Systematic Analysis of disease pathways in Congenital, Infantile and Juvenile Neuronal Ceroid Lipofuscinoses

Neuronal ceroid lipofuscinoses (NCL) are common inherited childhood brain disorders. Since 1995, 13 known NCL causative genes (CLN1-8, CLN10-14) have been identified. Despite progress in the NCL field, the primary function and physiological roles of most NCL proteins remain unresolved. In this thesis, we utilized various techniques, such as: functional proteomics, bioinformatics, and mouse disease models, in an effort to clarify disease pathways associated with congenital (CLN10), infantile, late-Infantile (CLN1, CLN5) and juvenile NCL (CLN3) in the human brain. Firstly, we examined the synaptic proteome in a cathepsin D (Ctsd / Cln10) knockout mouse model of congenital NCL, where the synaptic pathology resembles that of patients. Quantitative mass spectrometry analysis of mouse brain synaptosomes, showed that 43 proteins were differentially expressed in the Ctsd knockout mice brains. We used protein-protein interaction databases to generate a network of differentially expressed proteins and checked individual proteins for involvement in processes, pathways or disease phenotypes. This work highlighted defects in migratory functions of cathepsin D deficient cells that were attributed to downregulation of cytoskeletal proteins. We also aimed to map the CLN3-CLN5 protein interactome in the brain by identifying their associated proteins. Protein complexes from CLN3 or CLN5 expressing SH-SY5Y stable cells were analysed by mass spectrometry and processed by bioinformatics, to unravel molecular mechanisms underlying CLN3 and CLN5 diseases. Novel CLN3 and CLN5 interacting partners (42 and 31, respectively) were identified in this study. The extent of crosstalk amongst CLN3 and CLN5, suggests that the mechanisms leading to the functional deficits are shared between them. CLN3 was implicated in new roles of G-protein signalling and protein folding / sorting in the ER. Finally, we analysed protein complexes from human PPT1 (CLN1) expressing SH-SY5Y stable cells as described above. The goal of this study was to identify in vivo PPT1 substrates that could provide insight on the onset and progression of CLN1 disease. Our findings suggest putative new roles of PPT1 in neuronal migration and dopamine receptor mediated signalling pathway.Neuronaaliset seroidilipofuskinoosit (NCL) ovat yleisimpiä lapsuusiässä ilmeneviä periytyviä aivosairauksia. Ensimmäinen NCL:ia aiheuttava geenivirhe julkaistiin jo vuonna 1995 ja sittemmin NCL:ia aiheuttavia alttiusgeenejä on löydetty jo yhteensä 13 (CLN1-8, CLN10-14). Tästä huolimatta useimpien NCL-tauteihin liittyvien geenien ja niiden koodaamien proteiinien ensisijaiset tehtävät soluissa ovat jääneet epäselviksi. Tässä väitöskirjatyössä on tutkittu NCL-tautien kongenitaaliseen (CLN10) sekä lapsuusiän (CLN1), myöhäisen lapsuusiän (CLN5) ja nuoruusiän ilmenemismuotoon johtavia muutoksia solujen toiminnassa hyödyntämällä funktionaalisen proteomiikan ja bioinformatiikan sovelluksia sekä kyseisiin tauteihin kehitettyjä hiirimalleja. Ensimmäisessä työssä hyödynsimme NCL:in kongenitaaliselle ilmenemismuodolle (CLN10) kehitettyä katepsiini D (Ctsd / Cln10) poistogeenistä hiirimallia, jonka on aikaisemmissa tutkimuksissa todettu ilmentävän hyvin taudin patologisia muutoksia synaptisilla alueilla. Tässä työssä osoitettiin kvantitatiivisen massaspektrometrian avulla, että Ctsd poistogeenisen hiiren aivojen synaptosomaalisella alueella 43 proteiinin ilmenemistasot ovat muuttuneet. Proteiinivuorovaikutustietokantoja hyödyntämällä määritettiin kyseisten proteiinien keskinäinen verkostoituminen sekä tarkistettiin kunkin yksittäisen proteiinin taustat solunsisäisissä prosesseissa, reaktioteissä ja tautifenotyypeissä. Tämän osatyössä ilmeni, että soluilla, joilla katepsiini D proteiinin toiminta on estynyt, on ongelmia solujen liikkumiseen liittyvissä toiminnoissa. Tämän pääteltiin johtuvan solutukirankaproteiinien alentuneesta ilmenemistasosta. Tämän väitöskirjatyön tavoitteena oli myös kartoittaa CLN3- ja CLN5-proteiinien vuorovaikutusverkostoa aivokudoksessa CLN3- ja CLN5-tautiin johtavien solunsisäisten tapahtumien selvittämiseksi. CLN3- ja CLN5-proteiinia ilmentävien SH-SY5Y-solujen proteiinikompleksit eristettiin ja tunnistettiin massaspektrometrialla, minkä jälkeen tuloksia analysoitiin edelleen bioinformatiikan avulla. Tässä työssä tunnistettiin lukuisia CLN3- ja CLN5-proteiinien vuorovaikutuskumppaneita (42 CLN3-proteiinille ja 31 CLN5-proteiinille). CLN3- ja CLN5-vuorovaikutusverkostojen havaittiin sisältävän keskenään samoja tekijöitä, mikä viittaa siihen, että kyseisiin tauteihin johtavat solunsisäiset molekyylitason muutokset ovat osittain samoja. Tässä työssä selvitettyjen proteiinivuorovaikusverkostojen perusteella CLN3-proteiinilla on aikaisemmin havaitsematon rooli G-proteiinivälitteisessä solunsisäisessä signaloinnissa sekä proteiinien laskostumisessa/solukalvoliikenteen säätelyssä endoplasmaattisessa retikkelissä (ER). Tämän väitöskirjan viimeisessä osatyössä analysoitiin puolestaan PPT1 (CLN1) -proteiinin vuorovaikutusverkostoja SH-SY5Y-soluissa. Tämän osatyön tavoitteena oli etsiä in vivo substraatteja entsymaattisesti aktiiviselle PPT1-proteiinille, mikä saattaa auttaa CLN1-taudin vaihtelevaan ilmiasuun vaikuttavien tekijöiden selvittämisessä. Tämän osatyön tulosten perusteella PPT1-proteiinilla on ennen, proteiinitasolla havaitsematon rooli hermosolujen liikkumisessa ja dopamiinireseptorivälitteisessä signaalinvälityksessä

Recent advances in applying mass spectrometry and systems biology to determine brain dynamics

Neurological disorders encompass various pathologies which disrupt normal brain physiology and function. Poor understanding of their underlying molecular mechanisms and their societal burden argues for the necessity of novel prevention strategies, early diagnostic techniques and alternative treatment options to reduce the scale of their expected increase. Areas covered: This review scrutinizes mass spectrometry based approaches used to investigate brain dynamics in various conditions, including neurodegenerative and neuropsychiatric disorders. Different proteomics workflows for isolation/enrichment of specific cell populations or brain regions, sample processing; mass spectrometry technologies, for differential proteome quantitation, analysis of post-translational modifications and imaging approaches in the brain are critically deliberated. Future directions, including analysis of cellular sub-compartments, targeted MS platforms (selected/parallel reaction monitoring) and use of mass cytometry are also discussed. Expert commentary: Here, we summarize and evaluate current mass spectrometry based approaches for determining brain dynamics in health and diseases states, with a focus on neurological disorders. Furthermore, we provide insight on current trends and new MS technologies with potential to improve this analysis.Peer reviewe

Dynamic Interaction of USP14 with the Chaperone HSC70 Mediates Crosstalk between the Proteasome, ER Signaling, and Autophagy

USP14 is a deubiquitinating enzyme associated with the proteasome that is important for protein degradation. Here we show that upon proteasomal inhibition or expression of the mutant W58A38 USP14, association of USP14 with the 19S regulatory particle is disrupted. MS-based interactomics revealed an interaction of USP14 with the chaperone, HSC70 in neuroblastoma cells. Proteasome inhibition enhanced binding of USP14 to HSC70, but also to XBP1u and IRE1α proteins, demonstrating a role in the unfolded protein response. Striatal neurons expressing mutant huntingtin exhibited reduced USP14 and HSC70 levels, whilst inhibition of HSC70 downregulated USP14. Furthermore, proteasome inhibition or the use of mutant W58A-USP14 facilitated the interaction of USP14 with the autophagy protein, GABARAP. Functionally, overexpression of W58A-USP14 increased GABARAP positive autophagosomes in striatal neurons and this was abrogated using the HSC70 inhibitor, VER-155008. Modulation of the USP14-HSC70 axis by various drugs may represent a potential therapeutic target in HD to beneficially influence multiple proteostasis pathwaysPeer reviewe

Proteomic Profiling in the Brain of CLN1 Disease Model Reveals Affected Functional Modules

Peer reviewe

Quantitative analysis of PPT1 interactome in human neuroblastoma cells

Peer reviewe

Drafting the CLN3 Protein Interactome in SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cells: A Label-free Quantitative Proteomics Approach

Peer reviewe