Kapazitive pH-Sensoren auf der Basis von makroporösem Silizium mit Doppelisolatorschicht aus thermisch oxidiertem SiO2 und LPCVD-Si3N4

Halbleitersensoren für den Ionennachweis in wässrigen Lösungen lassen sich einfach und kostengünstig als kapazitive Feldeffektstrukturen in Form von sogenannten EIS- (Elektrolyt-Isolator-Silizium) Sensoren realisieren. Allerdings sind solche Sensoren begrenzt miniaturisierbar, da ihre geometrische Fläche direkt proportional in das Meßsignal, die Kapazitätsänderung, eingeht. Um diesen Nachteil zu umgehen, haben wir auf dem ersten BioSensorSymposium in München (1999) einen neuartigen Lösungsansatz vorgeschlagen, bei dem makroporöses Silizium als Basismaterial für verschiedene sensoraktive Substanzen, wie z.B. pH-sensitive Schichten und Enzyme eingesetzt werden kann. Bei der Verwendung von makroporösem Silizium als Transducermaterial hat die durch den Herstellungsprozeß bedingte Vergrößerung der sensoraktiven Oberfläche nämlich eine Zunahme der Meßkapazität zur Folge. Aufgrund der Ätzanordnung zur Herstellung von porösem Silizium war es bisher allerdings nur möglich, Niedertemperaturprozesse, wie das PECVD (Plasma-Enhanced-Chemical-Vapour-Deposition)-Verfahren, zur Abscheidung von SiO2 als Isolatorschicht und Si3N4 als pH-sensitiver Schicht zu verwenden. Solche Sensoren besitzen allerdings keine hohe Langzeitstabilität im Meßbetrieb (ca. 2 Monate), da die dielektrischen Schichten unzureichende Korrosionseigenschaften aufweisen. Zur Verbesserung der Langzeitstabilität von Sensoren aus porösem Silizium bietet sich die Verwendung von thermisch oxidiertem Silizium als Isolatorschicht und das Abscheiden von Siliziumnitrid als pH-sensitive Schicht mittels LPCVD (Low-Pressure- Chemical-Vapour-Deposition)-Verfahren an. Vorangegangene Arbeiten aus unserer Arbeitsgruppe hatten gezeigt, daß planare Sensoren mit LPCVD-Nitrid als Transducermaterial über einen Zeitraum von sieben Monaten konstant hohe Sensitivitäten nahe dem Nernst-Idealwert aufweisen

Untersuchungen zur Ankopplung von gentechnisch modifizierten HEK293-Zellen an siliziumbasierte Transducer-Materialien

Um die elektrische Signalübertragung zwischen biologischen Systemen und Halbleitermaterialien zu untersuchen, beschäftigt sich die aktuelle Forschung in jüngster Zeit mit der direkten Ankopplung von Nervenzellen an Siliziumchips und Metallelektroden. Die Generierung elektrischer Impulse hängt dabei von Ionenkanälen in der Plasmamembran dieser Zellen ab. Mittels molekularbiologischer Verfahren fertigen wir gentechnisch modifizierte HEK 293 Zellen an. Es werden Zellinien hergestellt, die sowohl Dopamin-Rezeptoren, als auch zyklisch nukleotid-gesteuerte Ionenkanäle (CNG Kanäle) konstitutiv exprimieren. Die Dopamin-Rezeptoren erkennen spezifische Botenstoffe (Dopamin) in einer Lösung und erzeugen ein intrazelluläres biochemisches Signal. Es kommt zum Anstieg der intrazellulären Konzentration des Botenstoffes cAMP. Die CNG-Kanäle werden durch dieses zyklische Nukleotid direkt geöffnet. Mono- und divalente Kationen fließen durch den geöffneten Kanal in die Zelle. Die Zelle wird dabei elektrisch erregt und das Membranpotential ändert sich. Die Änderung des Membranpotentials soll als Meßgröße mit Hilfe eines Halbleiterchips gemessen werden. Gegenwärtig wird die bioelektronische Schnittstelle zwischen Zelle und Halbleiterstruktur im einzelnen charakterisiert. Dabei werden unterschiedliche Übertragungsmechanismen - an Hand von Mikroelektroden und kapazitiven Feldeffektstrukturen - auf der Basis von planarem, strukturiertem und porösem Silizium untersucht. Um die Haftung der Zellen auf den Siliziumchips zu verbessern, wurden die Chipoberflächen mittels verschiedener Methoden aktiviert (Sauerstoffplasmabehandlung, Poly-L-lysin, Laminin). Die Ergebnisse dieser Untersuchungen, sowie einleitende Ergebnisse, die die Signalübertragung an der Zell/Silizium-Schnittstelle betreffen, werden präsentiert und diskutiert

Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells

Imaging the actin cytoskeleton in cells uses a wide range of approaches. Typically, a fluorescent derivative of the small cyclic peptide phalloidin is used to image F-actin in fixed cells. Lifeact and F-tractin are popular for imaging the cytoskeleton in live cells. Here we characterised novel affinity reagents called Affimers that specifically bind to F-actin in vitro to determine if they are suitable alternatives as eGFP-fusion proteins, to label actin in live cells, or for labeling F-actin in fixed cells. In vitro experiments showed that 3 out of the 4 Affimers (Affimers 6, 14 and 24) tested bind tightly to purified F-actin, and appear to have overlapping binding sites. As eGFP-fusion proteins, the same 3 Affimers label F-actin in live cells. FRAP experiments suggest that eGFP-Affimer 6 behaves most similarly to F-tractin and Lifeact. However, it does not colocalize with mCherry-actin in dynamic ruffles, and may preferentially bind stable actin filaments. All 4 Affimers label F-actin in methanol fixed cells, while only Affimer 14 labels F-actin after paraformaldehyde fixation. eGFP-Affimer 6 has potential for use in selectively imaging the stable actin cytoskeleton in live cells, while all 4 Affimers are strong alternatives to phalloidin for labelling F-actin in fixed cells

Cryo-EM and molecular docking shows myosin-S1 loop 4 contacts actin and tropomyosin on thin filaments

The motor protein, myosin, drives muscle and non-muscle motility by binding to and moving along actin of thin filaments. Myosin-binding to actin also modulates interactions of the regulatory protein, tropomyosin, on thin filaments, and conversely tropomyosin affects myosin-binding to actin. Insight into this reciprocity will facilitate a molecular level elucidation of tropomyosin regulation of myosin interaction with actin in muscle contraction, and in turn, promote better understanding non-muscle cell motility. Indeed, experimental approaches, such as fiber diffraction, cryo-electron microscopy and 3D reconstruction, have long been used to define regulatory interaction of tropomyosin and myosin on actin at a structural level. However, their limited resolution has not proven sufficient to determine tropomyosin and myosin contacts at an atomic-level and thus to fully substantiate possible functional contributions. To overcome this deficiency, we have followed a hybrid approach by performing new cryo-EM reconstruction of myosin-S1‒decorated F-actin-tropomyosin together with atomic-scale protein-protein docking of tropomyosin to the EM models. Here, cryo-EM data were derived from filaments reconstituted with α1-actin, cardiac αα-tropomyosin, and masseter muscle β-myosin complexes; masseter myosin, which shares sequence identity with β-cardiac myosin-heavy chain, was used because of its stability in vitro. The data were used to build an atomic model of the tropomyosin cable that fits onto the actin filament between the tip of the myosin head and a cleft on the innermost edge of actin subunits. The docking and atomic scale fitting showed multiple discrete interactions of myosin loop 4 and acidic residues on successive 39 to 42 residue-long tropomyosin pseudo-repeats. The contacts between S1 and tropomyosin on actin appear to compete with and displace ones normally found between actin and tropomyosin on myosin-free thin filaments in relaxed muscle, thus restructuring the filament during myosin-induced activation