AVALIAÇÃO DO USO DE SANGUE EM PAPEL-FILTRO PARA DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS PARA O VÍRUS DA DOENÇA DE NEWCASTLE

O presente trabalho descreve a utilização de sangue total em papel-filtro para avaliação dos níveis de anticorpos específicos contra o vírus da doença de Newcastle (NDV) através da técnica de inibição da hemaglutinação (HI). Coletaram-se e analisaram-se por HI amostras de sangue de noventa e oito galinhas, com um histórico conhecido de vacinação contra o NDV HI. O sangue foi impregnado em papel-filtro Wathman n° 1 com 3cm2 e também coletado em tubos para a obtenção de soro. Armazenaram-se os papéis à temperatura ambiente e procedeu-se a sua análise num período de até quarenta e cinco dias. A sensibilidade, a es¬pecificidade, o valor preditivo positivo e o valor preditivo negativo do HI mediante o uso de papel-filtro, comparado com o HI em que se utilizou soro, foram de 89%, 73%, 76% e 87 %, respectivamente. Detectaram-se um índice de pre¬cisão de 80% e um coeficiente de correlação r = 0,81%. O título médio geométrico de anticorpos foi 33,1% e 33,6 para eluídos de papel-filtro e os soros, respectivamente. A asso¬ciação entre os dois métodos foi altamente significativa (p< 0.001) quando analisada pelo teste de Fisher. Os resultados indicam o potencial da utilização do sangue em papel-filtro como uma alternativa ao soro para detecção de anticorpos contra o NDV. PALAVRAS-CHAVES: Galinha, inibição da hemaglutinação, sorologia

Risk Factors Associated with the Presence of Viral Diseases in Domestic Poultry in the Southern Region of Rio Grande do Sul, Brazil

Background: The introduction of any infectious agent into an industrial or subsistence farm worries agribusiness owners in Brazil because it reduces product quality and increases treatment costs, although most diseases are untreatable, thus causing economic losses with morbidity and mortality. Therefore, an epidemiological survey of viral diseases associated with poultry was developed by performing a detailed description of the risk factors that may be related to existing diseases using domestic poultry sample data recorded in the Regional Diagnostic Laboratory (LRD) of College of Veterinary Medicine of the Federal University of Pelotas (UFPel), Rio Grande do Sul, Brazil, from 2000 to 2016.Materials, Methods & Results: Epidemiological and clinical-pathological data were collected and then compared with disease data by multivariate analysis using statistical EpiInfo version 6.04 and Microsoft Office Excel 2010 software. The frequencies and 95% confidence intervals (CI), association measures (odds ratio=OR and relative risk=RR), Chi-square test, and the results considered significant with a value of P ≤ 0.05 were described. A total of 410 samples of domestic poultry were tested, and the results showed 66 (16.1%) viral diseases. The following conditions were the most commonly found diseases in this study: Marek’s disease (42.4%), Infectious bursal disease (31.8%), Avian leukosis (16.6%), Avian pox (7.5%) and Avian infectious bronchitis (1.5%). In this article we discuss the most frequent viral diseases: Marek’s disease (DM) and Gumboro disease. It was also possible to conclude that birds with Marek's disease presented higher odds of developing nerve, tegumentary and locomotors signs (P ≤ 0.05).  As well as, more likely to present tumoriform lesions in the liver, spleen, kidneys and heart P ≤ 0.05, as well as lesions in the proventriculus, muscle lesions and in the sciatic nerve P ≤ 0.05. Laying poultry, backyard poultry production and young poultry constitute risk factors for DM (P ≤ 0.05).  The results showed that samples with mycotoxicoses were at higher risk of developing DM (P ≤ 0.05). Poultry from industrial system had a higher risk of developing Gumboro disease (P ≤ 0.05). Besides that, domestic poultry with Gumboro disease were more likely to develop signs of depression, nerve signals, tegumentary changes, bursitis, hepatomegaly, renal lesions and splenomegaly (P ≤ 0.05).Discussion: In this research we can observe the domestic poultry with DM presenting tumoriform lesions in several organs, this finding is common in this disease, because it is one of the most frequent viral diseases of neoplastic characteristic. The results show that young birds are a risk factor for DM. In fact, previous works already affirm young birds as being susceptible to disease in relation to adult birds. In this study, laying hens presented a risk factor for DM, however other authors also observed in cut birds or in both types of production. Industrial poultry are at higher risk for DM, this was also reported by other authors, because the disease is of high contagion and morbidity, industrial birds are under high density which facilitates the contact and dissemination of the virus among sick and susceptible birds. In this study, industrial poultry were a risk factor for Gumboro disease, however, other studies show that there is no difference between types of breeding and can also occur in backyard birds. Young poultry and laying hens are more susceptible, and the clinical signs found in the study are compatible with those described in the literature. Through this research on viral diseases, we conclude that our study may complement the already existing official data, since, in a research conducted in the same period, it did not identify the presence of viral diseases in the Southern of RS, but with our research it was possible to register this disease

Efeito do extrato etanólico de própolis verde sobre a produção de anticorpos após imunização contra parvovírus canino (CPV) e coronavírus canino (CCoV)

Este estudo foi realizado para avaliar se extrato etanólico de própolis verde (EEP) pode interferir na produção de anticorpos específicos após imunização contra parvovírus (CPV) e coronavírus canino (CCoV). Camundongos foram vacinados com CPV e CCoV (0.75, 1.5 e 3 x 106 TCID50) com ou sem 400 μg/dose de EEP. Vinte e um dias após a terceira dose foi mensurado IgG sérica. A coadministração de EEP aumentou significativamente os níveis de IgG específica para o CPV em animais inoculados com a maior concentração do antígeno, e não teve influência sobre os níveis de anticorpos para CCoV. Os resultados indicam que o EEP tem ação imunomoduladora intimamente dependente do tipo e concentração do antígeno utilizado, sendo capaz de aumentar os níveis de anticorpos contra CPV.This study was designed to evaluate whether an ethanolic extract of green propolis (EEP) can interfere with production of specific antibodies after immunization against parvovirus (CPV) and canine coronavirus (CCoV). Mice were vaccinated with CPV and CCoV (0.75, 1.5 and 3 x 106 TCID50) with or without 400 μg/dose of the EEP. Twenty one days after the third dose was measured serum IgG. The co-administration of the EEP significantly enhanced serum specific IgG responses to CPV in animals inoculated with the highest concentration of the antigen, and had no influence on levels of antibodies to CCoV. The results indicate that the EEP has immunomodulatory action closely dependent on the type and concentration of antigen used, being able to increase the levels of antibodies to CPV

Development of an indirect ELISA for serological diagnosis of bovine herpesvirus 5

Bovine herpesviruses 1 and 5 (BoHV-1 and BoHV-5) are economically important pathogens, associated with a variety of clinical syndromes, including respiratory and genital disease, reproductive failure and meningoencephalitis. The standard serological assay to diagnose BoHV-1 and BoHV-5 infections is the virus neutralization test (VNT), a time consuming procedure that requires manipulation of infectious virus. In the present study a highly sensitive and specific single dilution indirect ELISA was developed using recombinant glycoprotein D from BoHV-5 as antigen (rgD5ELISA). Bovine serum samples (n = 450) were screened by VNT against BoHV-5a and by rgD5ELISA. Compared with the VNT, the rgD5ELISA demonstrated accuracy of 99.8%, with 100% sensitivity, 96.7% specificity and coefficient of agreement between the tests of 0.954. The rgD5ELISA described here shows excellent agreement with the VNT and is shown to be a simple, convenient, specific and highly sensitive virus-free assay for detection of serum antibodies to BoHV-5

Análises químicas e citotóxicas de três variedades de própolis brasileiras (própolis verde, própolis jataí e própolis marrom) e sua atividade in vitro anti-Sporothrix brasiliensis

In this study, we described the antifungal activity of three Brazilian propolis extracts: brown, green and from jataí bees against Sporothrix brasiliensis. The extracts were obtained from ethanolic extraction and their chemical composition was determined by high-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry. The cellular toxicity was measured in MDBK (Madin-Darby Bovine Kidney) cells and quantified by the MTT assay (3- (4,5 dimethylthiazol-2yl -2,5-diphenyl-2H bromine tetrazolato). For antifungal activity, the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum fungicidal concentration (MFC) were determined by broth microdilution. The results showed that cell toxicity was not observed at lower concentrations (0.097 to 0.39μg/ml) for all extracts in comparison to cell control. Among the chemical compounds identified, caffeic acid, p-coumaric acid, chlorogenic acid, ferulic acid and rutin were quantified. In antifungal activity, green and jataí did not exhibit activity against the isolates (MIC and MFC greater than 0.78mg/ml). However, all isolates of S. brasiliensis were sensitive to brown propolis (MIC of 0.09 to 0.78mg/ml), including the standard strain (P<0.001). Among the Brazilian propolis studied, the brown propolis showed activity against the S. brasiliensis isolates and more studies should be undertaken in order to evaluate its promising use in the treatment of sporotrichosis.Neste estudo, descreveu-se a atividade antifúngica de três extratos de própolis brasileiras: marrom, verde e de abelhas jataí (Tetragonisca angustula), contra Sporothrix brasiliensis. Os extratos foram obtidos de extração etanólica, e a sua composição química foi determinada por cromatografia líquida de alta eficiência, acoplada à espectrometria de massa. A toxicidade celular foi medida em células MDBK (Madin-Darby Bovine Kidney), avaliada por observação microscópica e quantificada pelo ensaio MTT (3- (4,5-dimetiltiazol-2-ilo -2,5-difenil-2H bromo tetrazolato). Para a atividade antifúngica, determinou-se a concentração inibitória mínima (CIM) e a concentração fungicida mínima (CFM) por meio de microdiluição em caldo. Os resultados mostraram que a toxicidade celular não foi observada em concentrações menores (0,097 a 0,39μg/ml). Entre os compostos químicos identificados, foram quantificados o ácido cafeico, ácido p-cumárico, ácido clorogênico, ácido ferúlico e a rutina. Na atividade antifúngica, as própolis verde e jataí não apresentaram atividade contra os isolados (CIM e CFM maior que 0,78mg/ml), porém todos os isolados de S. brasiliensis foram sensíveis à própolis marrom (CIM de 0,09 a 0,78mg/ml), incluindo a cepa padrão (P<0,001). Entre as própolis brasileiras estudadas, a marrom mostrou atividade contra S. brasiliensis, e mais estudos devem ser realizados para avaliar seu uso promissor no tratamento da esporotricose

Inibição do vírus da arterite equina por um peptídeo antimicrobiano produzido pelo Bacillus sp. P34

P34 is an antimicrobial peptide produced by Bacillus sp. P34, isolated from the intestinal contents of a fish from the Amazon basin. This peptide showed antibacterial properties against Gram-positive and Gram-negative bacteria and was characterized as a bacteriocin like substance. It was demonstrated that the peptide P34 exhibited antiviral activity against feline herpesvirus type 1 in vitro. The aim of this work was to evaluate P34 for its antiviral properties in vitro, using RK 13 cells, against the equine arteritis virus, since it has no specific treatment and a variable proportion of stallions may become persistently infected. The results obtained show that P34 exerts antiviral and virucidal activities against equine arteritis virus, probably in the viral envelope. The antiviral assays performed showed that P34 reduces significantly the viral titers of treated cell cultures. The mechanism of action of P34 seems to be time/temperature-dependent. This peptide tends to be a promising antiviral compound for the prevention and treatment of arteriviral infections since it has a high therapeutic index. However, more detailed studies must be performed to address the exact step of viral infection where P34 acts, in order to use this peptide as an antiviral drug in vivo in the future.P34 é um peptídeo antimicrobiano produzido pelo Bacillus sp. P34, isolado do conteúdo intestinal de um peixe na Bacia Amazônica. Esse peptídeo demonstrou propriedades antibacterianas contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e foi caracterizado como uma substância do tipo bacteriocina. Foi demonstrado que o peptídeo P34 exibiu atividade antiviral contra o herpesvírus felino tipo 1 in vitro. O objetivo deste trabalho foi avaliar o P34 in vitro, em cultivo de células RK 13, contra o vírus da arterite equina, uma vez que não há tratamento específico e uma variável proporção de garanhões pode permanecer persistentemente infectada. Os resultados obtidos mostram que o peptídeo exerce atividade antiviral e virucida contra o vírus da arterite equina, agindo provavelmente no envelope viral. Os ensaios antivirais realizados demonstraram que o P34 reduz significativamente os títulos do vírus nas células infectadas e tratadas. O mecanismo de ação do P34 parece ser tempo/temperatura dependente. Esse peptídeo tende a ser um antiviral promissor para o tratamento e a prevenção das infecções por arterivírus, tendo em vista que ele possui um alto índice terapêutico. Contudo, estudos mais detalhados devem ser realizados para precisar a etapa exata da infecção viral em que o P34 age, para que ele possa ser usado como antiviral in vivo no futuro

Evaluation of the immunomodulator activity of green propolis extract in animals vaccinated with swine herpesvirus type 1 (SuHV-1) or bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5)

Vaccine formulation often requires the use of adjuvants which enhance or potentiate humoral and/or cellular responses. Nowadays, many vaccines are formulated with substances such as aluminum hydroxide or oily emulsions, specific for veterinary use. However, the interest on the evaluation of natural substances with adjuvant potential like plant extracts has grown. Propolis produced by honey bees from exudates collected from plants has call the attention of researchers due to several bioactive properties reported, such as antiviral, antiinflamatory and antitumoral action. In addition, although the mechanism of action remains unknown, propolis presents activity on the immune system. The aim of this study was to evaluate the immunomodulator activity of an ethanolic extract of Brazilian green propolis, when used as adjuvant in inactivated vaccines against swine herpesvirus type 1 (SuHV-1) or bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5). The addition of 5 mg/dose of the extract to a vaccine with aluminum hydroxide against SuHV-1 increased the humoral immune response of mice, when compared to the same vaccine without propolis (P<0,01). This effect was more evident when the vaccine was diluted (1:4 and 1:8). The raise in neutralizing antibodies titer, expressed in log2, went from 3 to 4.48 and 2.18 to 4.48, respectively, suggesting that the smaller the antigenic mass or less immunogenic the antigen, more pronounced is the adjuvant effect of propolis. When propolis was used on its own with the antigen, an increase in the titer of neutralizing antibodies determined by seroneutralization was not observed. Besides increasing the humoral immune response, the use of propolis also increased the cellular response, increasing mRNA synthesis of IFN-? in mice splenocytes, measured by RT-PCR. This increase was also observed in the group of animals immunized only with antigen and propolis, unlike the effect observed on the humoral response. The adjuvant effect of propolis was also demonstrated when mice were challenged with 31.6 lethal doses of SuHV-1, 21 days after the second inoculation. The addition of propolis to the vaccine with aluminum hydroxide increased the percentage of protected animals, especially in the higher dilutions, comparing to the vaccine without propolis. Similar result was observed in the group of animals vaccinated only with propolis and antigen. The association of 40 mg/dose of ethanolic extract of green propolis to the oily vaccine against BoHV-5 increased titer of bovine neutrali zing antibodies (P<0,01), when compared to a vaccine without propolis. Thirty days after the second dose the titer went from 35 to 54, and after the third dose it increased from 43 to 67. In addition, there was an increase in the percentage of animals with titer above 32. The inclusion of 20 mg/dose of the extract did not alter the humoral response. The chromatographic analysis of propolis by HPLC showed high levels of phenolic compounds as artepillin C and cynamic acid derived, which may be the main substances with action on the immunologic system. Therefore, green propolis ethanolic extract acted as an adjuvant substance, increasing humoral and cellular immune responses in mice and humoral response in bovines, improving the efficiency of experimental vaccines.A formulação de vacinas frequentemente requer o uso de adjuvantes que prolongam ou potencializam as respostas imunes humoral e/ou celular. Atualmente, muitas vacinas são formuladas a partir de substâncias como o hidróxido de alumínio ou emulsões oleosas, específicas para uso veterinário. Contudo, tem sido crescente o interesse pela avaliação de substâncias naturais com potencial adjuvante, como os extratos derivados de plantas. A própolis, produzida pelas abelhas a partir de exsudatos coletados de plantas, tem despertado o interesse de pesquisadores em função das inúmeras propriedades bioativas relatadas, como ação antiviral, antiinflamatória e antitumoral. Além disso, apesar de desconhecidos muitos dos mecanismos de ação, a própolis apresenta atividade sobre o sistema imune. O objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade imunomoduladora de um extrato etanólico da própolis verde brasileira, quando utilizado como adjuvante em vacinas inativadas contra o herpesvírus suíno tipo 1 (SuHV-1) ou herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5). A adição de 5 mg/dose do extrato a uma vacina com hidróxido de alumínio contra o SuHV-1 incrementou a resposta imune humoral de camundongos, quando comparado com a mesma vacina sem própolis (P<0,01). Este efeito foi mais evidente quando a vacina foi diluída (1:4 e 1:8), podendo-se observar um aumento no título de anticorpos neutralizantes, expresso em log2, que passou de 3 para 4,48 e de 2,18 para 4,48, respectivamente, sugerindo que quanto menor a massa antigênica ou menos imunogênico o antígeno, mais pronunciado é o efeito adjuvante da própolis. Quando a própolis foi utilizada isoladamente com o antígeno, não foi observado aumento no título de anticorpos neutralizantes, determinado por soroneutralização. Além de incrementar a resposta imune humoral, o uso da própolis também aumentou a resposta celular, elevando a síntese de mRNA de IFN-? nos esplenócitos dos camundongos, mensurada pela técnica de RT-PCR. Este aumento foi observado inclusive no grupo de animais imunizados somente com antígeno e própolis, contrariando os resultados da resposta humoral. O efeito adjuvante da própolis foi evidenciado também quando camundongos foram desafiados com 31,6 doses letais do SuHV-1, 21 após a segunda inoculação. A adição da própolis à vacina com hidróxido de alumínio aumentou o percentual de animais protegidos, especialmente nas maiores diluições, em comparação à vacina sem própolis. Resultado semelhante foi observado no grupo de animas vacinados somente com própolis e antígeno. A associação de 40 mg/dose do extrato etanólico de própolis verde à vacina oleosa contra BoHV-5 aumentou o título de anticorpos neutralizantes de bovinos (P<0,01), quando comparado à vacina sem própolis. Trinta dias após a segunda vacinação, o título passou de 35 para 54 e aumentou de 43 para 67, trinta dias após a terceira vacinação. Além disso, houve aumento no percentual de animais com títulos elevados, acima de 32. A inclusão de 20 mg/dose do extrato não alterou a resposta humoral. A análise cromatográfica da própolis por HPLC revelou altos níveis de compostos fenólicos como o artepillin C e derivados do ácido cinâmico, que podem ter sido as principais substâncias com ação sobre o sistema imunológico. Portanto, o extrato etanólico de própolis verde atuou como uma substância adjuvante, incrementando as respostas imunes humoral e celular em camundongos e humoral em bovinos, melhorando a eficiência das vacinas experimentais