Les tanycytes véhiculent la leptine dans le cerveau métabolique : mécanismes moléculaires et rôle dans la physiopathologie de la résistance hormonale et l'obésité/diabète

The control of energy balance that allows for the maintenance of body mass requires a continued dialogue between the periphery and the hypothalamus in the brain. The access of peripheral hormones to that structure is essential to the proper functioning of neural circuits that regulate energy balance. However, little is known about the transport mechanisms of circulating metabolic signals into the hypothalamus. The median eminence, a hypothalamic structure forming the floor of the 3rd ventricle, contains specialized ependymoglial cells called tanycytes. Tanycytes have been shown to shuttle metabolic signals such as leptin into the cerebrospinal fluid, via transcytosis. Identifying the molecular mechanisms involved in this transport is essential to our understanding of the phenomenon of central hormone resistance found in obese and type 2 diabetes patients. During my thesis, after an infusion of a recombinant fusion protein (TAT-Cre) into the 3rd ventricle of leptin receptor gene-floxed mouse model (LepR(loxP/loxP)), we investigated the role of the LepR in tanycytes on the central control of energy homeostasis in mice. Our results show that selectively impairing LepR expression in tanycytes increases body weight, adiposity, cholesterolemia, triglyceridemia and decreases noradrenaline serum concentration. It’s associated with an increase of food intake, peripheral but not central leptin anorectic effect and glucose intolerance. Pancreas and adipose tissue activity of our model is also affected. In parallel, we studied the mechanisms underlying the anorexigenic action of endozepines. Our results show that endozepines induce ERK activation necessary for leptin transport into the brain in primary culture of tanycytes and require tanycytic LepR expression to promote STAT3 phosphorylation in the hypothalamus. Finally, we also investigated the effect of the expression of the type B botulinum neurotoxin BoNTB, in tanycytes on the central control of energy homeostasis in mice. BoNTB inactivates synaptobrevins 1-3 by proteolytic cleavage and thus alters synaptobrevin-mediated exocytosis. Our results show that selectively impairing synaptobrevin function in tanycytes affects as in the previous model the basal food intake, leptin sensitivity and glucose tolerance in mice. However, we noticed some differences in pancreas activity compared to the model in which we selectively impaired LepR expression in tanycytes. Altogether, these data demonstrate for the first time the key role of tanycytes in the central control of energy regulation in-vivo and the involvement of LepR expression in tanycytes for circulating leptin and endozepines action in the metabolic brain.Le contrôle de la balance énergétique, permettant le maintien de la masse corporelle nécessite un dialogue continu entre la périphérie et l’hypothalamus dans le cerveau. L’accès des hormones périphériques à cette structure cérébrale est essentiel au bon fonctionnement des circuits neuronaux qui régule l’homéostasie énergétique. Toutefois, peu d’éléments concernant sur les mécanismes de transport de ces signaux métaboliques à l’hypothalamus sont actuellement connus. L’éminence médiane, une structure hypothalamique formant le plancher du 3e ventricule, contient des cellules épendymogliales hautement spécialisées appelées tanycytes. Il a été démontré que les tanycytes transportent les signaux métaboliques tels que la leptine jusqu’au liquide céphalorachidien par un mécanisme de transcytose. Identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans ce transport est essentiel à notre compréhension au phénomène de résistance centrale aux hormones, observé chez les patients obèses et aux patients atteints d’un diabète de type 2. Au cours de ma thèse, après l’infusion d’une protéine de fusion recombinante (TAT-Cre) dans le 3e ventricule d’un modèle de souris floxées pour le gène codant pour les récepteurs à la leptine (LepR(loxP/loxP)), nous avons étudié le rôle des LepR dans les tanycytes dans le contrôle central de l’homéostasie énergétique chez la souris. Nos résultats montrent que la perturbation de l’expression des LepR sélectivement dans les tanycytes entraine une augmentation de la masse corporelle, de l’adiposité, de la cholestérolémie, de la triglycéridémie et une diminution de la concentration sérique en noradrénaline. Ceci est associé avec une augmentation de la prise alimentaire, une diminution de la sensibilité périphérique à la leptine sans affecter la sensibilité centrale ainsi qu’un développement progressif d’intolérance au glucose. L’activité du pancréas et du tissu adipeux de notre modèle est également affectée. En parallèle, nous avons étudié les mécanismes sous-jacents à l’action anorexigénique des endozépines. Nos résultats que les endozépines activent la voie de signalisation ERK, nécessaire au transport de la leptine dans le cerveau, au sein de tanycytes en culture et que ces molécules ont besoin de l’expression tanycytaire des LepR pour permettre la phosphorylation de STAT3 dans l’hypothalamus. Enfin, nous avons analyser l’effet de l’expression de la neurotoxine botulique de sérotype B (BoNTB) dans les tanycytes sur le contrôle de l’homéostasie énergétique, grâce à l’infusion de TAT-Cre dans le « e ventricule du modèle BoNT/B(loxP-STOP-loxP). La BoNTB inactive, grâce à un clivage protéolytique, les synaptobrévines 1-3 et altère l’exocytose associé à ces protéines. Nos résultats montrent la perturbation de l’activité de ces protéines dans les tanycytes affecte la prise alimentaire, la sensibilité à la leptine et la tolérance au glucose, comme dans le précédant modèle animal. Toutefois, nous avons constaté des différences concernant l’activité du pancréas et du tissu adipeux. L’ensemble de ces données démontre pour la première fois, le rôle clé des tanycytes hypothalamiques dans la régulation du métabolisme énergétique in vivo, ainsi que l’implication de l’expression des LepR dans les tanycytes dans l’activité de la leptine et des endozépines dans le cerveau métabolique

Tanycytes shuttle leptin into metabolic brain : molecular mechanisms and role in hormonal resistance physiopathology and diabesity

Le contrôle de la balance énergétique, permettant le maintien de la masse corporelle nécessite un dialogue continu entre la périphérie et l’hypothalamus dans le cerveau. L’accès des hormones périphériques à cette structure cérébrale est essentiel au bon fonctionnement des circuits neuronaux qui régule l’homéostasie énergétique. Toutefois, peu d’éléments concernant sur les mécanismes de transport de ces signaux métaboliques à l’hypothalamus sont actuellement connus. L’éminence médiane, une structure hypothalamique formant le plancher du 3e ventricule, contient des cellules épendymogliales hautement spécialisées appelées tanycytes. Il a été démontré que les tanycytes transportent les signaux métaboliques tels que la leptine jusqu’au liquide céphalorachidien par un mécanisme de transcytose. Identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans ce transport est essentiel à notre compréhension au phénomène de résistance centrale aux hormones, observé chez les patients obèses et aux patients atteints d’un diabète de type 2. Au cours de ma thèse, après l’infusion d’une protéine de fusion recombinante (TAT-Cre) dans le 3e ventricule d’un modèle de souris floxées pour le gène codant pour les récepteurs à la leptine (LepR(loxP/loxP)), nous avons étudié le rôle des LepR dans les tanycytes dans le contrôle central de l’homéostasie énergétique chez la souris. Nos résultats montrent que la perturbation de l’expression des LepR sélectivement dans les tanycytes entraine une augmentation de la masse corporelle, de l’adiposité, de la cholestérolémie, de la triglycéridémie et une diminution de la concentration sérique en noradrénaline. Ceci est associé avec une augmentation de la prise alimentaire, une diminution de la sensibilité périphérique à la leptine sans affecter la sensibilité centrale ainsi qu’un développement progressif d’intolérance au glucose. L’activité du pancréas et du tissu adipeux de notre modèle est également affectée. En parallèle, nous avons étudié les mécanismes sous-jacents à l’action anorexigénique des endozépines. Nos résultats que les endozépines activent la voie de signalisation ERK, nécessaire au transport de la leptine dans le cerveau, au sein de tanycytes en culture et que ces molécules ont besoin de l’expression tanycytaire des LepR pour permettre la phosphorylation de STAT3 dans l’hypothalamus. Enfin, nous avons analyser l’effet de l’expression de la neurotoxine botulique de sérotype B (BoNTB) dans les tanycytes sur le contrôle de l’homéostasie énergétique, grâce à l’infusion de TAT-Cre dans le « e ventricule du modèle BoNT/B(loxP-STOP-loxP). La BoNTB inactive, grâce à un clivage protéolytique, les synaptobrévines 1-3 et altère l’exocytose associé à ces protéines. Nos résultats montrent la perturbation de l’activité de ces protéines dans les tanycytes affecte la prise alimentaire, la sensibilité à la leptine et la tolérance au glucose, comme dans le précédant modèle animal. Toutefois, nous avons constaté des différences concernant l’activité du pancréas et du tissu adipeux. L’ensemble de ces données démontre pour la première fois, le rôle clé des tanycytes hypothalamiques dans la régulation du métabolisme énergétique in vivo, ainsi que l’implication de l’expression des LepR dans les tanycytes dans l’activité de la leptine et des endozépines dans le cerveau métabolique.The control of energy balance that allows for the maintenance of body mass requires a continued dialogue between the periphery and the hypothalamus in the brain. The access of peripheral hormones to that structure is essential to the proper functioning of neural circuits that regulate energy balance. However, little is known about the transport mechanisms of circulating metabolic signals into the hypothalamus. The median eminence, a hypothalamic structure forming the floor of the 3rd ventricle, contains specialized ependymoglial cells called tanycytes. Tanycytes have been shown to shuttle metabolic signals such as leptin into the cerebrospinal fluid, via transcytosis. Identifying the molecular mechanisms involved in this transport is essential to our understanding of the phenomenon of central hormone resistance found in obese and type 2 diabetes patients. During my thesis, after an infusion of a recombinant fusion protein (TAT-Cre) into the 3rd ventricle of leptin receptor gene-floxed mouse model (LepR(loxP/loxP)), we investigated the role of the LepR in tanycytes on the central control of energy homeostasis in mice. Our results show that selectively impairing LepR expression in tanycytes increases body weight, adiposity, cholesterolemia, triglyceridemia and decreases noradrenaline serum concentration. It’s associated with an increase of food intake, peripheral but not central leptin anorectic effect and glucose intolerance. Pancreas and adipose tissue activity of our model is also affected. In parallel, we studied the mechanisms underlying the anorexigenic action of endozepines. Our results show that endozepines induce ERK activation necessary for leptin transport into the brain in primary culture of tanycytes and require tanycytic LepR expression to promote STAT3 phosphorylation in the hypothalamus. Finally, we also investigated the effect of the expression of the type B botulinum neurotoxin BoNTB, in tanycytes on the central control of energy homeostasis in mice. BoNTB inactivates synaptobrevins 1-3 by proteolytic cleavage and thus alters synaptobrevin-mediated exocytosis. Our results show that selectively impairing synaptobrevin function in tanycytes affects as in the previous model the basal food intake, leptin sensitivity and glucose tolerance in mice. However, we noticed some differences in pancreas activity compared to the model in which we selectively impaired LepR expression in tanycytes. Altogether, these data demonstrate for the first time the key role of tanycytes in the central control of energy regulation in-vivo and the involvement of LepR expression in tanycytes for circulating leptin and endozepines action in the metabolic brain

Incidence de paramètres technologiques sur l'expression de gènes et la production d'entérotoxines de Staphylococcus aureus au cours des 72 h suivant l'empresurage des laits en fabrication fromagère

In France, Staphylococcus aureus is reported to be the most frequent pathogen involved in food-borne diseases associated with milk and dairy products. Food poisoning results from ingestion of staphylococcal enterotoxins (SE) preformed in food by enterotoxigenic strains of S. aureus. In order to identify key technological parameters affecting S. aureus growth, enterotoxin gene expression and enterotoxin production during uncooked semi-hard cheese manufacturing, the impact of varying certain process parameters was studied with various experimental designs. To study enterotoxin gene expression during cheese manufacture, we first developed an efficient procedure to recover total RNA from cheese and applied a robust strategy to study gene expression by quantitative RT-PCR. Based on a survey of practices performed amongst uncooked semi-hard cheese manufacturers, we studied the impact of five technological parameters of the cheese-making process on the behavior of five enterotoxigenic strains producing enterotoxin A, B, C or D and independently inoculated at 10³ cfu/ml in milk, during the first 72 h of the manufacturing. Whatever the parameters and the strains tested, the S. aureus population was found to exceed 10⁵ cfu/g of cheese four hours after molding. In the 54 different cheese productions, SEA and SED were the only enterotoxins detected, and in very low (non measurable for SEA) and variable quantities depending on the parameters studied. Enterotoxin production seems to be correlated with an early gene expression during cheese processing (less than 6 hours after milk renneting). The first experimental design carried out highlighted that among the five parameters studied, temperature and duration of milk maturation had the biggest impact on the SE production. Using response surface methodology, we established mathematical models to describe the relationship between staphylococcal enterotoxin gene expression and production and both milk maturation parameters. Milk maturation temperature was demonstrated to be the key technological parameter that must be fixed to limit the risk of staphylococcal food poisoning.En France, Staphylococcus aureus est le micro-organisme pathogène le plus souvent incriminé dans des cas de toxi-infections alimentaires collectives par le lait et les produits laitiers. L'intoxication alimentaire résulte de l'ingestion d'entérotoxines staphylococciques (SE) produites dans les aliments par des souches de S. aureus productrices de SE. Dans le but d'identifier les principaux paramètres technologiques qui affectent la croissance de S. aureus, l'expression des gènes et la production d'entérotoxines pendant la fabrication de fromage à pâte pressée non cuite, l'impact de différents paramètres du procédé a été étudié à l'aide de plans d'expériences. Pour étudier l'expression des gènes des entérotoxines au cours de la fabrication de fromage, nous avons tout d'abord développé une méthode efficace pour récupérer l'ARN total à partir de fromage et nous avons appliqué une stratégie robuste pour étudier l'expression de gènes par RT-PCR quantitative. En se basant sur les résultats d'une enquête sur les pratiques des fabricants de fromages à pâte pressée non cuite, nous avons ensuite étudié l'impact de cinq paramètres technologiques du procédé de fabrication sur le comportement de cinq souches productrices des entérotoxines A, B, C ou D, indépendamment inoculées à 10³ ufc/ml dans le lait, au cours des 72 premières heures de la fabrication. Quels que soient les paramètres testés ou les souches étudiées, la population de S. aureus atteint au moins 10⁵ ufc/g de fromage quatre heures après le moulage. Au cours des 54 fabrications fromagères, SEA et SED sont les seules entérotoxines détectées, en quantité très faible (non quantifiable pour SEA) et variable en fonction des paramètres étudiés. La production d'entétérotoxine semble corrélée à une expression précoce du gène au cours de la fabrication (moins de 6 heures après l'emprésurage du lait). Le premier plan d'expériences mis en œuvre a révélé que, parmi les cinq paramètres étudiés, la température et la durée de maturation du lait avaient le plus fort impact sur la production de SE. Par la méthodologie des surfaces de réponses, nous avons ensuite établi des modèles mathématiques pour décrire la relation entre l'expression des gènes et la production d'entérotoxines et les deux paramètres de maturation du lait. La température de maturation du lait apparaît comme le paramètre clé qui doit être contrôlé pour limiter le risque d'intoxication alimentaire par S. aureus dans les fromages à pâte pressée non cuite

Incidence de paramètres technologiques sur l'expression de gènes et la production d'entérotoxines de Staphylococcus aureus au cours des 72 h suivant l'empresurage des laits en fabrication fromagère

en français : En France, Staphylococcus aureus est le micro-organisme pathogène le plus souvent incriminé dans des cas de toxi-infections alimentaires collectives par le lait et les produits laitiers. L'intoxication alimentaire résulte de l'ingestion d'entérotoxines staphylococciques (SE) produites dans les aliments par des souches de S. aureus productrices de SE. Dans le but d'identifier les principaux paramètres technologiques qui affectent la croissance de S. aureus, l'expression des gènes et la production d'entérotoxines pendant la fabrication de fromage à pâte pressée non cuite, l'impact de différents paramètres du procédé a été étudié à l'aide de plans d'expériences. Pour étudier l'expression des gènes des entérotoxines au cours de la fabrication de fromage, nous avons tout d'abord développé une méthode efficace pour récupérer l'ARN total à partir de fromage et nous avons appliqué une stratégie robuste pour étudier l'expression de gènes par RT-PCR quantitative. En se basant sur les résultats d'une enquête sur les pratiques des fabricants de fromages à pâte pressée non cuite, nous avons ensuite étudié l'impact de cinq paramètres technologiques du procédé de fabrication sur le comportement de cinq souches productrices des entérotoxines A, B, C ou D, indépendamment inoculées à 10 ufc/ml dans le lait, au cours des 72 premières heures de la fabrication. Quels que soient les paramètres testés ou les souches étudiées, la population de S. aureus atteint au moins 10 ufc/g de fromage quatre heures après le moulage. Au cours des 54 fabrications fromagères, SEA et SED sont les seules entérotoxines détectées, en quantité très faible (non quantifiable pour SEA) et variable en fonction des paramètres étudiés. La production d'entétérotoxine semble corrélée à une expression précoce du gène au cours de la fabrication (moins de 6 heures après l'emprésurage du lait). Le premier plan d'expériences mis en œuvre a révélé que, parmi les cinq paramètres étudiés, la température et la durée de maturation du lait avaient le plus fort impact sur la production de SE. Par la méthodologie des surfaces de réponses, nous avons ensuite établi des modèles mathématiques pour décrire la relation entre l'expression des gènes et la production d'entérotoxines et les deux paramètres de maturation du lait. La température de maturation du lait apparaît comme le paramètre clé qui doit être contrôlé pour limiter le risque d'intoxication alimentaire par S. aureus dans les fromages à pâte pressée non cuite.en anglais : In France, Staphylococcus aureus is reported to be the most frequent pathogen involved in food-borne diseases associated with milk and dairy products. Food poisoning results from ingestion of staphylococcal enterotoxins (SE) preformed in food by enterotoxigenic strains of S. aureus. In order to identify key technological parameters affecting S. aureus growth, enterotoxin gene expression and enterotoxin production during uncooked semi-hard cheese manufacturing, the impact of varying certain process parameters was studied with various experimental designs. To study enterotoxin gene expression during cheese manufacture, we first developed an efficient procedure to recover total RNA from cheese and applied a robust strategy to study gene expression by quantitative RT-PCR. Based on a survey of practices performed amongst uncooked semi-hard cheese manufacturers, we studied the impact of five technological parameters of the cheese-making process on the behavior of five enterotoxigenic strains producing enterotoxin A, B, C or D and independently inoculated at 10 cfu/ml in milk, during the first 72 h of the manufacturing. Whatever the parameters and the strains tested, the S. aureus population was found to exceed 10 cfu/g of cheese four hours after molding. In the 54 different cheese productions, SEA and SED were the only enterotoxins detected, and in very low (non measurable for SEA) and variable quantities depending on the parameters studied. Enterotoxin production seems to be correlated with an early gene expression during cheese processing (less than 6 hours after milk renneting). The first experimental design carried out highlighted that among the five parameters studied, temperature and duration of milk maturation had the biggest impact on the SE production. Using response surface methodology, we established mathematical models to describe the relationship between staphylococcal enterotoxin gene expression and production and both milk maturation parameters. Milk maturation temperature was demonstrated to be the key technological parameter that must be fixed to limit the risk of staphylococcal food poisoning.MASSY-AgroParisTech (913772301) / SudocSudocFranceF

Programming the Brain from the Womb: Maternal Obesity Perturbs the Hypothalamic Blood-Brain Barrier

International audienceNo abstract availabl

Differential temporal expression of the staphylococcal enterotoxins genes during cell growth

International audienceStaphylococcal enterotoxins (SEs) are a large family of structurally related superantigens produced by Staphylococcus aureus and responsible for staphylococcal food-poisoning (SFP). To better understand how the se genes are expressed, and especially the newly described ones (seg to ser, seu), a quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction was developed and used to monitor their expression in a panel of 28 enterotoxigenic staphylococci including seven reference strains and 21 isolates collected from foods and SFP outbreaks in France. Kinetic mRNA studies revealed four distinct patterns of expression according to the enterotoxins genes analysed corresponding either to: (i) unchanged mRNAs abundance during bacterial growth (sea, see, sej, sek, seq and sep); (ii) slight decrease in transcript levels (seg, sei, sem, sen, seo, seu); (iii) drastic induction of expression at the end of the exponential growth phase (seb, sec, seh), or (iv) modest post-exponential increase in mRNAs level (<10-fold) (sed, ser, sel). The study demonstrates that all se containing strains are potentially able to produce SEs and that most of the newly described se genes are likely not controlled by the agr system. The rapid assessment of se transcripts levels by RT-qPCR might provide valuable clue to evaluate the poisoning risk linked to a strain

Validation of reference genes for quantitative expression analysis by real-time RT-PCR in <it>Saccharomyces cerevisiae</it>

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Real-time RT-PCR is the recommended method for quantitative gene expression analysis. A compulsory step is the selection of good reference genes for normalization. A few genes often referred to as HouseKeeping Genes (HSK), such as <it>ACT1</it>, <it>RDN18 </it>or <it>PDA1 </it>are among the most commonly used, as their expression is assumed to remain unchanged over a wide range of conditions. Since this assumption is very unlikely, a geometric averaging of multiple, carefully selected internal control genes is now strongly recommended for normalization to avoid this problem of expression variation of single reference genes. The aim of this work was to search for a set of reference genes for reliable gene expression analysis in <it>Saccharomyces cerevisiae</it>.</p> <p>Results</p> <p>From public microarray datasets, we selected potential reference genes whose expression remained apparently invariable during long-term growth on glucose. Using the algorithm geNorm, <it>ALG9</it>, <it>TAF10</it>, <it>TFC1 </it>and <it>UBC6 </it>turned out to be genes whose expression remained stable, independent of the growth conditions and the strain backgrounds tested in this study. We then showed that the geometric averaging of any subset of three genes among the six most stable genes resulted in very similar normalized data, which contrasted with inconsistent results among various biological samples when the normalization was performed with <it>ACT1</it>. Normalization with multiple selected genes was therefore applied to transcriptional analysis of genes involved in glycogen metabolism. We determined an induction ratio of 100-fold for <it>GPH1 </it>and 20-fold for <it>GSY2 </it>between the exponential phase and the diauxic shift on glucose. There was no induction of these two genes at this transition phase on galactose, although in both cases, the kinetics of glycogen accumulation was similar. In contrast, <it>SGA1 </it>expression was independent of the carbon source and increased by 3-fold in stationary phase.</p> <p>Conclusion</p> <p>In this work, we provided a set of genes that are suitable reference genes for quantitative gene expression analysis by real-time RT-PCR in yeast biological samples covering a large panel of physiological states. In contrast, we invalidated and discourage the use of <it>ACT1 </it>as well as other commonly used reference genes (<it>PDA1, TDH3, RDN18</it>, etc) as internal controls for quantitative gene expression analysis in yeast.</p

Hypothalamic dopamine signaling regulates brown fat thermogenesis

Dopamine signaling is a crucial part of the brain reward system and can affect feeding behavior. Dopamine receptors are also expressed in the hypothalamus, which is known to control energy metabolism in peripheral tissues. Here we show that pharmacological or chemogenetic stimulation of dopamine receptor 2 (D2R) expressing cells in the lateral hypothalamic area (LHA) and the zona incerta (ZI) decreases body weight and stimulates brown fat activity in rodents in a feeding-independent manner. LHA/ZI D2R stimulation requires an intact sympathetic nervous system and orexin system to exert its action and involves inhibition of PI3K in the LHA/ZI. We further demonstrate that, as early as 3 months after onset of treatment, patients treated with the D2R agonist cabergoline experience an increase in energy expenditure that persists for one year, leading to total body weight and fat loss through a prolactin-independent mechanism. Our results may provide a mechanistic explanation for how clinically used D2R agonists act in the CNS to regulate energy balance

Tool for Quantification of Staphylococcal Enterotoxin Gene Expression in Cheese▿

Cheese is a complex and dynamic microbial ecosystem characterized by the presence of a large variety of bacteria, yeasts, and molds. Some microorganisms, including species of lactobacilli or lactococci, are known to contribute to the organoleptic quality of cheeses, whereas the presence of other microorganisms may lead to spoilage or constitute a health risk. Staphylococcus aureus is recognized worldwide as an important food-borne pathogen, owing to the production of enterotoxins in food matrices. In order to study enterotoxin gene expression during cheese manufacture, we developed an efficient procedure to recover total RNA from cheese and applied a robust strategy to study gene expression by reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). This method yielded pure preparations of undegraded RNA suitable for RT-qPCR. To normalize RT-qPCR data, expression of 10 potential reference genes was investigated during S. aureus growth in milk and in cheese. The three most stably expressed reference genes during cheese manufacture were ftsZ, pta, and gyrB, and these were used as internal controls for RT-qPCR of the genes sea and sed, encoding staphylococcal enterotoxins A and D, respectively. Expression of these staphylococcal enterotoxin genes was monitored during the first 72 h of the cheese-making process, and mRNA data were correlated with enterotoxin production

Milk maturation temperature and time are key technological parameters to limit staphylococcal enterotoxin production during uncooked semi-hard cheese manufacture

International audienceThe influence of five technological parameters selected amongst uncooked semi-hard cheese-making practices, i. e. milk maturation temperature and time, stirring during maturation, curd stirring time and pressing time was examined on Staphylococcus aureus growth, enterotoxin gene expression and enterotoxin (SE) production during cheese manufacture. A fractional factorial experimental design was applied to perform 32 cheese batches independently inoculated at 103 cfu/ml of milk using four strains producing SEA, SEB, SEC or SED.The S. aureus population was found to exceed 105 cfu/g of cheese four hours after molding. SED was the only enterotoxin detected. It was produced in very low quantities that varied with the parameters studied. Early sed gene expression during cheese processing was correlated with SED detection in curd and cheese. Milk maturation temperature and time emerge as key technological parameters that control SED production. A response surface methodology was then carried out to further characterize the relationships between both factors and SE production in cheese and whey. Two SED-producing strains were used to perform two sets of ten cheese batches based on a central composite design of experiments at five levels. Predictive mathematical models were established.Increasing the temperature at the beginning of the cheese-making process was shown to increase SED production. Furthermore, we determined that the proportion of SED drained after molding from the curd in the whey depended only on the technological parameters. The two SED-producing strains showed similar trends of behavior but specific level of gene expression and enterotoxin production in response to the same set of milk maturation parameters