Many patients suffering late-onset Alzheimer disease show a deficit in respiratory complex IV activity. The de novo pyrimidine biosynthesis pathway connects with the mitochondrial respiratory chain upstream from respiratory complex IV. We hypothesized that these patients would have decreased pyrimidine nucleotide levels. Then, different cell processes for which these compounds are essential, such as neuronal membrane generation and maintenance and synapses production, would be compromised. Using a cell model, we show that inhibiting oxidative phosphorylation function reduces neuronal differentiation. Linking these processes to pyrimidine nucleotides, uridine treatment recovers neuronal differentiation. To unmask the importance of these pathways in Alzheimer disease, we firstly confirm the existence of the de novo pyrimidine biosynthesis pathway in adult human brain. Then, we report altered mRNA levels for genes from both de novo pyrimidine biosynthesis and pyrimidine salvage pathways in brain from patients with Alzheimer disease. Thus, uridine supplementation might be used as a therapy for those Alzheimer disease patients with low respiratory complex IV activity

Molecular characterization of new FBXL4 mutations in patients with mtDNA depletion syndrome

Encephalomyopathic mitochondrial DNA (mtDNA) depletion syndrome 13 (MTDPS13) is a rare genetic disorder caused by defects in F-box leucine-rich repeat protein 4 (FBXL4). Although FBXL4 is essential for the bioenergetic homeostasis of the cell, the precise role of the protein remains unknown. In this study, we report two cases of unrelated patients presenting in the neonatal period with hyperlactacidemia and generalized hypotonia. Severe mtDNA depletion was detected in muscle biopsy in both patients. Genetic analysis showed one patient as having in compound heterozygosis a splice site variant c.858+5G>C and a missense variant c.1510T>C (p.Cys504Arg) in FBXL4. The second patient harbored a frameshift novel variant c.851delC (p.Pro284LeufsTer7) in homozygosis. To validate the pathogenicity of these variants, molecular and biochemical analyses were performed using skin-derived fibroblasts. We observed that the mtDNA depletion was less severe in fibroblasts than in muscle. Interestingly, the cells harboring a nonsense variant in homozygosis showed normal mtDNA copy number. Both patient fibroblasts, however, demonstrated reduced mitochondrial transcript quantity leading to diminished steady state levels of respiratory complex subunits, decreased respiratory complex IV (CIV) activity, and finally, low mitochondrial ATP levels. Both patients also revealed citrate synthase deficiency. Genetic complementation assays established that the deficient phenotype was rescued by the canonical version of FBXL4, confirming the pathological nature of the variants. Further analysis of fibroblasts allowed to establish that increased mitochondrial mass, mitochondrial fragmentation, and augmented autophagy are associated with FBXL4 deficiency in cells, but are probably secondary to a primary metabolic defect affecting oxidative phosphorylation

ATAD3C regulates ATAD3A assembly and function in the mitochondrial membrane

Mitochondrial ATAD3A is an ATPase Associated with diverse cellular Activities (AAA) domain containing enzyme, involved in the structural organization of the inner mitochondrial membrane and of increasing importance in childhood disease. In humans, two ATAD3A paralogs arose by gene duplication during evolution: ATAD3B and ATAD3C. Here we investigate the cellular activities of the ATAD3C paralog that has been considered a pseudogene. We detected unique ATAD3C peptides in HEK 293T cells, with expression similar to that in human tissues, and showed that it is an integral membrane protein that exposes its carboxy-terminus to the intermembrane space. Overexpression of ATAD3C, but not of ATAD3A, in fibroblasts caused a decrease in cell proliferation and oxygen consumption rate, and an increase of cellular ROS. This was due to the incorporation of ATAD3C monomers in ATAD3A complex in the mitochondrial membrane reducing its size. Consistent with a negative regulation of ATAD3A function in mitochondrial membrane organization, ATAD3C expression led to increased accumulation of respiratory chain dimeric CIII in the inner membrane, to the detriment to that assembled in respiratory supercomplexes. Our results demonstrate a negative dominant role of the ATAD3C paralog with implications for mitochondrial OXPHOS function and suggest that its expression regulates ATAD3A in the cell