Development of a phage-based biosensor to detect Salmonella in food stuff

Tese de doutoramento Programa Doutoral em Engenharia Química e BiológicaFood- and waterborne illnesses are a serious public health concern worldwide and have stimulated research aiming at a rapid and accurate detection of pathogens by applying biosensing technologies. Salmonella, Campylobacter and E. coli are some examples of pathogens that have an enormous impact on public health. Many publications have mentioned different type of biosensors for a broad range of bacteria. These methods may circumvent the limitations that conventional microbiological techniques have. Pathogens of interest need culture enrichment steps to reach the detection limit, a process that requires time, as well as laboratory technicians with expertise skills. Detection of pathogens at a very early stage is not as easy as it seems, due to the necessity to unite a set of characteristics that enable the development of an inexpensive and robust biosensor. The ideal biosensing system should be rapid and accurate and should combine specificity and sensitivity, leading to a marginal amount of false positive or negative results. As the biosensor is composed of two parts, a biological and a sensor element, the biorecognition element of choice plays a crucial role when creating the perfect biosensor. Bacteriophages (or simply phages) are viruses that specifically recognize bacteria and this characteristic can be used as a potential "key" to solve problems related with bacterial detection. Moreover, the easy and low cost production of these viruses combined with their stability in harsh environmental conditions make them excellent competitors with other biological elements (e.g. antibodies, enzymes). The use of phages as a therapeutic agent and as an interface in detection systems has gained special interest of the research community. In many laboratories, phage-based platforms have been developed; however only a few have broken the barrier and went to the market as a clinical diagnostic tool. Nowadays, the food sector still uses conventional methods to detect Salmonella in food stuff that, as mentioned before, take times and requires expert skills. Notwithstanding the great improvements in the detection area, biosensing systems still lack sensitivity and give erroneous results. Furthermore, problems related to the detection of bacteria in a viable but nonculturable (VBNC) state is one of the concerns that can give false negatives. VBNC bacteria are not able to grow on standard bacteriological media, but are metabolically active, albeit very low, maintaining the capacity to cause diseases and therefore remain a potential risk in several health facilities and the food industry. The use of standard microbiological methods to detect if the bacterium is dead or alive is no practicable, since the presence of VBNC state is not detectable. Therefore, novel technologies that can overcome this barrier are imperative. The prevalence of this problem and the necessity of finding a detection technology that can fulfill the Salmonella detection needs, led to the proposal of the present work that explores phages as an interface in a magnetoresistive and magnetoelastic biosensor. The work presented herein describes the characterization of a broad host range lytic phage. PVP-SE1, is able to discriminate between cell viability states, including the VBNC condition. This phage was combined with highly sensitive magnetoresistive sensors originating a powerful detection system with highstandard performance at the accuracy, specificity but also sensitivity level, detecting bacteria concentrations in the order of 100 cells/μL (3-4 cells/sensor). Another strategy followed, aiming at circumventing the limitations of using whole phages in a biosensing interface, was the utilization of recognition peptides of phage origin, responsible for the identification of the hosts. The proof-of-concept was demonstrated with a model phage selected from landscape library as a streptavidin binder. The results showed that the streptavidin binding peptides extracted from the phage bind to streptavidin with the same or better affinity than the native phage. The same was demonstrated with the tail fibre proteins of phage PVP-SE1, heterologously expressed, which showed equal binding affinities compared to their parental phage. This work demonstrates how phages can be explored in the development of a biosensor, opening the possibility of using an accurate, sensitive, specific and cheaper device that can be applied to an emergent concern: foodborne pathogens.As doenças transmitidas através de alimentos e água contaminada são uma preocupação mundial e têm estimulado o desenvolvimento de métodos rápidos e precisos na área dos biossensores para a deteção de agentes patogénicos. Salmonela, Campylobacter e a E. coli são exemplos de espécies bacterianas patogénicos que tem um enorme impacto na saúde pública. Atualmente já existem diferentes tipos de biossensores desenvolvidos para uma ampla variedade de bactérias, que contornam as limitações das técnicas convencionais, tais como tempo de medida, devido à amplificação do microrganismo de interesse no seu adequado meio de cultura, e pela necessidade de técnicos com competências específicas. No entanto, a deteção de agentes patogénicos não é assim tão fácil como parece devido à necessidade de combinar um conjunto de características que permita o desenvolvimento de um biossensor robusto e pouco dispendioso. Um sistema de deteção ideal deve ser rápido, preciso e combinar características como especificidade e sensibilidade, de forma a conduzir a resultados livres de falsos positivos/negativos. Como o biossensor é composto por duas partes, i.e. um elemento biológico e um sensor, o elemento biológico escolhido tem um papel crucial no momento da criação de um biossensor perfeito. Bacteriófagos (ou simplesmente fagos) são vírus que infetam especificamente bactérias podendo essa característica ser utilizada como uma “chave” para solucionar problemas relacionados com a deteção de bactérias. Para além disso, a produção simples e económica destes vírus juntamente com a sua estabilidade em condições ambientais adversas, torna-os excelentes ferramentas de deteção, podendo competir com outros elementos biológicos (e.g. anticorpos, enzimas). A sua utilização como agentes terapêuticos e como interface em sistemas de deteção tem recebido uma atenção especial por parte da comunidade científica. Muitos laboratórios têm desenvolvido plataformas de deteção à base de fagos, no entanto, somente algumas conseguiram quebrar a barreira e entrar no mercado para serem usadas como ferramenta deteção para uso clinico. Hoje em dia, indústrias alimentares ainda usam métodos convencionais para detetar Salmonela na alimentação que, tal como previamente referido, são morosas e exigem mão de obra especializada. Mesmo utilizando diversas estratégias de deteção com diferentes plataformas e bio recetores, problemas com resultados falsos positivos e negativos permanecem difíceis de resolver. Bactérias viáveis, mas não cultiváveis são uma preocupação, porque estão relacionadas com resultados falsos negativos. Bactérias viáveis, mas não cultiváveis, não têm capacidade de crescer em meios de cultura convencional, mas encontram-se metabolicamente ativas, conservando a sua capacidade de causar doenças e de serem um potencial perigo em várias setores da saúde e na industria alimentar. Assim, a utilização de métodos de cultura padronizados para detetar se a bactéria está viva ou morta torna-se inviável, já que a presença de bactérias num estado viável, mas não cultivável não é detetada. Portanto, novas tecnologias que possam ultrapassar essa barreira são fundamentais. A prevalência deste problema e a necessidade de encontrar uma tecnologia de deteção que possa satisfazer as necessidades de deteção da Salmonela conduziu à proposta deste trabalho que explora os fagos como uma possível interface a usar em biossensores magneto-resistivos e magneto-elásticos. O trabalho presentado aqui descreve a caracterização de um fago lítico com um amplo espectro lítico, PVP-SE1. Este fago provou capacidade em discriminar os estados de viabilidade celular incluindo o estado viável, mas não cultivável. O fago foi combinado com sensores magneto-resistivos, que têm mostrado uma elevada sensibilidade. Esta combinação originou um poderoso sistema de deteção com um padrão de desempenho elevado, quer em termos de precisão e especificidade, quer em termos de sensibilidade, detetando concentrações de bactérias na ordem de 100 células/μL (3-4 células/sensor). Uma outra estratégia adotada, tendo por objetivo contornar as limitações da utilização dos fagos inteiros numa interface de um biossensor, passou pela utilização dos recetores dos fagos responsáveis pela identificação dos hospedeiros. Como prova de conceito um fago com especificidade de ligação à streptavidin foi selecionado a partir de uma biblioteca de fagos e usado como modelo. Os resultados demonstraram que os recetores do fago ligam-se à streptavidin com a mesma ou melhor afinidade do que o fago inteiro (original). O mesmo foi demonstrado com os recetores do fago PVP-SE1, demonstrando igualmente afinidades de ligação, comparativamente, com o seu fago parental. Este trabalho demonstrou como os fagos podem ser explorados no desenvolvimento de um biossensor abrindo a possibilidade de desenvolver um dispositivo preciso, sensível, específico e económico que possa ser aplicado a uma preocupação emergente: os patogénicos de origem alimentar

Discrete Dynamical Systems: A Brief Survey

Dynamical system is a mathematical formalization for any fixed rule that is described in time dependent fashion. The time can be measured by either of the number systems - integers, real numbers, complex numbers. A discrete dynamical system is a dynamical system whose state evolves over a state space in discrete time steps according to a fixed rule. This brief survey paper is concerned with the part of the work done by José Sousa Ramos [2] and some of his research students. We present the general theory of discrete dynamical systems and present results from applications to geometry, graph theory and synchronization

A argumentação na aula de matemática: um estudo colaborativo

Tese de mestrado, Educação (Didáctica da Matemática), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2009Este estudo pretende contribuir para a compreensão do trabalho do professor relativamente à argumentação na aula de Matemática, identificando as suas dificuldades e estratégias e procurando perceber o contributo que o trabalho colaborativo, assente na reflexão, tem no seu desenvolvimento profissional. Neste estudo entende-se a argumentação na aula de Matemática como um processo social e discursivo que envolve a discussão sobre ideias, convergentes ou não, com o objectivo de justificar e convencer. A metodologia é interpretativa-qualitativa, e baseada num trabalho colaborativo. Os participantes nesta investigação são a professora Rita e a sua turma do 7.º ano de escolaridade. Os dados recolhidos têm como principais fontes as sessões de trabalho colaborativo (pré e pós aula), as aulas de Rita e as suas reflexões escritas. Os resultados mostram que a valorização pelo professor da argumentação na sala de aula é um factor determinante na sua promoção. Esta valorização tem consequências na planificação das aulas, contemplando momentos de trabalho dos alunos e de discussão colectiva, e na condução do discurso da aula, marcado pela procura de razões que justifiquem e validem as ideias. O protagonismo partilhado entre o professor e os alunos, nomeadamente na validação e sistematização das ideias, contribui para a criação de uma comunidade argumentativa. Salienta-se a importância da instituição de normas de interacção referentes à participação e à justificação como meio de envolvimento dos alunos na actividade argumentativa. As principais dificuldades têm origem nas concepções dos alunos sobre a actividade na aula de Matemática e na sua resistência em adoptar uma atitude positiva face à discussão de ideias. A persistência de Rita quanto aos pedidos de justificação, a insistência na necessidade do diálogo entre os alunos e a valorização da apresentação de argumentos mostraram ser estratégias adequadas para ultrapassar as dificuldades na promoção da argumentação como uma actividade da aula de Matemática. O trabalho colaborativo permitiu a Rita reflectir sobre a argumentação em geral e sobre a sua integração no processo ensino-aprendizagem da Matemática, contribuindo decididamente para a mudança e evolução da sua prática profissional.This study intends to contribute to the understanding of the work of the teacher regarding argumentation in the mathematics class. It seeks to identify the difficulties and the strategies of the teacher and to understand the possible contribute of collaborative work, based in reflection, towards his/her professional development. In this study, argumentation in the mathematics class, means a social and discursive process that involves the discussion of ideas, convergent or not, with the goal to justify and to convince. The methodology is interpretative-qualitative, based on collaborative work. The participants in this study are the teacher Rita and her grade 7 class. The data collected is drawn from the sessions of collaborative work (before and after classes), the classes and Rita’s written reflections. The results show that the value that the teacher ascribes to argumentation in the classroom is a determinant factor for its promotion. Such value has consequences in lesson planning, contemplating moments of pupils’ autonomous work and collective discussion, and in conducting classroom discourse, marked for the search of reasons that justify and validate ideas. The shared leading roles of teacher and pupils, notably the validation and systematization of ideas, contributes for the creation of an argumentative community. Salient is the importance of instituting norms of interaction relative to participation and justification as a means of involvement of pupils in argumentative activity. The main difficulties have origin in the conceptions of the pupils regarding the activity in the mathematics class and their resistance in adopting a positive attitude towards the discussion of ideas. The persistence of Rita in demanding justifications, the insistence in the necessity of dialogue among pupils and the emphasis in the presentation of validity arguments showed to be strategies that help to surpass the difficulties in promoting argumentation as an activity in the mathematics class. The collaborative work allowed Rita to reflect on argumentation in a general way and on its role in mathematics teaching and learning, contributing decidedly for the change and evolution of her professional practice

Ações de controlo em operadores agrícolas com Produção Integrada e Modo de Produção Biológica em diferentes concelhos do Norte Interior de Portugal

A certificação tem como finalidade comunicar e garantir a terceiros determinadas características de um produto ou de um Modo de Produção, que comprova que cumpre com os requisitos definidos. A Produção Integrada (PI) e o Modo de Produção Biológica (MPB) são modos de produção agrícola que têm por base um profundo conhecimento do ecossistema agrário, com o objetivo de produzir produtos de qualidade, usando práticas agrícolas que respeitem o equilíbrio dos agroecossistemas protegendo desta forma o ambiente e a saúde dos consumidores. A certificação destes modos de produção é obrigatória para que os operadores possam ter acesso às Medidas Agroambientais. O presente trabalho foi desenvolvido numa empresa que presta serviços de certificação e controlo de produtos agrícolas de origem vegetal, animal e apícola, abrangidos por regimes de qualidade, que faz a verificação do cumprimento de normas-regulamentos ou especificações técnicas, acreditado pelo Instituto Português de Acreditação (IPAC). E teve por objetivos a verificação dos procedimentos nas explorações agrícolas submetidas às Medidas Agro-Ambientais referentes ao Modo de Produção Integrada e Modo de Produção Biológico. A verificação decorreu através de visitas de campo e questionários a agricultores que realizaram contrato com o organismo de certificação, nos concelhos de Figueira de Castelo Rodrigo, Freixo de Espada À Cinta, Miranda do Douro, Mogadouro, Torre de Moncorvo e Vila Nova de Foz Côa, a fim de verificar se os operadores cumprem com a legislação e orientações dos Modos de Produção. Nos concelhos avaliados, para PI e para MPB foi respetivamente os concelho de Mogadouro e Freixo de Espada à Cinta onde se procedeu a um maior controlo de área e também maior número de operadores. As culturas vegetais de Olival, Frutos Secos são as que representam maior impacto nas candidaturas do pedido único na maior parte dos concelhos em estudo. Apresentaram algumas não conformidades referentes às regras impostas que põem em causa a certificação dos produtos obtidos podendo não ser comercializado e rotulado com o logótipo do modo de produção. Contudo a classificação do risco é ausente ao nível das unidades de produção agrícola.The purpose of certification is to communicate and guarantee to third parties certain characteristics of a product or a Mode of Production, which proves that it meets the defined requirements. Integrated Production (IP) and Organic Production Mode (MPB) are agricultural production methods based on a deep knowledge of the agricultural ecosystem, with the objective of producing quality products, using agricultural practices that respect the balance of agroecosystems protecting, in this way the environment and the health of consumers. Certification of these modes of production is mandatory for operators to have access to the Agro-environmental Measures. The present work was developed in a company that provides certification and control services for agricultural products of plant, animal and apicultural origin, covered by quality schemes, which verifies compliance with norms-regulations or technical specifications, accredited by the Portuguese Institute of Accreditation (IPAC). Its objectives were to verify the procedures on farms submitted to the Agro-Environmental Measures regarding the Integrated Production Mode and Biological Production Mode. The verification was carried out through field visits and questionnaires to farmers who contracted with the certification body in the municipalities of Figueira de Castelo Rodrigo, Espada À Cinta, Miranda do Douro, Mogadouro, Torre de Moncorvo and Vila Nova de Foz Côa , in order to verify that the operators comply with the legislation and guidelines of the Production Modes. In the municipalities evaluated, for PI and MPB, respectively, the municipalities of Mogadouro and Freixo de Espada à Cinta present the greater control of the area was carried out, as well as a larger number of operators. Vegetable crops of Olive groves and Nuts are the ones that have the greatest impact on single application in most of the counties under study. They presented some non-conformities concerning the imposed rules that call into question the certification of the products obtained and may not be marketed and labeled with the production mode logo. However, the classification of risk is absent at the level of agricultural production units

Estudo de prevalência usando métodos capture-recapture: deficiência visual em Portugal

Tese de doutoramento em MatemáticaVisual impairment (VI) due to eye diseases remains a significant health problem worldwide and, also, in Europe. There are an estimated 15 million people suffering from moderate or severe visual impairment in Western Europe. VI has a significant impact on the quality of life by reducing functional status and interfering with the ability of the subject to maintain independence in a safe manner. Prevalence of VI needs to be estimated regularly so that the progress of the vision health of a population can be evaluated and monitored. In addition, it is important to ascertain the causes behind VI so that health programs can be designed to lower its prevalence. There is currently a lack of epidemiological information about the prevalence and causes of VI in Portugal. Therefore, the aim of this thesis was to determine the prevalence of VI in a large region Portugal using data from lists of cases of VI. Capture-recapture models have been applied in several disciplines, as biomedical sciences, epidemiology or ecology, to estimate the size of populations. In particular, they have been used to estimate the prevalence of several diseases or conditions. Developing these inferential models is of great importance to avoid the high costs and unreasonable time spending of cross-sectional studies. However, applying capture-recapture models is challenging, as they are very sensitive to list dependence and possible capture rates heterogeneity among subgroups of the population. In particular, applying these models to human population samples is additionally challenging, as in most epidemiologic studies only a small number of lists are available. There are two main differences between human and wildlife populations. First, human population lists generally have not a well-defined time order. Second, in wildlife studies there are often more trapping samples than in human population studies. In most epidemiologic surveys, only two to four lists are available. This can be problematic and is an additional difficulty when applying capture-recapture models in the context of human populations. The main objective of this work was to estimate the prevalence of VI using capture-recapture models. We estimated a crude prevalence of 1.97%,95%CI=[1.56,2.54] to the Northwest of Portugal in the time period between 2014 and 2015, specifically at the regions of Minho and Douro Litoral. Almost 2 of every 100 inhabitants of the Portuguese Northwest suffer from visual impairment. This prevalence value is in line with the values in some countries, particularly with Spain. Diabetic Retinopathy was the main cause (31%), followed by Cataract (15%), Age-related Macular Degeneration (14%) and Glaucoma (10%). This thesis provides a significant contribution to the understanding of the CR methodology in human populations and for the knowledge of the epidemiological information about VI in Portugal.A deficiência visual devido a doenças oculares continua a ser um problema de saúde significativo na Europa. Na Europa Ocidental, estima-se que 15 milhões de pessoas sofrem de deficiência visual moderada ou grave A deficiência visual tem um impacto significativo na qualidade de vida, reduzindo o estado funcional e interferindo na capacidade do sujeito em manter a sua independência de forma segura. Portanto, é importante que a sua prevalência seja estimada regularmente para que o progresso da saúde visual de uma população possa ser avaliado e monitorado. Além disso, é importante determinar as suas causas para que programas de saúde possam ser elaborados para reduzir a prevalência. De momento, há uma ausência de informação epidemiológica relativamente à prevalência e às causas da deficiência visual em Portugal. O principal objetivo desta tese é precisamente fornecer essa informação. Os modelos capture-recapture têm sido aplicados em diversas disciplinas, como ciências biomédicas, epidemiologia ou ecologia, para estimar a dimensão de populações. Em particular, têm sido usados para estimar a prevalência de várias doenças ou condições. O desenvolvimento destes modelos inferenciais é de grande importância para evitar os altos custos e o desmesurado dispêndio de tempo dos estudos cross-sectional. No entanto, a aplicação de modelos capture-recapture é um desafio, pois são muito sensíveis às dependências entre listas e possível heterogeneidade de probabilidades de captura entre subgrupos da população. Em particular, a aplicação destes modelos a populações humanas é um desafio adicional, pois na maioria dos estudos epidemiológicos apenas um pequeno número de listas está disponível. Existem duas diferenças principais entre as populações humanas e as de vida selvagem. Primeiro, as listas de populações humanas geralmente não têm uma ordem temporal bem definida. Em segundo lugar, nos estudos de vida selvagem, frequentemente existem mais listas do que em estudos de populações humanas. Na maioria dos estudos epidemiológicos, apenas duas a quatro listas estão disponíveis. Tal pode ser problemático e é uma dificuldade adicional na aplicação de modelos de capture-recapture no contexto de populações humanas. O objetivo principal deste trabalho foi estimar a prevalência da deficiência visual usando modelos de capture-recapture. Estimamos uma prevalência bruta de 1.97%,95%CI=[1.56,2.54] para o Noroeste de Portugal no período entre 2014 e 2015, especificamente nas regiões do Minho e Douro Litoral. Quase 2 em cada 100 habitantes do Noroeste Português sofrem de deficiência visual. Este valor de prevalência está em linha com os valores de alguns países, em particular da Espanha. A retinopatia diabética foi a principal causa (31%), seguida por catarata (15%), degeneração macular relacionada à idade (14%) e glaucoma (10%).This thesis was supported by Fundação para a Ciência e Tecnologia, SFRH/BD/119420/201