Proceso de agotamiento de las células T durante la infección crónica causada por tripanosomátidos intracelulares

La enfermedad de Chagas y la leishmaniasis, causadas por parásitos protozoarios intracelulares del orden Trypanosomatida, son consideradas dos de las enfermedades tropicales desatendidas más importantes. Estas infecciones conllevan un alto desgaste social, provocando el deterioro de la salud de un gran número de pacientes e incluso su muerte. Los linfocitos T son células fundamentales del sistema adaptativo y son los principales elementos inmunitarios para el control de estas infecciones intracelulares. La presente revisión explora los estudios y resultados obtenidos hasta la fecha del proceso de agotamiento celular durante las infecciones causadas por los parásitos Leishmania spp. y Trypanosoma cruzi. Así, se recoge que la persistente estimulación celular en respuesta a antígenos de estos patógenos conduce a un proceso de pérdida de la capacidad funcional antígeno-específica en las poblaciones de células T CD4+ y CD8+. Numerosos estudios muestran la existencia de una correlación directa entre el nivel de la co-expresión de receptores inhibitorios y la gravedad de estas patologías. Paralelamente, se detecta la pérdida de la capacidad funcional específica de antígeno de estas células T, lo que reduce su potencial linfoproliferativo y su capacidad de producir moléculas protectoras contra estas infecciones. Además, durante el curso de estas infecciones se observa un incremento de la frecuencia de células T de memoria efectora con un grado de diferenciación tardía o terminal. Este balanceo fenotípico, a su vez, afecta a la capacidad funcional de las células T aumentando el número de células con características senescentes y apoptóticas. Así, los estudios realizados hasta la fecha demuestran con certeza la existencia de un proceso de agotamiento que afecta a poblaciones clave para el control parasitario. Sin embargo, actualmente se desconoce con precisión el papel que este proceso de agotamiento juega en el agravamiento de estas patologías. Los medicamentos actuales usados para tratar estas enfermedades protozoarias revierten parcialmente este proceso de agotamiento. Así, tras el tratamiento, numerosos pacientes muestra una reducción en la expresión de receptores inhibitorios y co-expresión de los mismos. También se ha observado una mejoría en la capacidad funcional de las distintas poblaciones de células T, que podría estar relacionada con la reversión del proceso disfuncional. Sin embargo, los estudios realizados hasta la fecha en la evaluación de terapias de bloqueo de los receptores inhibitorios no han conducido a resultados prometedores. Algunos autores proponen evaluar terapias de bloqueo simultáneo de varias vías de señalización, con el fin de ampliar el conocimiento sobre esta herramienta como posible inmunoterapia de control de la infección por los mencionados parásitos. Además, se considera necesario continuar investigando sobre cómo se desencadena exactamente este proceso de agotamiento celular y en qué medida influye en la aparición de la sintomatología de los pacientes y ausencia de control de la infección.Two of the most important neglected tropical diseases, Chagas disease and leishmaniasis, are caused by protozoan intracellular parasites of the Trypanosomatida order. These infections provoke a high social burden and lead to the death of a large number of patients. The host triggers several immune mechanisms, but in the absence of adequate treatment, the infection becomes chronic and in many cases causes the appearance of serious alterations. T lymphocytes are fundamental cells of the adaptive system and are the main immune elements that orchestrate the cell-to-cell response in the context of intracellular infections. Furthermore, it has been described that continuous and persistent stimulation in response to pathogenic antigens causes loss of antigen-specific functional capacities in the T cell subsets. This process is known as exhaustion. This review explores the results to date of the exhaustion process during chronic infections caused by the trypanosomatid parasites Leishmania spp. and Trypanosoma cruzi. A large amount of evidence shows upregulation of the markers of the exhaustion process, namely, the inhibitory receptors, during these chronic infections. This increased expression is observed in both the CD4+ and CD8+ T cell populations. In parallel, with this increased expression of inhibitory receptors, the loss of antigen-specific functional capacity of these T cells is detected, reducing the lymphoproliferative potential and the ability to produce protective molecules against these parasitic infections, such as Th1- like cytokines, among others. Additionally, a positive correlation between the high coexpression of these inhibitory molecules and the severity of the pathology is demonstrated. Furthermore, T cell populations experience a phenotypic fluctuation in the course of these infections toward the predominance of effector memory subsets with a late or terminal differentiation state. This balancing in turn affects the functional capacity of the T cells and enriches the number of cells with senescent and apoptotic characteristics. Thus, it has been demonstrated the existence of an exhaustion process that affects key populations for the parasite control. However, the role of this process in the progression of the severity of these pathologies is still unknown. The current drugs used to treat these neglected diseases seem to partially reverse this exhaustion process, denoting a reduction in the high inhibitory receptor expression observed prior to chemotherapies. An improvement in the functional capacity of these T cell populations is also observed, which could be related to the reversion of the dysfunctional process. However, the efforts made to date to evaluate blocking therapies do not lead us to a promising conclusion. It will probably be necessary to test the simultaneous blockade of several pathways and to continue advancing the knowledge to verify their possible use as immunotherapy. It is therefore necessary to continue investigating how this process is triggered and to what extent it influences the appearance of the symptomatology of patients.This study was supported by the grants SAF2016-81003-R and SAF2016-80998-R from the Programa Estatal I+D+i (MINECO), the Network of Tropical Diseases Research RICET (RD16/0027/0005) and FEDER. Elena Pérez Antón was supported by PhD studentships from the FUNCCET (Fundación Canaria para el Control de las Enfermedades Tropicales)

Expresión de receptores inhibidores y capacidad funcional de las células T como factores de riesgo de transmisión congénita de T. cruzi.

Introducción / Objetivos: En el contexto de la enfermedad de Chagas, la transmisión congénita de T. cruzi es una importante vía de trasmisión de la enfermedad, y constituye un problema de salud pública en zonas endémicas y no endémicas. Durante el desarrollo del embarazo, debe establecerse en gestantes infectadas un equilibrio en el que se mantenga la competencia inmunológica para la defensa de la madre y, al mismo tiempo, inducir los mecanismos de tolerancia necesarios para prevenir una respuesta frente a aloantígenos fetales. El objetivo de este estudio fue caracterizar a nivel inmunológico las modificaciones inducidas por el proceso de gestación en su coexistencia con la infección con T. cruzi y su relación con la transmisión vertical. Métodos: Se evaluó la expresión de receptores inhibitorios y multifuncionalidad de las células T CD4+ y CD8+ en el contexto de la gestación, en un modelo murino de infección crónica con T. cruzi, empleando citometría de flujo multiparamétrica.. Resultados: Los resultados obtenidos muestran que la gestación induce en ratonas infectadas con T. cruzi la disminución del porcentaje de células T que expresan receptores inhibitorios, el aumento de la frecuencia de linfocitos T CD4+ y CD8+ muItifuncionales y el aumento de la carga parasitaria. Así, el 88% de las ratonas infectadas con PCR- antes de la gestación, presentan cantidades detectables del parásito durante la gestación. El 37% de las ratonas gestantes PCR+ son capaces de transmitir el parásito. Interesantemente, aquellas ratonas que transmiten el parásito a su progenie presentan una mayor frecuencia de linfocitos T CD4+ y CD8+ que co-expresan receptores inhibitorios, así como una menor frecuencia de células T multifuncionales. Conclusión: Las ratonas que transmiten verticalmente el parásito no revierten el proceso de homeostasis inducido por el embarazo afectándose así la calidad de respuesta de las células T del hospedador, lo cual parece ser un factor de riesgo en la transmisión congénita de T. cruzi. Palabras Claves: Transmisión congénita de Trypanosoma cruzi, células T, receptores inhibitorios. Keywords: Trypanosoma cruzi congenital transmission, T cells, inhibitory receptors

Perfil de respuesta inmunitaria de células T asociada a la protección frente a la re-infección por T. cruzi

Introducción: La enfermedad de Chagas representa un problema de salud pública global, que en su fase crónica implica un alto coste para el sistema de salud y a nivel laboral. No existe un tratamiento antiparasitario efectivo que produzca el aclaramiento del parásito y es escaso el conocimiento sobre los mecanismos que operan en protección. Así, el estudio de la dinámica de las poblaciones de linfocitos T asociados a protección permitirá nuevas aproximaciones terapéuticas. Objetivos: Analizar los procesos de primo- y re-infección con distintas cepas de T. cruzi en un modelo murino de infección experimental al objeto de determinar los patrones inmunológicos a activar para la obtención de una eficaz inmunoterapia frente al Chagas crónico. Materiales y Métodos: Infección experimental con T. cruzi en ratones Balb/c por vía intraperitoneal (5x102 tripomastigotes (primo-infección); 5x105 y 1x105 (re-infección) cepas Y(DTU-II) y SOL(DTUV), respectivamente. Detección anticuerpos antígeno-específicos (IgG e IgG1/IgG2a) mediante ELISA. El análisis del fenotipo y funcionalidad de las células T antígeno-específicas se realizó empleando citometría de flujo multiparamétrica. Resultados: Ratones en fase crónica de la infección por T. cruzi controlan la parasitemia que induce la re-infección con dicho parásito. Este comportamiento está asociado a un claro perfil inmunológico caracterizado por una mayor proporción de células T CD4+ y CD8+ de memoria central (TCM) y efectora (TEM). Asimismo, los ratones re-infectados presentan mayor porcentaje de células T CD8+ multifuncionales que producen IFN-¿, Granzima B y TNF¿ y menor frecuencia de aquellas que expresan los receptores inhibitorios PD-1 y CD160. Las células T CD4+ de los ratones re-infectados muestran una mayor proporción de células que expresan PD-1 y CTLA-4. Conclusiones: Los ratones en fase crónica de infección por T.cruzi controla la re-infección por dicho parásito, asociada a la presencia de una alta frecuencia de células T CD8+ antígeno-específicas de memoria con capacidad multifuncional. Financiación: Programa Estatal I+D+I (MINECO) Ref. SAF2016-81003R y SAF2016- SAF2016-80996-R; Red de Investigación en Enfermedades Tropicales (RICET) Ref. RD16/0027/0005, (ISCIII), España

A proportion of CD4+ T cells from patients with chronic Chagas disease undergo a dysfunctional process, which is partially reversed by benznidazole treatment

Background: Signs of senescence and the late stages of differentiation associated with the more severe forms of Chagas disease have been described in the Trypanosoma cruzi antigen-specific CD4+ T-cell population. However, the mechanisms involved in these functions are not fully known. To date, little is known about the possible impact of benznidazole treatment on the T. cruzi-specific functional response of CD4+ T cells. Methodology/principal findings: The functional capacity of CD4+ T cells was analyzed by cytometric assays in chronic Chagas disease patients, with indeterminate form (IND) and cardiac alterations (CCC) (25 and 15, respectively) before and after benznidazole treatment. An increase in the multifunctional capacity (expression of IFN-γ, IL-2, TNF-α, perforin and/or granzyme B) of the antigen-specific CD4+ T cells was observed in indeterminate versus cardiac patients, which was associated with the reduced coexpression of inhibitory receptors (2B4, CD160, CTLA-4, PD-1 and/or TIM-3). The functional profile of these cells shows statistically significant differences between IND and CCC (p<0.001), with a higher proportion of CD4+ T cells coexpressing 2 and 3 molecules in IND (54.4% versus 23.1% and 4.1% versus 2.4%, respectively). A significant decrease in the frequencies of CD4+ T cells that coexpress 2, 3 and 4 inhibitory receptors was observed in IND after 24-48 months of treatment (p<0.05, p<0.01 and p<0.05, respectively), which was associated with an increase in antigen-specific multifunctional activity. The IND group showed, at 9-12 months after treatment, an increase in the CD4+ T cell subset coproducing three molecules, which were mainly granzyme B+, perforin+ and IFN-γ+ (1.4% versus 4.5%). Conclusions/significance: A CD4+ T cell dysfunctional process was detected in chronic Chagas disease patients, being more exacerbated in those patients with cardiac symptoms. After short-term benznidazole treatment (9-12 months), indeterminate patients showed a significant increase in the frequency of multifunctional antigen-specific CD4+ T cells

Perfil fenotípico de las células CD8+ epítope-específicas como biomarcador de respuesta al tratamiento con benznidazol

Uno de los mayores desafíos en la investigación de la enfermedad de Chagas es la búsqueda de herramientas que permitan evaluar la eficacia del tratamiento. Estudios previos del laboratorio mostraron que los antígenos KMP11, PFR2, HSP70 y 3973d de T. cruzi son reconocidos por sueros de pacientes crónicos con alta especificidad. El uso de estos antígenos como set de biomarcadores, ¿Chagnostik¿, permitió establecer un criterio de eficacia terapéutica, basado en la disminución continua y sustancial de la reactividad de los sueros frente a dichas moléculas. Estos biomarcadores serológicos junto a la evaluación de parámetros inmunológicos celulares podría ser una potente herramienta de seguimiento terapéutico. .Programa Estatal I+D+I (SAF2016-81003-R y SAF2016-80996-R); Red de Investigación en Enfermedades Tropicales (RD16/0027/0005 y RD16/0027/0016) y FEDER

A Parasite Biomarker Set for Evaluating Benznidazole Treatment Efficacy in Patients with Chronic Asymptomatic Trypanosoma cruzi Infection

One of the current greatest challenges of Chagas disease is the establishment of biomarkers to assess the efficacy of drugs in a short period of time. In this context, the reactivity of sera from 66 adults with chronic indeterminate Chagas disease (IND) for a set of four Trypanosoma cruzi antigens (KMP11, PFR2, HSP70, and 3973d) was analyzed before and after benznidazole treatment. The results showed that the reactivity against these antigens decreased at 9, 24, and 48 months after treatment. Moreover, the 42.4% and 68.75% of IND patients met the established standard criteria of therapeutic efficacy (STEC) at 24 and 48 months posttreatment, respectively. Meeting the STEC implied that there was a continuous decrease in the reactivity of the patient sera against the four antigens after treatment and that there was a substantial decrease in the reactivity for at least two of the antigens. This important decrease in reactivity may be associated with a drastic reduction in the parasite load, but it is not necessarily associated with a parasitological cure. After treatment, a positive PCR result was only obtained in patients who did not meet the STEC. The percentage of granzyme B+/perforin+ CD8+ T cells was significantly higher in patients who met the STEC than in those who did not meet the STEC (35.2% versus 2.2%; P < 0.05). Furthermore, the patients who met the STEC exhibited an increased quality of the multifunctional response of the antigen-specific CD8+ T cells compared with that in the patients who did not meet the STE

Performance of Leishmania PFR1 recombinant antigen in serological diagnosis of asymptomatic canine leishmaniosis by ELISA

Abstract Background Leishmania infantum is a protozoan parasite transmitted by phlebotomine sand flies that causes life-threatening disease in humans and dogs. The dog is the primary reservoir of the parasite and early diagnosis of canine leishmaniosis is crucial at the clinical and epidemiological level. The currently available serological tests for CanL diagnostic show limitations therefore the aim of the present study was to investigate the diagnostic performance of an indirect antibody ELISA based on the Leishmania infantum recombinant antigen PFR1 in asymptomatically infected dogs. One hundred fifty-six dogs including Leishmania-free experimental Beagles and pet dogs from England, Scotland and Leishmania-endemic Murcia in Spain, were tested with the assay. The later were also tested with two commercial L. infantum crude antigen ELISAs (INgezim and Civtest, respectively) and a real-time kinetoplast PCR test. Results Anti-PFR1 antibodies were detected in the four groups of dogs, and the mean log-transformed optical density (OD) values were lowest in Beagles and in dogs from England and highest among dogs from Murcia (p < 0.05). Using the highest OD in beagles as the PFR1 ELISA cut-off point, the estimated seroprevalence was 27% (14-40%) in dogs from Murcia, 4% (0-9%) in dogs from Scotland and 3% (0-8%) in dogs from England (p < 0.05). Seroprevalence in dogs from Murcia according to the INgezim and Civtest ELISAs were 24% (12-37%) and 31% (18-45%), respectively, whilst the prevalence of infection based on PCR in these dogs was 73% (60-86). The percentages of PFR1-positive dogs that tested negative on the INgezim and Civtest ELISAs were 30% and 35%, respectively, and all of them tested positive on the PCR test. Relative to the PCR, the specificity, sensitivity and area under the ROC curve of the PFR1 ELISA were 100%, 36% and 0.74 (0.63-0.86), respectively. Conclusions The ability shown by the PFR1 ELISA to detect infected dogs that go undetected by the crude antigen ELISAs is clinically and epidemiologically useful and PFR1 could be considered a candidate for a multi-antigen-based immunoassay for early detection of L. infantum infected dogs

Dinámica de la respuesta de linfocitos TCD8+ específicos de antígenos parasitarios en pacientes chagásicos bajo tratamiento

El objetivo de este trabajo es la identificación y caracterización de nuevos epítopes T CD8+ contenidos en antígenos específicos de T. cruzi. Así una vez identificados los epítopes se ha llevado a cabo el estudio funcional y fenotípico de las células T CD8+ presentes en pacientes con enfermedad de Chagas crónica en fases indeterminada y cardiaca que reconocen a dichos epítopes, así como su dinámica tras el tratamiento con benznidazol. Las conclusiones permitirán establecer útiles marcadores de grado de patología y eficacia terapéutica. Asimismo, se plantea la identificación de moléculas marcadoras de mecanismos implicados en la capacidad del sistema inmune para modificar su potencial respuesta frente a la infección por T. cruzi.Tesis Univ. Granada. Programa de doctorado en: Inmunologí