Study of the production and use of lipase from Burkholderia cepacia in enzymatic synthesis of biodiesel

Orientadores: Ranulfo Monte Alegre, Jorge Alberto Vieira CostaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de AlimentosResumo: Os avanços biotecnológicos na produção industrial de lipases têm proporcionado sua aplicação nos diferentes setores. Este interesse se deve à capacidade destas enzimas catalisarem algumas reações, dentre elas a transesterificação. Esta reação é reversível e resulta em altos rendimentos a partir da otimização de parâmetros experimentais, tais como, temperatura, concentração do catalisador, razão molar álcool:óleo, entre outros. Um grande número de trabalhos voltados para a produção de biodiesel por via enzimática vem sendo feito devido às vantagens a ela associada. Tendo em vista estas observações, o presente trabalho teve por objetivo o estudo da produção de lipase microbiana e sua aplicação na síntese de biodiesel. As etapas envolvidas neste projeto foram: produção de lipase por diferentes microrganismos utilizando fermentação submersa e semi-sólida; uso de diferentes reatores e meios de cultivo; escolha e caracterização da lipase que melhor apresentou vantagens em relação à produtividade e à atividade de transesterificação; estudo de imobilização e reutilização da lipase em diferentes resinas hidrofóbicas e de troca iônica; estudo da influência do tempo de reação, temperatura, pH, concentração de água, etanol e enzima, além da adição de co-solvente, goma arábica e íons metálicos na síntese do biodiesel. Efeitos positivos nos experimentos foram verificados quando se adicionou KH2PO4 e água de maceração de milho no processo de produção de lipase pela Burkholderia cepacia. Esta cepa apresentou maior potencial de produção de lipase com atividade de transesterificação do óleo de soja e etanol comparada com os demais microrganismos estudados. A caracterização da lipase demonstrou que os melhores resultados foram a 37°C e pH 8,0, seguindo modelo de inativação enzimática de primeira ordem. A resina de poli(estireno-co-divinilbenzeno) com 35% de DVB juntamente com a Amberlit IRA-900 apresentaram maior potencial de imobilização e utilização para a síntese do biodiesel. Nos experimentos de transesterificação, as variáveis estudadas apresentaram efeito na respostas de síntese de biodiesel. Os melhores resultados encontrados foram: pH igual a 6,0, temperatura em ttorno de 50ºC, uso de éter de petróleo como co-solvente, concentração de etanol próxima à quantidade estequiométrica e concentração de aproximadamente 42% de água. Por fim, na reutilização das resinas de poli(estireno-co-divinilbenzeno) com 35% de DVB e Amberlit IRA-900, foi observada uma diminuição no rendimento da reação devido à perda de parte da enzima por lixiviação. Os resultados referentes à primeira resina mostraram que a perda da atividade está relacionada ao número de usos e segue uma função de primeira ordem. A constante de perda da atividade foi de 3,017 e o tempo de meia vida do processo 18 usos. Os parâmetros cinéticos Km e Vmáx determinados na reação foram de 21,98% e 14,56%p.h-1, respectivamente. Já em relação à reutilização da lipase imobilizada na segunda resina, o tempo de meia vida foi de 6 usos. Com isso o presente trabalho apresenta uma contribuição significativa no que diz respeito ao uso de lipase de Burkholderia cepacia e agrega soluções para viabilizar o processo de transesterificação com esta enzimaAbstract: The technological advancements in the industrial production of lipases have been making its application viable in different sectors. This interest is due to these enzymes capacity to catalyze some reactions, like the transesterification. This reaction is reversible and the optimization of experimental parameters such as temperature, catalyst concentration and ethanol-to-oil molar ratio results in a high production efficiency. A great number of studies about the enzymatic production of biodiesel have been done due to its related advantages. Considering these observations, the objective of this work was to study the production of microbial lipase and its application in the synthesis of biodiesel. The stages involved in this project were: lipase production by different microorganisms using submerged and semisolid fermentation; use of different reactors and cultivation media; selection and characterization of the lipase that showed advantages related to the productivity and to the transesterification activity; study of the immobilization and reutilization of the lipase in different hydrophobic and ionic exchange resins; study of the influence of reaction time, temperature, pH, water, ethanol and enzyme concentrations and the addition of cosolvents, arabic gum and metallic ions in the synthesis of biodiesel. Positive effects were verified in the experiments when KH2PO4 and corn maceration liquor were added to the process of lipase production by Burkholderia cepacia. Compared with the other microorganisms studied, that strain showed greater potential for the production of lipase with activity of transesterification of soy oil and ethanol. The characterization of the lipase showed that the best results occurred at 37°C and pH 8.0, following the model of first order enzymatic inactivation. The poly(styrene-co-divinylbenzene) resin with 35% of DVB and Amberlit IRA-900 presented greater potential for the immobilization and synthesis of the biodiesel. In the transesterification experiments, the studied variables affected the response of the biodiesel synthesis. The best results were found at pH 6.0, temperature of 50ºC, petroleum ether as co-solvent, ethanol concentration at stequiometric values and water concentration around 42%. Finally, due to the loss of enzyme by lixiviation, it was observed a decrease in the efficiency of the reaction when the poly(styrene-codivinylbenzene) resins with 35% of DVB and Amberlit IRA-900 were reused. The results referring to the first resin showed that the loss of activity is related to the number of utilizations and it follows a first order function. The activity loss rate was 3.017 and the half-life of the process was 18 uses. The kinetic parameters Km and Vmax determined for the reaction were respectively 21.98% and 14.56%p.h-1. Referring to the reutilization of the lipase immobilized in the second resin, the half-life was 6 uses. Thus, this work presents a relevant contribution to the use of the lipase of Burkholderia cepacia and adds solutions to make the process of transesterification with this enzyme viableDoutoradoDoutor em Engenharia de Alimento

Utilização da farinha de arroz na elaboração de sobremesa

Este trabalho teve por objetivo elaborar um produto alimentício similar a “flan” sabor chocolate utilizando como base a farinha de arroz. A matéria-prima utilizada foi cedida por empresa processadora da região e caracterizada quanto a distribuição granulométrica, teores de umidade, proteína, cinzas, gordura, carboidratos, fibras, massa específica, índice de absorção e de solubilidade. Observou-se que a fração de 270 mesh da farinha pré-gelatinizada demonstrou ser a mais adequada para a elaboração do produto, pois apresentou maior homogeneidade e facilidade de preparo. Duas formulações de flan foram submetidas à avaliação sensorial utilizando testes de preferência e aceitação, segundo uma escala hedônica e de atitude de nove pontos, respectivamente. Por meio dessa análise verificou-se que AS formulações não apresentaram diferenças significativas quanto à aceitabilidade e preferência, quando comparadas a um produto comercial similar utilizado como padrão, evidenciando o potencial da farinha de arroz para elaboração de produto alimentício similar a flan. PALAVRAS-CHAVE: Arroz, farinha de arroz, flan, sobremesas

Selection and optimization of extracellular lipase production using agro-industrial waste

The aim of this study was to isolate and select lipase-producing microorganisms originated from different substrates, as well as to optimize the production of microbial lipase by submerged fermentation under different nutrient conditions. Of the 40 microorganisms isolated, 39 showed a halo around the colonies and 4 were selected (Burkholderia, Bacillus sp., Penicillium lanosum and Corynebac glutamyl), where strains showing lipolytic halo Radius (R) / colony radius (r) ratio greater than 2.0 were selected. The results of submerged fermentation expressed as enzymatic activity revealed that the genera of microorganisms significantly influenced the enzymatic reaction, and lipase obtained from Burkholderia cepacia was the most promising, with activity of 0.0058 U.mL-1. It was also observed in the optimization step of lipase production that the sodium nitrate content (NaNO3) had a positive effect on enzyme production, and its increase was indicative of higher enzymatic activity. The addition of sources of organic nitrogen (corn steep liquor, p = 0.2398), carbon (soybean oil, p = 0.3379), magnesium MgSO4.7H2O (p = 0.4189) and potassium KH2PO4 (p = 0.8562) had no significant effects on the lipase production and could result in decreased production of extracellular lipases.Keywords: Burkholderia cepacia, hydrolytic enzymes, residue, submerged fermentationAfrican Journal of Biotechnology, Vol. 13(4), pp. 566-573, 22 January, 201

Evaluation of an extrecellular lipase from Pseudomonas cepacia for purification in aqueous two-phase system

In this work, Pseudomonas cepacia was used for fermentation in bioreactor Bioflo III at 150 rpm, at 30 °C to 96 hours. Fermentation was conducted at 150 rpm for 96 hours in 30 °C. We analyzed the enzyme activity under different conditions of temperature (20 to 50 °C) and pH (3.0 to 11.0). The optimum activity values obtained were 37 °C and 8.0, respectively. To evaluate thermal stability, the enzyme was incubated in temperatures of 40, 50 and 60 °C for 120 minutes. Preliminary experiments were carried out to verify the appropriate conditions that should be used after the enzyme partition. Some tests were performed to determine some optimal conditions of lipase, including temperature and pH and tests of thermal stability using temperatures of 40, 50, and 60 °C. Next, the characterization of aqueous two-phase systems (ATPS) with PEG molar weight of 1500, 4000, and 6000 and phosphate varying pH 6 to 8 was made. Stock solutions of PEG 1500, 4000 and 6000 (50% w/w) and phosphate (20% w/w KH2PO4/K2HPO4) were prepared at the appropriate pH. This study on the characterization of the ATPS can be used for posterior partition of lipase, as well as of biological products within this pH range.O presente trabalho teve como objetivo a produção de lipase a partir de Pseudomona cepacia por fermentação líquida em biorreator do tipo Bioflo III. As fermentações foram conduzidas a 150 rpm durante 96 horas a 30 °C. Analisou-se a atividade enzimática em diferentes condições de temperatura (20 a 50 °C) e pH (3,0 a 11,0), e obtiveram-se 37 °C e 8,0, as condições ótimas, respectivamente. Para avaliar a estabilidade térmica, a enzima foi incubada em temperaturas de 40, 50 e 60 °C durante 120 minutos. Em uma segunda etapa, foram realizados experimentos preliminares para verificar as condições adequadas de partição da enzima, bem como sua estabilidade e condições ótimas de hidrólise frente às modificações de temperatura e pH. Foram preparadas soluções de PEG 1500, 4000 e 6000 a 50% p/p e soluções tampão fosfato de pHs 6, 7 e 8. Foi feita a caracterização de um sistema bifásico aquoso (SBA) a partir da preparação de soluções estoques de PEG com massas molares de 1500, 4000 e 6000 (50% w/w) e tampão fosfato pH 6,7 e 8,0 (20% w/w de KH2PO4/K2HPO4). Esta caracterização do SBA posteriormente poderá ser utilizada para partição de lipases, bem como de biomoléculas que estejam dentro dessa faixa de pH.1622Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq

Avaliação de diferentes doses de radiação gama aplicadas na microalga Spirulina (<em>Arthrospira platensis</em>)

São frequentes os estudos da viabilidade do uso da microalga Spirulina como forma de agregar valores nutricionais aos alimentos ou até mesmo fonte de pigmento natural, utilizado na indústria. A irradiação pode ser aplicada como uma forma de descontaminação e de conservação da Spirulina seca. O objetivo deste trabalho foi avaliar as alterações na estrutura físico-química da Spirulina submetida a diferentes doses de radiação. Verificou-se que os maiores valores de doses de radiação gama aplicada, houve diferença de cor. Contudo não houve alterações morfológicas significativas na estrutura da Spirulina irradiada. Não evidenciando maior fragilidade de quebra ou mudança na textura das amostras. Os tratamentos se comportaram como fluido não newtoniano dilatante, característica também de outras microalgas. Tendo a temperatura como uma forte influência no comportamento da Spirulina, tornando-se menos viscosa, no entanto Spirulina irradiada a 3kGy apresentou menor energia de ativação do fluxo, assim como uma viscosidade aparente maior em relação ao controle. Conclui-se que o uso de radiação gama, nas doses estudadas na Spirulina, não se evidenciou uma diferença significativa em termos de alterações estruturais físico-químicas para aplicações futuras na indústria de alimentos

Production of Lipase by Aspergillus fumigatus in Solid State Fermentation Using Residues from Rice

Summary Many factors can influence the production of lipase in a fermentation process, among them the air supply and the type of substrate. Biotechnological advances in industrial production of lipase have been allowing the application of this enzyme in different sectors, making it economically viable. This study aimed to evaluate the production of lipase by Aspergillus fumigatus in different nutritional and aeration conditions. The experiments were performed in column bioreactors aerated with 0, 40, 60, 80, 120 and 200 mL air .g mediu

Utilização da farinha de arroz na elaboração de sobremesa

Este trabalho teve por objetivo elaborar um produto alimentício similar a “flan” sabor chocolate utilizando como base a farinha de arroz. A matéria-prima utilizada foi cedida por empresa processadora da região e caracterizada quanto a distribuição granulométrica, teores de umidade, proteína, cinzas, gordura, carboidratos, fibras, massa específica, índice de absorção e de solubilidade. Observou-se que a fração de 270 mesh da farinha pré-gelatinizada demonstrou ser a mais adequada para a elaboração do produto, pois apresentou maior homogeneidade e facilidade de preparo. Duas formulações de flan foram submetidas à avaliação sensorial utilizando testes de preferência e aceitação, segundo uma escala hedônica e de atitude de nove pontos, respectivamente. Por meio dessa análise verificou-se que AS formulações não apresentaram diferenças significativas quanto à aceitabilidade e preferência, quando comparadas a um produto comercial similar utilizado como padrão, evidenciando o potencial da farinha de arroz para elaboração de produto alimentício similar a flan. PALAVRAS-CHAVE: Arroz, farinha de arroz, flan, sobremesas

Produção de biossurfactante por Aspergillus fumigatus utilizando resíduos agroindustriais como substrato

The objective of this study was to investigate biosurfactant production in solid state by Aspergillus fumigatus in fixed-bed column bioreactors using substrate based on agricultural residues. Without a supplementary carbon source the highest emulsifying activity (EA) was 11.17 emulsifying units (EU) g-1 of substrate at an aeration rate of 148 mL h-1g-1 but in the presence of diesel oil the highest EA value was 9.99 EU g-1 at an aeration rate of 119 mL h-1g-1 of substrate while supplementation with soya oil resulted in only 8.47 EU g-1 of substrate at an aeration rate of 119 mL h-1g-1