MicroRNA MIR396 regulates the switch between stem cells and transit-amplifying cells in arabidopsis roots

To ensure an adequate organ mass, the daughters of stem cells progress through a transit-amplifying phase displaying rapid cell division cycles before differentiating. Here, we show that Arabidopsis thaliana microRNA miR396 regulates the transition of root stem cells into transit-amplifying cells by interacting with GROWTH-REGULATING FACTORs (GRFs). The GRFs are expressed in transit-amplifying cells but are excluded from the stem cells through inhibition by miR396. Inactivation of the GRFs increases the meristem size and induces periclinal formative divisions in transit-amplifying cells. The GRFs repress PLETHORA (PLT) genes, regulating their spatial expression gradient. Conversely, PLT activates MIR396 in the stem cells to repress the GRFs. We identified a pathway regulated by GRF transcription factors that represses stem cell-promoting genes in actively proliferating cells, which is essential for the progression of the cell cycle and the orientation of the cell division plane. If unchecked, the expression of the GRFs in the stem cell niche suppresses formative cell divisions and distorts the organization of the quiescent center. We propose that the interactions identified here between miR396 and GRF and PLT transcription factors are necessary to establish the boundary between the stem cell niche and the transit-amplifying region.Fil: Rodriguez Virasoro, Ramiro Esteban. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Ercoli, María Florencia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Debernardi, Juan Manuel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Breakfield, Natalie W.. University of Duke; Estados UnidosFil: Mecchia, Martin Alejandro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Sabatini, Martín. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Cools, Toon. University of Ghent; BélgicaFil: De Veylder, Lieven. University of Ghent; BélgicaFil: Benfey, Philip N.. University of Duke; Estados UnidosFil: Palatnik, Javier Fernando. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentin

Función del microARN miR396 y los Factores de Transcripción GRFs en el desarrollo de Arabidopsis thaliana

Las plantas dependen de las células madres (SC, del inglés Stem Cells) para la generación de los diferentes tipos celulares que constituyen sus órganos. Las SC se localizan dentro de contextos celulares específicos, llamados nichos de células madre (SCN, del inglés Stem Cell Niche). Mientras que las SC se dividen lentamente para generar diferentes tipos celulares, su progenie generalmente experimenta divisiones celulares rápidas de amplificación que aseguran el correcto crecimiento del órgano. Posteriormente, estas células se diferencian y adquieren su tamaño y forma final. A lo largo del eje longitudinal de la raíz se pueden identificar claramente diferentes zonas de desarrollo abocadas a procesos de generación de nuevos tipos celulares, proliferación celular, elongación y maduración. La familia de factores de transcripción GROWTH-REGULATING FACTOR (GRF) es una pequeña familia de genes que se encuentra ampliamente conservada en plantas y se encuentra definida por la presencia de dos dominios protéicos llamados, WRC y QLQ. La expresión de los GRFs se encuentra reprimida a nivel post-transcripcional a través de la actividad del microARN miR396. Como resultado de esta regulación, estos factores de transcripción se expresan preferentemente en tejidos en proliferación celular donde promueven la división celular. La actividad de los GRFs también se encuentra regulada por la interacción con una pequeña familia de genes, conocida como GRF INTERACTING FACTORs (GIFs) que en Arabidopsis, está compuesta por tres miembros: ANGUSTIFOLIA3 (AN3), también conocido como GIF1, GIF2 y GIF3. En este trabajo de tesis describimos el papel de la red regulatoria conformada por el miR396, los GRFs y sus coactivadores GIFs en el contol del desarrollo de la raíz. Realizamos la caracterización fenotípica de plantas con niveles alterados de los diferentes componentes del sistema, el análisis de sus patrones de expresión y la evaluación de la interacción con otras vías regulatorias que controlan el desarrollo radicular. En primer lugar, mostramos que el miR396 regula la transición de las SC a las células en activa proliferación (TACs, del inglés "transit-amplifying cells"). Los GRFs se expresan en TACs, pero son excluídos de las SC gracias a la regulación por el miR396. A su vez, los factores de transcripción GRF reprimen genes normalmente expresados SC en las TACs, siendo esto esencial para la rápida progresión del ciclo celular, característica distintiva de esta zona que posibilita la amplificación del número de células del órgano en crecimiento. Además, encontramos que al suprimir la regulación de la expresión de los GRFs por el miR396 en el SCN ocurre una distorsión de la organización del centro quiescente (CQ). Estos resultados demuestran que las interacciones entre el miR396, los GRFs y los genes específicos de SC son necesarias para establecer el límite entre el SCN y la región de activa proliferación celular. A continuación, describimos la función de los GIFs, que si bien no pueden unirse al ADN per se, interactúan físicamente con los GRFs, funcionando como coactivadores transcripcionales de estos FTs. Además de la interacción con los GRFs, se ha visto que AN3 interactúa con componentes de complejos de remodelación de la cromatina tales como la ATPasa SWI/SNF BRAHMA. Encontramos que los GIFs actúan en las TACs junto con los GRFs para reprimir los genes normalmente expresados en las SC. Sin embargo, una inspección más detallada indicó que los GIFs también forman parte de una vía regulatoria independiente de los GRFs necesaria para mantener la integridad del CQ. Estos resultados indicaron que los GIFs regulan la expresión de los mismos genes en formas opuestas, dependiendo del contexto celular quizas mediante la formación de diferentes complejos. Finalmente, se generaron herramientas y se llevaron a cabo experimentos de transcriptómica para comenzar a dilucidar la red regulatoria controlada por los complejos GRF/GIF en el sistema radicular. Los datos obtenidos se utilizaron para identificar candidatos a ser regulados de forma directa por estos factores de transcripción. La información y las herramientas generadas son importantes para comprender los mecanismos moleculares por los cuales los GRFs y GIFs regulan diferentes procesos de desarrollo.Fil: Ercoli, María Florencia. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET); Argentina

Control of cell proliferation and elongation by miR396

The combinatory effects of cell proliferation and cell elongation determines the rate at which organs growth. In the root meristematic zone cells both divide and expand, while post-mitotic cells in the elongation zone only expands until they reach their final size. The transcription factors of the GROWTH-REGULATING FACTOR (GRF) class promote cell proliferation in various plant organs. Their expression is restricted to cells with a high proliferative capacity, yet strong downregulation of the GRF activity compromise the plant survival. Part of expression pattern of the GRFs is ensured by the post-transcriptional repression mediated by the conserved microRNA miR396. Here we show the quantitative effects in root growth caused by GRF depletion in a series of transgenic lines with different miR396 levels. We show that high miRNA levels affect cell elongation and proliferation in roots. Detailed analysis suggests that cell proliferation is restricted due to a reduction in cell cycle speed that might result from defects in the accumulation of mitotic cyclins. The results provide insights into the participation of the miRNA-GRF regulatory network in root development.Fil: Ercoli, María Florencia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Rojas, Arantxa Maria Larisa. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Debernardi, Juan Manuel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Palatnik, Javier Fernando. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Rodriguez Virasoro, Ramiro Esteban. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentin

A GRF–GIF chimeric protein improves the regeneration efficiency of transgenic plants

The potential of genome editing to improve the agronomic performance of crops is often limited by low plant regeneration efficiencies and few transformable genotypes. Here, we show that expression of a fusion protein combining wheat GROWTH-REGULATING FACTOR 4 (GRF4) and its cofactor GRF-INTERACTING FACTOR 1 (GIF1) substantially increases the efficiency and speed of regeneration in wheat, triticale and rice and increases the number of transformable wheat genotypes. GRF4–GIF1 transgenic plants were fertile and without obvious developmental defects. Moreover, GRF4–GIF1 induced efficient wheat regeneration in the absence of exogenous cytokinins, which facilitates selection of transgenic plants without selectable markers. We also combined GRF4–GIF1 with CRISPR–Cas9 genome editing and generated 30 edited wheat plants with disruptions in the gene Q (AP2L-A5). Finally, we show that a dicot GRF–GIF chimera improves regeneration efficiency in citrus, suggesting that this strategy can be applied to dicot crops.Fil: Debernardi, Juan Manuel. University of California; Estados Unidos. Howard Hughes Medical Institute; Estados Unidos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Tricoli, David M.. University of California; Estados UnidosFil: Ercoli, María Florencia. University of California; Estados Unidos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Hayta, Sadiye. Norwich Research Park; Reino UnidoFil: Ronald, Pamela. University of California; Estados UnidosFil: Palatnik, Javier Fernando. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentina. Universidad Nacional de Rosario. Centro de Estudios Interdisciplinarios; ArgentinaFil: Dubcovsky, Jorge. University of California; Estados Unidos. Howard Hughes Medical Institute; Estados Unido

Robust increase of leaf size by Arabidopsis thaliana GRF3-like transcription factors under different growth conditions

Abstract An increase in crop yield is essential to reassure food security to meet the accelerating global demand. Several genetic modifications can increase organ size, which in turn might boost crop yield. Still, only in a few cases their performance has been evaluated under stress conditions. MicroRNA miR396 repress the expression of GROWTH-REGULATING FACTOR (GRF) genes that codes for transcription factors that promote organ growth. Here, we show that both Arabidopsis thaliana At-GRF2 and At-GRF3 genes resistant to miR396 activity (rGRF2 and rGRF3) increased organ size, but only rGRF3 can produce this effect without causing morphological defects. Furthermore, introduction of At-rGRF3 in Brassica oleracea can increase organ size, and when At-rGRF3 homologs from soybean and rice are introduced in Arabidopsis, leaf size is also increased. This suggests that regulation of GRF3 activity by miR396 is important for organ growth in a broad range of species. Plants harboring rGRF3 have larger leaves also under drought stress, a condition that stimulates miR396 accumulation. These plants also showed an increase in the resistance to virulent bacteria, suggesting that the size increment promoted by rGRF3 occurs without an obvious cost on plant defenses. Our findings indicate that rGRF3 can increase plant organ size under both normal and stress conditions and is a valuable tool for biotechnological applications

GIF transcriptional coregulators control root meristem homeostasis

In the root meristem, the quiescent center (QC) is surrounded by stem cells, which in turn generate the different cell types of the root. QC cells rarely divide under normal conditions but can replenish damaged stem cells. In the proximal meristem, the daughters of stem cells, which are referred to as transit-amplifying cells, undergo additional rounds of cell division prior to differentiation. Here, we describe the functions of GRF-INTERACTING FACTORs (GIFs), including ANGUSTIFOLIA3 (AN3), in Arabidopsis thaliana roots. GIFs have been shown to interact with GRF transcription factors and SWI/SNF chromatin remodeling complexes. We found that combinations of GIF mutants cause the loss of QC identity. However, despite their QC impairment, GIF mutants have a significantly enlarged root meristem with additional lateral root cap layers. We show that the increased expression of PLETHORA1 (PLT1) is at least partially responsible for the large root meristems of an3 mutants. Furthermore, we found that GIFs are necessary for maintaining the precise expression patterns of key developmental regulators and that AN3 complexes bind directly to the promoter regions of PLT1 as well as SCARECROW. We propose that AN3/GIFs participate in different pathways that control QC organization and the size of the meristem.Fil: Ercoli, María Florencia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Ferela, Antonella. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Debernardi, Juan Manuel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Perrone, Ana Paula. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Rodriguez Virasoro, Ramiro Esteban. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Palatnik, Javier Fernando. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentin