Evaluación de la expresión de las proteínas PPARγ Y NFκB en vellosidades intestinales de ratones adultos ICR infectados con rotavirus ECwt y tratados con pioglitazona

ANTECEDENTES Rotavirus es la principal causa de diarrea severa en niños menores de cinco años de edad en todo el mundo, según la OMS, rotavirus causa aproximadamente 527.000 muertes cada año (1). Dos vacunas de rotavirus vivos atenuados (Rotarix ™) y (RotaTeq ™) están disponibles actualmente (2). Aunque estas vacunas han demostrado su eficacia, no evita la aparición de los síntomas y muchos niños permanecen sin vacunar. Por consiguiente, se necesitan alternativas farmacológicas para el tratamiento de niños en los que no se pudo evitar la infección. Por tanto, se requiere desarrollar más investigación y evaluar medicamentos que interfieran con la infección por rotavirus. Investigaciones anteriores en nuestro laboratorio indicaron que algunos AINES, agonistas de PPAR y antioxidantes tales como NAC y ácido ascórbico, reducen la infección por rotavirus. Sin embargo, sería interesante determinar el tiempo específico de ciclo viral en el que la infección en inhibida por los fármacos probados. Por otro lado, se requiere relacionar los cambios en las proteínas celulares y virales asociados directamente o indirectamente con el tratamiento farmacológico; esto es muy importante para entender los detalles relacionados con las interacciones célula-rotavirus. OBJETIVO: Evaluar la expresión de las proteínas PPARγ y NFκB en un modelo in vivo que consiste en analizar las vellosidades intestinales de los ratones ICR adultos infectados con la cepa de rotavirus ECwt y tratados con pioglitazona, y un modelo in vitro que consiste en aislar las vellosidades intestinales de ratones y después de infectarlas con Ecwt, tratarlas con pioglitazona. MATERIALES Y MÉTODOS: Ratones ICR o vellosidades intestinales aisladas fueron infectadas con ECwt y luego tratadas o no con el agonista PPARγ pioglitazona. Tanto la infección, como la expresión de las proteínas celulares se evaluaron utilizando inmunocitoquímica, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica, fluorescencia por microscopía confocal, citometría de flujo, Western blot, ELISA de captura y ELISA directo. En todos los casos, los niveles de expresión de proteína se compararon con sus correspondientes controles no tratados. RESULTADOS: Los datos mostraron que las proteínas celulares PPARγ, NFκB, PDI y Hsc70, y ROS tanto in vivo como in vitro disminuyeron cuando las vellosidades intestinales de los ratones infectados por rotavirus o vellosidades aisladas infectadas in vitro fueron tratadas con pioglitazona. También se encontró que el nivel de antígenos de rotavirus estructurales disminuyó tanto in vivo como in vitro después del tratamiento con pioglitazona. CONCLUSIÓN: Se propone que la activación de PPARγ con su agonista pioglitazona conduce a la activación o inhibición de las vías o factores que a su vez inhiben las vías requeridas por proceso infeccioso de rotavirus, tales como NFκB-Cox-2-ROS, lo que resulta en la reducción de la infección viral .Abstract. BACKGROUND Rotavirus is the leading cause of severe diarrhea in children under five years of age worldwide. According to the WHO, rotaviruses cause approximately 527,000 deaths each year (1). Two live attenuated rotavirus vaccines (Rotarix ™) and (RotaTeq ™) are currently available (2). Although these vaccines have shown efficacy, symptoms are not completely prevented in some cases, and many children remain unvaccinated. Therefore, pharmacological alternatives are needed for treatment of children in whom infection could not be prevented. Therefore, further research is needed in order to develop and assess drugs that interfere with rotavirus infection. Previous research in our laboratory indicated that some NSAIDs, PPAR agonists and antioxidants such as NAC and ascorbic acid, reduce rotavirus infection. However, it would be interesting to determine the specific time of viral cycle at which infection in inhibited by the drugs tested. On the other hand, gaining insight into the cellular and viral protein changes directly or indirectly associated with the drug treatment would be very important to understand the details related with rotavirus-cell interactions. OBJECTIVE: To evaluate the expression of PPARγ and NFκB proteins in both an in vivo model system consisting of intestinal villi from ICR adult mice infected with the rotavirus strain ECwt and treated with pioglitazone, and a in vitro model system consisting of intestinal villi isolated from mice and then infected with ECwt and treated with pioglitazone. MATERIALS AND METHODS: Either mice or intestinal villi isolated from ICR mice were infected with ECwt and then treated or not with the PPARγ agonist pioglitazone. Both infection and expression of cellular proteins were assessed using immunocytochemistry, immunofluorescence, immunohistochemistry, confocal fluorescence, flow cytometry, Western blot, ELISA capture and direct ELISA. In all cases, protein expression levels were compared to their corresponding untreated controls. RESULTS: The data showed that the cellular proteins PPARy, NFκB, PDI and Hsc70, and ROS in both in vivo and in vitro model systems decreased when small intestinal villi from rotavirus-infected mice or isolated villi infected in vitro were treated with pioglitazone. It was also found that the level of structural rotavirus antigens decreased after in vivo or in vitro treatment with pioglitazone. CONCLUSION: It is proposed that the activation of PPARy with the agonist pioglitazone leads to activation or inhibition of pathways or factors that in turn inhibit pathways required by rotavirus infection process such as NFκB-Cox-2-ROS, resulting in the reduction of viral infection.Maestrí

PPAR γ

Rotavirus infection has been reported to induce an inflammatory response in the host cell accompanied by the increased expression or activation of some cellular molecules including ROS, NF-κB, and COX-2. PPARγ stimulation and N-acetylcysteine (NAC) treatment have been found to interfere with viral infections including rotavirus infection. Small intestinal villi isolated from in vivo infected mice with rotavirus ECwt were analyzed for the percentage of ECwt-infected cells, the presence of rotavirus antigens, and infectious virion yield following treatment with pioglitazone. Isolated villi were also infected in vitro and treated with PPARγ agonists (PGZ, TZD, RGZ, DHA, and ALA), all-trans retinoic acid (ATRA), and NAC. After treatments, the expression of cellular proteins including PPARγ, NF-κB, PDI, Hsc70, and COX-2 was analyzed using immunochemistry, ELISA, immunofluorescence, and Western blotting. The results showed that rotavirus infection led to an increased accumulation of the cellular proteins studied and ROS. The virus infection-induced accumulation of the cellular proteins studied and ROS was reduced upon pioglitazone treatment, causing also a concomitant reduction of the infectious virion yield. We hypothesized that rotavirus infection is benefiting from the induction of a host cell proinflammatory response and that the interference of the inflammatory pathways involved leads to decreased infection

Possible unions between proteins related to the PPARγ – NFκB pathway and non-structural proteins of rotavirus

ilustraciones, fotografías, graficasRotavirus es un virus perteneciente a la familia Reoviridae, icosaédrico sin envoltura; su cápside está constituida por tres capas: externa, media e interna. Mide aproximadamente 70 nm de diámetro, su genoma de 11 segmentos de ARN de doble-cadena codifica para seis proteínas estructurales (VP) y seis proteínas no estructurales (NSP). OBJETIVO GENERAL: Determinar la unión de las proteínas no estructurales de Rotavirus (NSP1-6) con proteínas de la vía PPARγ – NFκB. METODOLOGÍA: Se evaluó la expresión de proteínas celulares relacionadas con las vías NFκB y PPARγ, mediante las técnicas de ELISA, luminiscencia, citometría de flujo y Western blot, en células MA104 infectadas con Rotavirus y/o transfectadas con cada uno de los plásmidos que expresan para proteínas NSPs. La unión entre proteínas celulares y virales (NSPs) se examinó por las técnicas de ELISA, Epi-fluorescencia y microscopia confocal. RESULTADOS: La expresión de las proteínas p-IKKα/β, NFκB, p-NFκB, PPARγ, RXR y PGC1α aumentaron en células infectadas con rotavirus RRV y en células transfectadas con plásmidos que expresan para cada una de las NSPs se observó que la expresión de p-IKKα/β aumento en presencia de NSP3,4,5 y 6; NFκB aumento en presencia de NSP1, 3 y 4, p-NFκB aumento en presencia de NSP1, 2, 3, 4, 5 y 6; PPARγ aumento en presencia de NSP1, 3, 5 6; RXR aumentó en presencia de NSP4, 6 y PGC1α aumento en presencia de NSP1 y 5. Al analizar por ELISA la unión in-vitro con proteínas recombinantes se observó unión entre rPPARγ y rNSP 1, 2, 3, 4 y RXR con rNSP1; cuando se estudió la unión por ELISA in-vivo en células infectadas y/o transfectadas con cada uno de los plásmidos que expresan proteínas celulares con las proteínas virales, se evidenció unión entre PPARγ con NSP1, 2, 3, 4; RXR con NSP1,6; p-IKKα/β con NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5, NSP6 y p-NFκB con NSP 5, 6. Posteriormente, por microscopia confocal, se observó colocalización de RXR con NSP1; PPARγ con NSP1 y NSP3; p-IKKα/β con NSP2 y NFκB con NSP5. Finalmente, cuando se analizó si la infección por rotavirus RRV afecta la activación de la vía inflamatoria; se estudió la expresión de PPARγ a nivel citoplasmático y nuclear por Western blot, identificándose la presencia de p- PPARγ. Adicionalmente, por ELISA in-vivo en células, se evaluó la unión entre PPARγ y PGC1α, encontrándose que solo a nivel nuclear hay unión de estas dos proteínas celulares en células infectadas con rotavirus RRV y en células transfectadas con los plásmidos que expresan para NSP2 y 4. Además, al activar la vía PPARγ con un agonista como Tiazolinediona o inhibirla con un antagonista como GW-9662, tratando células infectadas o no y/o transfectadas con plásmidos que expresan para cada una de las proteínas NSPs, se observó que la expresión de PPARγ disminuía en células infectadas y tratadas con Tiazolinediona y aumentaba en células infectadas y tratadas con el inhibidor GW-9662, pero cuando las células eran transfectadas con plásmidos que expresan para cada una de las proteínas NSPs y tratadas con el inhibidor GW-9662 se observó aumento de la expresión de PPARγ en presencia de NSP1, 5 y 6. Por otra parte, cuando se inhibió la vía NFκB con un inhibidor como curcumina, se observó que la expresión de NFκB disminuía en células infectadas y tratadas con curcumina y en células transfectadas con plásmidos que expresan para cada una de las proteínas NSPs y tratadas con curcumina se observó disminución de la expresión de NFκB en presencia de NSP2 y 4. CONCLUSIÓN: Durante la infección por Rotavirus, la expresión de NFκB y su actividad transcripcional aumentan, se observa que RXR colocaliza con NSP1, PPARγ colocaliza con NSP1 y NSP3, p-IKKα/β colocaliza con NSP2 y NFκB colocaliza con NSP5. Adicionalmente, a nivel citoplasmático se detectó que a las 12 h.p.i. PPARγ está siendo fosforilado. Por otra parte, en el núcleo, PPARγ se encuentra unido a PGC1α, sin embargo, la actividad transcripcional disminuye. (Texto tomado de la fuente)Rotavirus is a virus belonging to the family Reoviridae, icosahedral without envelope; Its capsid is made up of three layers: external, middle and internal. Measuring approximately 70nm in diameter, its 11-segment double-stranded RNA genome encodes six structural (VP) and six non-structural (NSP) proteins. GENERAL OBJECTIVE: To determine the union of the non-structural Rotavirus proteins (NSP1-6) with proteins of the PPARγ-NFκB pathway. METHODOLOGY: The expression of cellular proteins related to the NFκB and PPARγ pathways was evaluated, using ELISA, luminescence, flow cytometry and Western blot techniques, in MA104 cells infected with Rotavirus and / or transfected with each of the plasmids that express for NSPs proteins. The binding between cellular and viral proteins (NSPs) was examined by ELISA, Epi-fluorescence and confocal microscopy techniques. RESULTS: The expression of the proteins p-IKKα / β, NFκB, p-NFκB, PPARγ, RXR and PGC1α increased in cells infected with rotavirus RRV and in cells transfected with plasmids expressing for each of the NSPs it was observed that the expression p-IKKα / β increase in the presence of NSP3,4,5 and 6; NFκB increased in the presence of NSP1, 3 and 4, p-NFκB increased in the presence of NSP1, 2, 3, 4, 5 and 6; PPARγ increased in the presence of NSP1, 3, 5 6; RXR increased in the presence of NSP4, 6 and PGC1α increased in the presence of NSP1 and 5. When analyzing in-vitro the binding in vitro with recombinant proteins, binding between rPPARγ and rNSP 1, 2, 3, 4 and RXR with rNSP1 was observed; When the binding by ELISA in-vivo was studied in cells infected and / or transfected with each one of the plasmids that express cellular proteins with the viral proteins, binding between PPARγ with NSP1, 2, 3, 4 was evident; RXR with NSP1,6; p-IKKα / β with NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5, NSP6 and p-NFκB with NSP 5, 6. Subsequently, by confocal microscopy, RXR colocalization with NSP1 was observed; PPARγ with NSP1 and NSP3; p-IKKα / β with NSP2 and NFκB with NSP5. Finally, when it was analyzed if the infection by rotavirus RRV affects the activation of the inflammatory pathway; The expression of PPARy at the cytoplasmic and nuclear level was studied by Western blot, identifying the presence of p-PPARy. Additionally, by in-vivo ELISA in cells, the binding between PPARγ and PGC1α was evaluated, finding that only at the nuclear level there is binding of these two cellular proteins in cells infected with rotavirus RRV and in cells transfected with the plasmids that express for NSP2 and 4. Furthermore, when activating the PPARγ pathway with an agonist such as Thiazolinedione or inhibiting it with an antagonist such as GW-9662, treating cells infected or not and / or transfected with plasmids that express for each of the NSPs proteins, it was observed that the expression PPARγ decreased in cells infected and treated with Thiazolinedione and increased in cells infected and treated with the GW-9662 inhibitor, but when the cells were transfected with plasmids that express for each of the NSPs proteins and treated with the GW-9662 inhibitor, observed an increase in PPARγ expression in the presence of NSP1, 5 and 6. On the other hand, when the NFκB pathway was inhibited with an inhibitor such as curcum ina, it was observed that the expression of NFκB decreased in cells infected and treated with curcumin and in cells transfected with plasmids that express for each of the NSPs proteins and treated with curcumin, a decrease in the expression of NFκB was observed in the presence of NSP2 and 4. CONCLUSION: During Rotavirus infection, the expression of NFκB and its transcriptional activity increase, it is observed that RXR collocates with NSP1, PPARγ collocates with NSP1 and NSP3, p-IKKα / β collocates with NSP2 and NFκB collocates with NSP5. Additionally, at the cytoplasmic level, it was detected that at 12 p.m. PPARγ is being phosphorylated. On the other hand, in the nucleus, PPARγ is bound to PGC1α, however, transcriptional activity decreases.DoctoradoDoctor en BiotecnologíaSe evaluó la expresión de proteínas celulares relacionadas con las vías NFκB y PPARγ, mediante las técnicas de ELISA, luminiscencia, citometría de flujo y Western blot, en células MA104 infectadas con Rotavirus y/o transfectadas con cada uno de los plásmidos que expresan para proteínas NSPs. La unión entre proteínas celulares y virales (NSPs) se examinó por las técnicas de ELISA, Epi-fluorescencia y microscopia confocal.Biología Molecular de Viru