Effect of reduced nitrogen deposition on microbial activity, abundance and diversity in forest soils

The deposition of nitrogen has increased many-fold due to anthropogenic activities. Since forest ecosystems are often limited by N availability, elevated N inputs from the atmosphere can have a fertilization effect but in the long-term, excess N can influence above- and below-ground production. One of the consequences of N deposition and increased N inputs is a shift in microbial community structure and function as ecosystems move towards N saturation. Soil microorganisms through the action of enzymes play an important role in N dynamics. Thus, the availability and turnover of N depends strongly on microbial abundance, diversity and activity which are in turn influenced by soil properties. Studies on the effects of high nitrogen inputs and the response of forest ecosystems to nitrogen saturation are many and well understood. However, the reversibility of N-induced shifts in forest ecosystem processes is largely unknown. This thesis was therefore designed to study the response of soil microorganisms to reduced N deposition. A biphasic approach was employed to look into (i) the general microbial functional status of the Solling forest site as well as (ii) the microbial community structure which may be a key regulator of two important processes of N transformation: denitrification and proteolysis. The goal of the present thesis was addressed in three studies. Denitrification is considered sensitive to environmental changes and the response of nitrate-reducers and denitrifiers to reduced N deposition was determined in the first study. The goal of the second study was to investigate the overall microbial activity of the Solling forest profiles especially focussing on enzymes involved in the N cycle. This revealed a pronounced activity of peptidases whereby a set of novel pepN primers encoding alanine aminopeptidase enzyme was designed in the third study to determine the group of bacteria involved in proteolysis in forest as well as agricultural and grassland soils. The Solling experimental station was established more than two decades ago and it gave the opportunity to study the N cycle in a natural forest ecosystem at different sampling dates and depths. A combination of classical biological methods and modern molecular techniques were used in the studies. Soil physico-chemical parameters (OC, Nt, NO3-, NH4+, pH, % Water content) were analysed to gain more information on mineralization and immobilization of N in the soil profiles. The analysis of microbial biomass, ergosterol content and the activity of several enzymes of the N, C and P cycles as well as enzyme activity of nitrate reducers was determined in order to interpret microbial functions. The abundance of nitrate reducers and denitrifiers were determined by quantitative PCR of 16S rRNA, nitrate reductase (narG and napA) and denitrification (nirK, nirS and nosZ) genes. The diversity of peptide degrading bacteria was analysed by PCR, cloning and sequencing and the construction of pepN gene libraries. The results of the first study indicated that time and space were the main drivers influencing the abundance and activity of the nitrate reducers and denitrifier communities in the forest soil profiles. Reduced N deposition had a of minimal effect. Interestingly, the ratios of nosZ to16S rRNA gene and nosZ to nirK increased with soil depth thereby tempting to conclude that the size of denitrifiers capable of reducing N2O into N2 might be bigger in the mineral horizons. In the second study, a stronger response of N cycling enzymes to reduced N deposition could be seen. However, these responses especially that of specific peptidases differed in magnitude which could be indicative of a modification of the reaction rates of the different N cycling enzymes. Correlation of nutrients (N, C, P) with microbial biomass and enzyme activities in the soil profiles revealed that substrate availability was the main factor influencing microbial activity. In the third study, analyses of gene libraries from extracted DNA from forest, agricultural and glacier soil samples revealed a high diversity of pepN sequences related to mainly α-Proteobacteria. A majority of the sequences showed similarity to published data revealing that the amplified region of pepN might be conserved. Linking diversity and enzymatic data, lowest diversity was observed in the agricultural soil where activity levels of alanine aminopeptidase were lowest indicating the importance of diversity studies for ecosystem functioning. In conclusion, this thesis offers valuable contributions to understanding the impact of N deposition. The approach used was suitable to assess the response of the different microbial communities to reduced N deposition. The magnitude of the response depended strongly on space, time and substrate availability in soils as well as their interactions.Anthropogene Aktivitäten haben die Deposition von Stickstoff (N) um ein Vielfaches erhöht. Da Waldböden häufig N-limitiert sind, können erhöhte N-Einträge aus der Atmosphäre einen Düngungseffekt haben. Dies kann langfristig die oberirdische und unterirdische Pflanzenproduktion beeinflussen. Eine Folge von erhöhtem N-Eintrag ist die Veränderung der mikrobiellen Gemeinschaft sowie deren Funktion sobald das Ökosystem in Richtung N-Sättigung strebt. Aufgrund ihrer Enzymaktivitäten spielen Bodenmikroorganismen eine wichtige Rolle in N-Dynamiken. Die Verfügbarkeit und Umsetzung von N hängt daher stark von der mikrobiellen Abundanz, Diversität und Aktivität ab, die wiederum durch Bodeneigenschaften beeinflusst wird. Studien, die den Effekt von hohem N Eintrag und die Folgen von N-Sättigung in Waldökosystemen untersuchen, sind zahlreich und die Effekte und Folgen gut verstanden. Hingegen ist wenig bekannt inwieweit sich diese Veränderungen bei reduzierter N-Deposition umkehren. Daher wurden in dieser Doktorarbeit die Folgen einer reduzierten N-Deposition auf Bodenmikroorganismen untersucht. Ein biphasischer Ansatz wurde verwendet um 1) den generellen funktionellen mikrobiellen Status des Waldstandortes Solling und 2) die mikrobielle Gemeinschaftsstruktur, die ein wichtiger Regulator für zwei wichtige N-Transformationsprozesse, die Denitrifikation und die Proteolyse, sein könnte, zu untersuchen.Zur Erreichung des Ziels dieser Arbeit wurden drei Studien durchgeführt. Denitrifikation reagiert sensitiv auf Veränderungen der Umweltbedingungen und die Reaktion von nitratreduzierenden und denitrifizierenden Mikroorganismen auf reduzierte N Bedingungen wurde in der ersten Studie untersucht. Das Ziel der zweiten Studie war es, mit dem Fokus auf die Enzyme, die in den N-Kreislauf involviert sind, die mikrobielle Aktivität der Solling Waldprofile zu untersuchen. Eine ausgeprägte Aktivität von Peptidasen wurde festgestellt woraufhin in der dritten Studie ein neuer Satz pepN primer entwickelt wurden, die Alanin Aminopeptidasen kodieren, um die Gruppen der Bakterien zu bestimmen, die an der Proteolyse in Waldböden sowie in landwirtschaftlich genutzten und Grünland Böden beteiligt sind.Die Solling Forschungsstation wurde vor mehr als 20 Jahren aufgebaut und gab uns die Möglichkeit den N-Kreislauf in einem natürlichen Waldökosystem zu unterschiedlichen Zeitpunkten und Bodentiefen zu untersuchen. Eine Kombination klassischer und moderner molekularer Methoden wurde in den Studien verwendet. Wir analysierten bodenphysikochemische Parameter (OC, Nt, NO3-, NH4+, pH, % Wassergehalt), um mehr Informationen über Mineralisation und Immobilisation von N in den Bodenprofilen zu erhalten. Die Bestimmung der mikrobiellen Biomasse, des Ergosterol Gehalts und die Aktivität von mehreren Enzymen des N, C und P-Kreislaufs wie auch Enzymaktivitäten nitratreduzierender Organismen wurde genutzt, um die mikrobiellen Funktionen interpretieren zu können. Die Abundanz von nitratreduzierenden und denitrifizierenden Bakterien wurde mit quantitativer PCR der 16S rRNA, Nitratreduktase (narG und napA) und denitrifizierenden (nirK, nirS und nosZ) Funktionsgenen bestimmt. Die Diversität der peptidabbauenden Bakterien wurde mittels PCR, Klonierung und Sequenzierung sowie des Aufbaus von pepN Genbibliotheken untersucht. Die Ergebnisse der ersten Studie deuten darauf hin, dass Zeitpunkt und Bodentiefe die Haupteinflussfaktoren für die Abundanz und die Aktivität der nitratreduzierenden und denitrifizierenden Gemeinschaften im Waldprofil darstellen. Reduzierte N Deposition war von geringer Bedeutung. Interessanterweise erhöhten sich die Verhältnisse von nosZ zu 16S rRNA Genen und nosZ zu nirK in der Tiefe, was darauf schließen lässt, dass denitrifizierende Organismen, die fähig sind N2O zu N2 zu reduzieren, im Mineralbodenhorizont in größerer Zahl vorkommen könnten als in den oberen Horizonten. In der zweiten Studie wurde eine stärkere Reaktion der am N-Kreislauf beteiligten Enzyme bei reduzierter N Deposition festgestellt. Diese Reaktionen, insbesondere die der spezifischen Peptidasen, veränderten sich, was darauf hindeuten könnte, dass sich die Effizienz der unterschiedlichen am N-Kreislauf beteiligten Enzyme anpassen. Korrelationen von Nährstoffen (N, C, P) mit der mikrobiellen Biomasse and den Enzymaktivitäten im Bodenprofil verdeutlichen, dass die Substratverfügbarkeit der Hauptfaktor für die mikrobielle Aktivität war. In der dritten Studie, in der Gen-Bibliotheken von aus Wald-, landwirtschaftlichen und Gletscher Böden extrahierter DNA analysiert wurden, zeigte sich eine hohe Diversität der pepN Sequenzen, die hauptsächlich α-Proteobakterien zugeordnet werden konnten. Ein Großteil der Sequenz zeigte Ähnlichkeit mit bereits publizierten Daten, was darauf hindeuten könnte, dass die amplifizierte Region pepN konserviert ist. Bei der Betrachtung der Diversitäts- und Enzymdaten wurde die geringste Diversität in dem landwirtschaftlich genutzten Boden gefunden, der auch die geringsten Aktivitäten der Alanin-Aminopeptidase aufwies, was auf die Bedeutung von Diversitätsstudien für das Funktionieren von Ökosystemen hindeutet.Zusammenfassend leistet diese Doktorarbeit wertvolle Beiträge, um den Einfluss von N Deposition zu verstehen. Der verwendete Ansatz war geeignet, um die Reaktion der unterschiedlichen mikrobiellen Gemeinschaften auf reduzierte N Deposition einzuschätzen. Die Höhe der Reaktion hing stark von der Bodentiefe, des Zeitpunktes und der Substratverfügbarkeit sowie deren Interaktion ab

Microbial biomass and enzyme activities under reduced nitrogen deposition in a spruce forest soil

High N availability resulting from anthropogenic emissions can alter the activities of enzymes involved in the breakdown of organic compounds in ecosystems. In a spruce forest stand in Solling, central Germany, the nitrogen contained in throughfall water was adjusted to pre-industrial concentrations and resprinkled as "clean rain" onto the forest floor. Soil was sampled from the clean rain and control plot at three different dates and four horizons. We investigated the response of active microbial biomass (SIR) and fungal biomass (ergosterol content) and 15 enzymes to the reduction of N deposition. Some N-cycling enzymes (urease, arginine deaminase, alanyl aminopeptidase, lysyl-alanyl aminopeptidase) showed increased activities whereas others (N-acetyl-glucosaminidase, protease, leucyl aminopeptidase, alanyl-alanyl-phenyl aminopeptidase) decreased under reduced N treatment indicating a modification of the reaction rates of different enzymes involved in N cycling. For the C- and P-cycling enzymes, alpha- and beta-glucosidase as well as phosphatase activities increased in the clean rain treatment in spring 2006 in Oe and Oa horizons, respectively, but did not affect the pattern of substrate decomposition. Spatial variability of microbial biomass and enzyme activities within the soil profile indicated that the decrease in microbial activity with depth was driven by resource allocation. (C) 2009 Elsevier B.V. All rights reserved.Martin Luther University Halle-Wittenberg; DFG [PAK 12

Response of total and nitrate-dissimilating bacteria to reduced N deposition in a spruce forest soil profile

International audienceA field-scale manipulation experiment conducted for 16 years in a Norway spruce forest at Solling, Central Germany, was used to follow the long-term response of total soil bacteria, nitrate reducers and denitrifiers under conditions of reduced N deposition. N was experimentally removed from throughfall by a roof construction ('clean rain plot'). We used substrate-induced respiration (SIR) to characterize the active fraction of soil microbial biomass and potential nitrate reduction to quantify the activity of nitrate reducers. The abundance of total bacteria, nitrate reducers and denitrifiers in different soil layers was analysed by quantitative PCR of 16S rRNA gene, nitrate reduction and denitrification genes. Reduced N deposition temporarily affected the active fraction of the total microbial community (SIR) as well as nitrate reductase activity. However, the size of the total, nitrate reducer and denitrifier communities did not respond to reduced N deposition. Soil depth and sampling date had a greater influence on the density and activity of soil microorganisms than reduced deposition. An increase in the nosZ/16S rRNA gene and nosZ/nirK ratios with soil depth suggests that the proportion of denitrifiers capable of reducing N2O into N2 is larger in the mineral soil layer than in the organic layer

Evidence for the importance of litter as a co-substrate for MCPA dissipation in an agricultural soil

International audienceEnvironmental controls of 2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid (MCPA) degradation are poorly understood. We investigated whether microbial MCPA degraders are stimulated by (maize) litter and whether this process depends on concentrations of MCPA and litter. In a microcosm experiment, different amounts of litter (0, 10 and 20 g kg(-1)) were added to soils exposed to three levels of the herbicide (0, 5 and 30 mg kg(-1)). The treated soils were incubated at 20 A degrees C for 6 weeks, and samples were taken after 1, 3 and 6 weeks of incubation. In soils with 5 mg kg(-1) MCPA, about 50 % of the MCPA was dissipated within 1 week of the incubation. Almost complete dissipation of the herbicide had occurred by the end of the incubation with no differences between the three litter amendments. At the higher concentration (30 mg kg(-1)), MCPA endured longer in the soil, with only 31 % of the initial amount being removed at the end of the experiment in the absence of litter. Litter addition greatly increased the dissipation rate with 70 and 80 % of the herbicide being dissipated in the 10 and 20 g kg(-1) litter treatments, respectively. Signs of toxic effects of MCPA on soil bacteria were observed from related phospholipid fatty acid (PLFA) analyses, while fungi showed higher tolerance to the increased MCPA levels. The abundance of bacterial tfdA genes in soil increased with the co-occurrence of litter and high MCPA concentration, indicating the importance of substrate availability in fostering MCPA-degrading bacteria and thereby improving the potential for removal of MCPA in the environment