The phage therapy paradigm: prêt-à-porter or sur-mesure?

The present opinion is the result of discussions on the future of phage therapy (personalized or large-scale uniform therapy?) during the first International Congress on Viruses of Microbes, held at the Institut Pasteur in Paris on June 21–25, 2010

Analyse des régions génomiques qui différencient Y. pestis de son ancêtre récent Y. pseudotuberculosis

Yersinia pestis est une bactérie d une extrême pathogénicité pour l homme mais les raisons de ce pouvoir pathogène exceptionnel restent inconnues. Son ancêtre Y. pseudotuberculosis est génétiquement très proche mais de niveau de virulence très différent. L une de leurs différences génétiques majeures est la présence du plasmide pPla. Nos résultats suggèrent que l acquisition de ce plasmide ne s est pas accompagnée d un saut brutal de virulence chez la souche ancestrale de Y. pestis. Nous avons aussi analysé les régions conservées chez Y. pseudotuberculosis et perdues par Y. pestis. Nous avons montré que trois d entre elles jouent un rôle dans la virulence de la souche ancestrale, 2 sont vitales pour elle, 4 n ont pas d effet sur sa croissance ou sa virulence et une joue un rôle pour sa croissance. De plus nous avons identifié deux gènes d invasine chez Y. pseudotuberculosis. Leur délétion combinée augmente légèrement la virulence de Y. pseudotuberculosis.La peste est l'une des maladies les plus mortifères de l'histoire de l'humanité. Son agent causal, Yersinia pestis, est une bactérie d une extrême pathogénicité pour l homme mais les raisons de ce pouvoir pathogène exceptionnel restent inconnues. Y. pestis et Y. pseudotuberculosis sont deux espèces génétiquement quasi-jumelles mais de niveau de virulence très différent. Une des différences génétiques majeures entre Y. pestis et son ancêtre Y. pseudotuberculosis est la présence du plasmide pPla. Le premier objectif de ce travail a été de déterminer si ce plasmide pouvait à lui seul être responsable de la différence de pathogénicité entre Y. pestis et Y. pseudotuberculosis. Pour cela, nous avons introduit pPla chez une souche de Y . pseudotuberculosis chez laquelle la synthèse des chaînes latérales du LPS avait été préalablement abrogée (comme c est naturellement le cas chez Y. pestis). Bien que l activité de la protéine Pla se soit révélée être similaire à celle de Y. pestis, ceci n a pas suffi à conférer un pouvoir pathogène accru à la souche recombinante. Ces résultats suggèrent que l acquisition du plasmide pPla ne s est pas accompagnée d un saut brutal de virulence chez la souche ancestrale de Y. pestis. Lors de son évolution, Y. pestis a subi une perte génétique considérable. Le deuxième objectif de ce travail de thèse a été d analyser les régions conservées chez Y. pseudotuberculosis et perdues par Y. pestis. Dans un premier temps, nous avons identifié et caractérisé une région codant une ADN méthyltransférase. Nous avons montré que cette enzyme jouait un rôle dans la virulence de Y. pseudotuberculosis, mais que son introduction chez Y. pestis ne perturbait ni la virulence ni la croissance de celle-ci. Dans un deuxième temps, nous avons identifié et étudié neuf autres régions spécifiques de Y. pseudotuberculosis. Nous avons montré que deux d entre elles étaient vitales, quatre n avaient pas d effet sur la croissance ou la virulence, une (une pseudouridylate synthase) jouait un rôle dans la croissance en milieu minimum à 37C, et deux régions (l une participant au recyclage de la méthionine et l autre de fonction inconnue) étaient impliquées dans le processus pathologique. Au cours de son évolution Y. pestis a également subi une inactivation massive de gènes, dont le gène inv codant une invasine majeure chez Y. pseudotuberculosis. L analyse du génome de Y. pseudotuberculosis nous a permis d identifier deux autres gènes d invasines putatives (inv2 et inv3). Chez Y. pestis, inv2 est inactivé par l insertion d une séquence IS et inv3 ne possède pas tous les domaines présents chez l homologue de Y. pseudotuberculosis. Notre travail indique que Inv3 n est pas une invasine et n est pas impliquée dans la pathogénicité de Y. pseudotuberculosis. Inv2 semble par contre être une invasine accessoire chez Y . pseudotuberculosis et la délétion du gène inv2, seule ou en association avec celle des autres gènes inv, augmente légèrement la pathogénicité de Y. pseudotuberculosis. Ce travail de thèse a permis de caractériser certaines des régions génomiques qui différencient Y. pestis de son ancêtre récent Y. pseudotuberculosis et d évaluer l importance de la perte ou de l acquisition des fonctions correspondantes sur la physiologie et la pathogénie de ces bactéries.PARIS-BIUSJ-Thèses (751052125) / SudocPARIS-BIUSJ-Physique recherche (751052113) / SudocSudocFranceF

Characterization of Chromosomal Regions Conserved in Yersinia pseudotuberculosis and Lost by Yersinia pestis▿ †

The transformation of the enteropathogenic bacterium Yersinia pseudotuberculosis into the plague bacillus, Yersinia pestis, has been accompanied by extensive genetic loss. This study focused on chromosomal regions conserved in Y. pseudotuberculosis and lost during its transformation into Y. pestis. An extensive PCR screening of 78 strains of the two species identified five regions (R1 to R5) and four open reading frames (ORFs; orf1 to orf4) that were conserved in Y. pseudotuberculosis and absent from Y. pestis. Their conservation in Y. pseudotuberculosis suggests a positive selective pressure and a role during the life cycle of this species. Attempts to delete two ORFs (orf3 and orf4) from the chromosome of strain IP32953 were unsuccessful, indicating that they are essential for its viability. The seven remaining loci were individually deleted from the IP32953 chromosome, and the ability of each mutant to grow in vitro and to kill mice upon intragastric infection was evaluated. Four loci (orf1, R2, R4, and R5) were not required for optimal growth or virulence of Y. pseudotuberculosis. In contrast, orf2, encoding a putative pseudouridylate synthase involved in RNA stability, was necessary for the optimal growth of IP32953 at 37°C in a chemically defined medium (M63S). Deletion of R1, a region predicted to encode the methionine salvage pathway, altered the mutant pathogenicity, suggesting that the availability of free methionine is severely restricted in vivo. R3, a region composed mostly of genes of unknown functions, was necessary for both optimal growth of Y. pseudotuberculosis at 37°C in M63S and for virulence. Therefore, despite their loss in Y. pestis, five of the nine Y. pseudotuberculosis-specific chromosomal loci studied play a role in the survival, growth, or virulence of this species

Modelling of the risk Cryptosporidium parvum infection through drinking tap-water. A pragmatic approach in France

Poster *INRA Biométrie Jouy-en-Josas (FRA) Collation : 1 p. Diffusion du document : INRA Biométrie Jouy-en-Josas (FRA

Phage-Based Fluorescent Biosensor Prototypes to Specifically Detect Enteric Bacteria Such as E. coli and Salmonella enterica Typhimurium

International audienceWater safety is a major concern for public health and for natural environment preservation. We propose to use bacteriophages to develop biosensor tools able to detect human and animal pathogens present in water. For this purpose, we take advantage of the highly discriminating properties of the bacteriophages, which specifically infect their bacterial hosts. The challenge is to use a fluorescent reporter protein that will be synthesized, and thus detected, only once the specific recognition step between a genetically modified temperate bacteriophage and its bacterial host has occurred. To ensure the accuracy and the execution speed of our system, we developed a test that does not require bacterial growth, since a simple 1-hour infection step is required. To ensure a high sensitivity of our tool and in order to detect up to a single bacterium, fluorescence is measured using a portable flow cytometer, also allowing on-site detection. In this study, we have constructed and characterized several "phagosensor" prototypes using the HK620 bacteriophage and its host Escher-ichia coli TD2158 and we successfully adapted this method to Salmonella detection. We show that the method is fast, robust and sensitive, allowing the detection of as few as 10 bacteria per ml with no concentration nor enrichment step. Moreover, the test is functional in sea water and allows the detection of alive bacteria. Further development will aim to develop phagosensors adapted on demand to the detection of any human or animal pathogen that may be present in water

Determination of optimal detection conditions.

<p>(A) Bacterial survival analyzed by flow cytometry as a function of time under several temperature conditions. Bacterial cell counts were measured immediately after infection then each 30 min for 2 hours. <i>E</i>. <i>coli</i> TD2158 was either non infected (dark symbols) or infected with HK620::P<i>rrnB</i>-<i>gfp</i> phage (white symbols). Cultures were incubated at 25°C (triangles), 30°C (circles), or 37°C (squares). The relative bacterial survival is the ratio between the bacterial cell count at 30 min, 60 min, 90 min, or 120 min and the initial bacterial cell count multiplied by 100. Arrows show the percentage of lysed bacteria 2 hours post-infection. (B) and (C) Fluorescence intensity obtained with phagosensors under several temperature conditions. <i>E</i>. <i>coli</i> TD2158 was infected with HK620::P<i>rrnB</i>-<i>gfp</i> phage and incubated at 25°C, 30°C or 37°C. Fluorescence intensities were monitored immediately after infection (red) then 30 min (blue), 60 min (green), 90 min (orange) and 120 min (purple) post-infection. (B) Cytometry histograms represent the number of fluorescent or non-fluorescent cells gated to the bacterial population as a function of the fluorescence intensity. Panels from left to right correspond to results obtained at 25°C, 30°C and 37°C, respectively. The dotted line represents the limit between negative fluorescence (GFP-) and positive fluorescence (GFP+) determined by using the fluorescent negative control WT HK620. (C) Column histograms represent the means of median fluorescence intensities obtained with a triplicate of sample incubated at 25°C, 30°C or 37°C.</p

Specific detection of <i>E</i>. <i>coli</i> TD2158 with the phagosensor HK620::PrrnB-gfp.

<p>Co-cultures of <i>E</i>. <i>coli</i> TD2158 and <i>S</i>. <i>enterica</i> (ratio = 1:10) (A) or <i>E</i>. <i>coli</i> TD2158 and <i>E</i>. <i>coli</i> MG1655 (ratio 3:10) (B), were infected with the HK620::P<i>rrnB</i>-<i>gfp</i> phage and incubated at 30°C for 1 hour. The fluorescence intensity of individual cells gated to the bacterial population was determined by flow cytometry (left panels). The dotted line represents the limit between negative (no fluorescence) and positive (fluorescence) cells as determined using the fluorescence negative control composed of a non infected co-culture. Mean fluorescence was calculated from at least triplicate samples. Co-culture samples were analyzed by epifluorescence microscopy imaging of co-culture sample (Right panels). Red fluorescence population was <i>S</i>. <i>enterica</i> labeled with antibody coupled with phycoerythrin (PE), GFP-induced green fluorescent population was the infected bacteria and non fluorescent bacteria were E. coli MG1655. Average fluorescence values were obtained from triplicate samples.</p