Differential Calcium Signaling by Cone Specific Guanylate Cyclase-Activating Proteins from the Zebrafish Retina

Zebrafish express in their retina a higher number of guanylate cyclase-activating proteins (zGCAPs) than mammalians pointing to more complex guanylate cyclase signaling systems. All six zGCAP isoforms show distinct and partial overlapping expression profiles in rods and cones. We determined critical Ca2+-dependent parameters of their functional properties using purified zGCAPs after heterologous expression in E.coli. Isoforms 1–4 were strong, 5 and 7 were weak activators of membrane bound guanylate cyclase. They further displayed different Ca2+-sensitivities of guanylate cyclase activation, which is half maximal either at a free Ca2+ around 30 nM (zGCAP1, 2 and 3) or around 400 nM (zGCAP4, 5 and 7). Zebrafish GCAP isoforms showed also differences in their Ca2+/Mg2+-dependent conformational changes and in the Ca2+-dependent monomer-dimer equilibrium. Direct Ca2+-binding revealed that all zGCAPs bound at least three Ca2+. The corresponding apparent affinity constants reflect binding of Ca2+ with high (≤100 nM), medium (0.1–5 µM) and/or low (≥5 µM) affinity, but were unique for each zGCAP isoform. Our data indicate a Ca2+-sensor system in zebrafish rod and cone cells supporting a Ca2+-relay model of differential zGCAP operation in these cells

Funktionelle Charakterisierung eines Guanylatzyklase-aktivierenden Proteins aus Photorezeptorzellen von Wirbeltieren

Die membrangebundene Guanylatzyklase ist eines der wichtigsten Enzyme bei der Wiederherstellung des Dunkelzustandes in Photorezeptoren. Thre Regulation ist abhängig von der freien Calcium-Konzentration und wird durch ein Calcium-Bindungsprotein vermittelt. In der vorliegenden Promotions arbeit wurde dieses Calcium-Bindungsprotein identifiziert, kloniert, heterolog exprimiert und charakterisiert. Es erwies sich als identisch mit GCAP1, dessen Sequenz veröffentlicht wurde, während die hier beschriebenen Sequenzierungsarbeiten im Gange waren (Palczewski et al., 1994). GCAP1 hat eine Länge von 205 Aminosäuren und ein berechnetes Molekulargewicht von 23510 Da. In der Sequenz finden sich ein degeneriertes und drei konventionelle EF-Hand-Calcium-Bindungsmotive. Die höchste Identität wurde mit 39% zu NVP-3 (neural visinin-like Ca$^{2+}$-binding protein) gefunden. Damit gehört GCAP1 zu den Recoverinverwandten Proteinen, einer Familie von Calcium-Bindungsproteinen, die bislang ausschließlich in neuronalem Gewebe gefunden wurden. Das rekombinante Protein wurde in $\textit{E. coli}$ exprimiert. Die Eigenschaften des nativen und des rekombinanten GCAP1 wurden miteinander verglichen. Beide Formen zeigten im SDS-Gel eine Calcium-abhängige Verschiebung um ca. 5 kDa. Die Aktivität von nativem und rekombinantem GCAP1 wurde anhand ihrer Fähigkeit, die retGC zu aktivieren, untersucht. Ein Zusatz von 100-125 $\mu$M ATP zu den Reaktionsansätzen verdoppelte die Aktivität der retGC unabhängig von der freien Calcium-Konzentration und GCAP1. Bei ATP-Konzentrationen $\geq$ 500 $\mu$M wurde die retGC-Aktivität inhibiert. Die Aktivierung der retGC durch natives GCAP1 war halbmaximal bei 100 nM [Ca$^{2+}$]$_{frei}$ mit einem Hill-Koeffizienten von 2,5. Die Aktivierung durch rekombinantes GCAP1 zeigte einen niedrigeren Grad an Kooperativität (n = 2,0) und die halbmaximale Aktivierung wurde zu 261 nM [Ca$^{2+}$]$_{frei}$ verschoben. Es wurde ein polyklonaler GCAP1-Antikörper hergestellt. Eine immuncytochemische Lokalisation zeigte, daß GCAP1 in den Stäbchen und Zapfen der Retina lokalisiert ist

Sancti Thomae Aquinatis O.P. doctrina De cooperatione dei cum omni natura creata praesertim libera seu S. Thomas praedeterminationis physicae ad omnem actionem creatam adversarius : responsio ad A.M. Dummermuth O.P. Praederterminationis physicae defensorem

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Funktionelle Charakterisierung eines Guanylatzyklase-aktivierenden Proteins aus Photorezeptorzellen von Wirbeltieren

A calcium binding protein has been identified us the guanylate cyclase activated protein (GCAP). This GCAP is identical with the GCAP1 described by Palczewski et al. (Neuron 13, 1994, 395-404). GCAP1 consists of 205 amino acids with a calculated molecular weight of 23510 Da. The sequence contains one degenerated and three conventional ef hand calcium binding motives. The highest degree of identity (39%) was found for NVP-3 (neural visinin-like Ca"2"+-binding protein). The recombinant GCAP1 has been exprimated in E. colis and the properties of native and recombinant GCAP1 have been compared studying the activation of retGC. An immuno cytochemical localization proved that GCAP1 is localized in the retinal rods and retinal cones. (WEN)SIGLEAvailable from TIB Hannover: RA 831(3269) / FIZ - Fachinformationszzentrum Karlsruhe / TIB - Technische InformationsbibliothekDEGerman