Embriogênese zigótica e somática em Araucaria angustifolia (Bertol.) Kuntze: parâmetros celulares e bioquímicos associados

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2013.A Araucaria angustifolia é uma conífera da família Araucariaceae, com ocorrência na floresta ombrófila mista, tipologia do bioma Mata Atlântica do Brasil que atualmente, encontra-se ameaçada de extinção, Esta condição reforça a necessidade de aplicação de medidas para a conservação desta espécie. Para que isto ocorra de forma eficaz é necessário o emprego conjunto de manejos convencionais para conservação dos remanescentes florestais e ferramentas biotecnológicas. Sendo assim, o presente trabalho propõe avanços na área de fisiologia, bioquímica e morfogenética que podem ser aplicados em técnicas de conservação de sementes e a propagação in vitro via embriogênese somática desta espécie. Anaálises de western blot em sementes de araucária detectaram a presença de dehidrinas nos extratos termoestáveis e termosensíves de eixos e cotiolédones de embriões zigóticos dessa espécie, e um possível mecanismos de defosforilação dessas proteínas. Além disso, imunolocalizações in situ por microscopia de luz (ML) e microscopia eletrônica de transmissão (MET) mostraram que estas proteínas estão presentes em todos os tecidos dos eixo embrionário e cotilédones, e a nível subcelular elas foram associadas aos corpos proteicos, microcorpos e a cromatina no núcleo. Os padrões desenvolvimento de embriões somáticos desta espécie foram acompanhados por ML, microscopia confocal (MC), microscopia eletrônica de varredura (MEV) e MET. Os resultados mostraram que culturas embrionárias de A. angustifólia proliferam através de massas pró-embrionároas (MPE) em três estágios de desenvolvimento, I, II e III, e que somente o estágio III é capaz de dar origem aos embriões somáticos (ES) iniciais. ES iniciais foram caracterizados pela presença de massa embrionária (ME) composta pelas células embriogênicas (CE), a qual é ligada a região do suspensor. O suspensor foi composto inicialmente pelas células do embrionárias do tubo (CT), seguidas pelas células de suspensor (SC), sendo que estes dois tipos celulares se diferem pelo diferente grau de vacualização e desorganizaçãoo celular. Além disso, por análise de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foi possível verificar que o desenvolvimento inicia dos embriões somáticos de A. angustifolia foram relacionados com uma redução do ABA endógeno e da poliamina putrescina na etapa de proliferação das MPE, seguido de aumento de ABA endógeno e das poliaminas spermidina e espermina, durante a embriogênese inicial. Abstract : Araucaria angustifolia is an endangered conifer of the South of Brazil. This condition reinforces the need to implement measures for the conservation of this species. For this to happen effectively requires the combined use of conventional managements for conservation of forest remnants and biotechnological tools. Therefore, this work proposes advances in physiology, biochemistry and morphogenetic that can be applied in seed conservation techniques and in vitro propagation via somatic embryogenesis of this species. Western blot analysis of Brazilian pine seeds detected the presence of dehydrins in the total proteins and heat-stable extracts from axis and cotyledons from zygotic embryos, and a possible mechanisms for dephosphorylation of these proteins. Furthermore, immunolocalization in situ of dehydrins by light microscopy (LM) and transmission electron microscopy (TEM) showed the presence of these proteins in all tissues of the embryonic axis and cotyledons. At the subcellular level they were associated with protein bodies, microbodies and chromatin in the nucleus. The standards development of somatic embryos of this species were followed by LM, confocal microscopy (CM), scanning electron microscopy (SEM) and TEM. The results showed that embryogenci cultures of A. angustifolia proliferate by proembryogenic masses (PEM) in three developmental stages I, II and III and, only the PEM III are able to give rise to early somatic embryos (ES). Early ES were characterized by the presence of embryonal mass (EM) composed of embryogenic cells (EC), which is connected to the region of the suspensor. The suspensor was composed by embryonal tube cells (CT) followed by suspensor-like cells (SC), and these two cell types differ by degree of vacuolation and dismantling cell. Furthermore, by analysis of high performance liquid chromatography (HPLC) was verified that the development of early somatic embryos of A. angustifolia were associated with a decrease in endogenous contentes of ABA and polyamine putrescine in the proliferation step of MPE, followed by an increase of endogenous contentes of ABA and polyamines spermine and spermidina during the early embryogenesis

Ontogenia de megaestróbilos de Araucaria angustifolia (Bert.) O. Kuntze (Araucariaceae)

Em vista da escassez de dados sobre o desenvolvimento individual da fase embrionária à fase adulta, este estudo teve como objetivos descrever a ontogenia de megaestróbilos de A. angustifolia, conhecer o rendimento dos megaestróbilos, assim como o número e a localização de plantas masculinas, femininas e juvenis, em uma população nativa localizada em Curitibanos (SC). Forwam realizadas 17 coletas (março 2011 a julho 2012). As plantas foram geolocalizadas. Coletaram-se mensalmente três megaestróbilos maduros, em desenvolvimento e, quando possível, imaturos, de árvores previamente marcadas. Os megaestróbilos foram fotografados, medidos, pesados e tiveram suas brácteas, sementes e sementes chochas separadas e quantificadas. Na população estudada, verificaram-se 176 plantas, das quais 56 eram masculinas, 41 femininas e 79 juvenis. O peso médio dos megaestróbilos (iniciais, em desenvolvimento e maduros) ficou entre 72,83 g e 1.437,39 g; o diâmetro médio entre 15,91 cm e 45,08 cm e o comprimento médio entre 6,95 cm e 22,88 cm. Nos megaestróbilos maduros, 85% do seu rendimento são brácteas estéreis, enquanto as sementes e as sementes chochas equivaleram a aproximadamente 10% cada. Os resultados podem contribuir em operações de coletas de sementes que visem à melhoria reprodutiva, conservação de germoplasma e conservação in situ da população nativa estudada

Biochemical changes in Araucaria angustifolia (Araucariaceae) zygotic embryos during the storage

Especies reactivas del oxígeno (ROS) están presentes en todos los organismos aeróbicos, pero los procesos de deterioro de semillas pueden aumentar su producción. El estrés oxidativo causado por el aumento de ROS endógeno puede causar un daño irreparable a las células, que conduce a la pérdida de viabilidad de la semilla. Teniendo en cuenta que la enzima superóxido dismutasa (SOD) compone el primer mecanismo de defensa antioxidante enzimática, este estudio tuvo por objetivo evaluar los embriones cigóticos de semillas recalcitrantes de Araucaria angustifolia durante el almacenamiento los cambios en la actividad de SOD. Además, algunas alteraciones importantes derivadas de estrés oxidativo, como la peroxidación lipídica y los cambios en las proteínas y la integridad del DNA también se evaluaron. Aproximadamente 7 000 semillas fueron cosechadas de una población en el sur de Brasil y almacenadas durante 180 días en el laboratorio (L), refrigeración (R) y congelamiento (F). El análisis de la peroxidación de lípidos a través de los niveles de TBARS, actividad de la SOD, perfil proteico por separación electroforética e integridad del DNA genómico se realizaron a los 0, 60, 120 y 180 días de almacenamiento. Los resultados revelaron un aumento de la peroxidación lipídica y de la actividad de la SOD, especialmente durante el almacenamiento en L, una condición en la que hubo una extensa degradación de las proteínas. Algunas proteínas (45, 32 y 31 kDa) se expresaron sólo en embriones almacenados en condiciones R y F. No se observaron daños en la integridad del DNA nuclear para el período de almacenamiento de semillas en condiciones R y F. Las muestras F mantienen las características bioquímicas analizadas durante todo el período de almacenamiento, con la excepción del perfil de proteínas. Sin embargo, tales cambios son limitantes para el mantenimiento de la viabilidad de la semilla. En conclusión, el almacenamiento en refrigeración puede ser indicado para retrasar las alteraciones metabólicas que se producen cuando las semillas están expuestas a condiciones de ambiente natural después de la cosecha, que extiende el período de conservación de las semillas de A. angustifolia.Reactive oxygen species (ROS) are present in all aerobic organisms, but the seed deterioration processes can increase its production. Oxidative stress caused by higher endogenous ROS may cause irreparable damage to cells, leading to the loss of seed viability. Considering that the enzyme superoxide dismutase (SOD) composes the first enzymatic antioxidant defense mechanism, this study aimed to evaluate zygotic embryos of Araucaria angustifolia recalcitrant seeds during storage regarding changes in SOD activity. Besides, some of the major alterations resulting from oxidative stress, e.g., lipid peroxidation and changes in proteins and DNA integrity were also measured. Approximately, 7 000 seeds were harvested from a population in Southern Brazil and stored for 180 days under laboratory (L, laboratory temperature), refrigeration (R, 5 ± 1 °C) and freezing (F, -18 ± 1 °C) conditions. The analysis of lipid peroxidation through TBARS levels, SOD activity, protein profile by electrophoretic separation, and integrity of genomic DNA were performed at 0, 60, 120, and 180 days of storage. The results revealed an increase in lipid peroxidation and SOD activity, especially during the L storage, a condition in which there was an extensive degradation of proteins. Some proteins (i.e., 45, 32, and 31 kDa) were expressed only in embryos stored under R and F conditions. No damage was observed in the nuclear DNA integrity for the evaluated period of seed storage at R and F conditions. The F samples maintained the biochemical traits of interest throughout the storage period, with the exception of the protein profile. However, such changes are limiting for the maintenance of seed viability. In conclusion, R storage can be indicated to delay the metabolic feature alterations that occur when seeds are exposed to conditions of natural ambient after harvest, extending the conservation period of A. angustifolia seeds

Estudo da estabilidade fenotípica de feijoeiro com grãos especiais Study of the phenotypical stability of common bean plants with special grains

Obejtivou-se no presente trabalho avaliar os parâmetros de adaptabilidade e de estabilidade de linhagens e cultivares de feijoeiro, com grãos especiais, por meio do uso do genótipo suplementar (GS) em análise AMMI (Additive Main Effect and Multiplicative Interaction). Foram utilizados dados de produtividade de grãos de 14 genótipos de feijoeiro pertencentes ao ensaio de Valor de Cultivo e Uso (VCU), para o estado de São Paulo, referente às safras de 2005/2006/2007, semeados em 24 ambientes no delineamento de blocos casualizados, com três repetições. Pôde-se observar diferenças no comportamento dos genótipos em função do estímulo do ambiente, uma vez que a interação genótipo x ambiente foi significativa. Para tanto os genótipos Gen 99 TGR 34-16 (época das águas), Jalo Precoce e IAC - Centauro (época da seca), Gen 99 TG 28-68 e IAC-Centauro (época de inverno) e IAC-Boreal (conjunto das três épocas) apresentaram-se estáveis, pois seus valores de escores foram próximos de zero. Em relação ao conjunto das três épocas de semeadura não foi detectado nenhum genótipo próximo ao GS, no entanto os genótipos IAPAR-31 e IAC-Centauro (época da seca), Gen 99 TG 28-68 e IAC-Centauro (época de inverno) aproximaram-se desse ponto tendo como característica o fato de interagirem com os ambientes de maneira mais favorável possível. Sendo assim, o método AMMI combinado com o uso do GS auxilia na identificação de genótipos superiores.<br>The objective of the present study is to evaluate adaptability and stability parameters of lines and cultivars of common bean plants with special grains through the use of supplementary genotypes (GS) and AMMI (Additive Main Effect and Multiplicative Interaction) analysis. Productivity data of 14 lines and cultivars of common beans belonging to the Value for Cultivation and Use (VCU assay) of the State of São Paulo, referent to the harvests of 2005/2006/2007, seeded in twenty-four environments following a randomized blocks design with three repetitions, were used. It is possible to observe performance differences of the genotypes in function of environmental stimulus, since the genotype x environment integration was significant. Genotypes Gen 99 TGR 34-16 (raining period), Jalo Precoce and IAC -Centauro (dry period), Gen 99 TG 28-68 and IAC-Centauro (winter period) and IAC - Boreal (set of all the three periods) were stable, presenting score values close to zero. Regarding the set of the three seeding periods, we did not detect any genotype close to GS; nevertheless, the genotypes IAPAR-31 and IAC-Centauro (dry period), Gen99 TG 2868 and IAC-Centauro (winter period) were close to this point, interacting with environments in the most favorable way as possible. Therefore, the AMMI method combined with GS use helps to identify superior genotypes