Epigenetic alterations in brain and liver following administration of heroin or cocaine to mice

The aim of the present thesis was to study the global methylation of DNA in the brain and liver following heroin or cocaine administration in mice. The DNA extracts were analyzed by high performance liquid chromatography coupled with ultraviolet detection and the results were statistically analyzed for the comparison between the two tissues and between different groups of animals (dosed vs non-dosed).For the purposes of the study, four groups (n=9) of animals were used. Two of the groups received either heroin or cocaine, according to protocols that mimic addiction, whilst the other two groups served as controls. One hour after the last drug administration, the animals were sacrificed, their organs were removed, frozen with liquid nitrogen and stored at -80°C. Appropriate isolation protocols were used to extract genetic material of high purity which was enzymatically hydrolyzed into bases. 10 μg of hydrolyzed DNA were analyzed by HPLC-UV, by using a method developed and validated in our laboratory. The method used, showed good linearity, excellent separation and was highly reproducible and accurate, whilst the total analysis time reached 50 min. The results were expressed as the percentage of 5-mdC over the overall cytosine content.Following the extraction, hydrolysis and chromatographic analysis of 72 samples, the global methylation status of brain and liver DNA was compared between the animals that had been dosed with cocaine or heroin and the corresponding control animals. The results of the present study revealed that there is no significant difference in the global methylation status between the dosed and the control animals in both tissues. In addition, the % 5-mdC was always found to be higher in the brain compared to the liver. The fact that no significant alterations were found in the global DNA methylation status following cocaine or heroin administration could be possibly attributed to the fact that some DNA regions may be hypomethylated, while others are hypermethylated, therefore cancelling each other out. In addition, different effects (hypomethylation and hypermethylation) may cancel each other out in anatomically different parts of the same tissue. Our findings could also be supported by the theory that following drug administration and subsequent changes in methylation, the protective mechanisms of the organism may start repairing the epigenome either by triggering de novo methylation or by initiating demethylation, a process that involves the formation of 5-hmdC from 5-mdC. A future inquiry into the DNA methylation changes in different genomic regions or in anatomically different parts of the tissue, as well as in various other factors such as 5-hmdC or DNMTs could shed a light into the exact epigenetic mechanisms triggered by drugs of abuse.Σκοπός της διατριβής αυτής ήταν η μελέτη της καθολικής μεθυλίωσης του DNA στον εγκέφαλο και στο ήπαρ επίμυων μετά από χορήγηση κοκαΐνης ή ηρωίνης. Για το σκοπό αυτό, αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε μία μέθοδος υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης με υπεριώδη ανίχνευση. Στη συνέχεια, εκτιμήθηκε η σταθερότητα των δειγμάτων κάτω από διαφορετικές συνθήκες αποθήκευσης και χειρισμούς και τελικά, η μέθοδος που αναπτύχθηκε εφαρμόστηκε στην ανάλυση των δειγμάτων.Αφορμή για την πραγματοποίηση της εν λόγω διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η διαπίστωση ότι οι επιγενετικές δράσεις της κοκαΐνης και της ηρωίνης δεν έχουν μελετηθεί, παρ’ όλο που ο επιστημονικός κλάδος της επιγενετικής γνωρίζει συνεχώς αυξανόμενο επιστημονικό ενδιαφέρον. Για το σκοπό της διατριβής, χρησιμοποιήθηκαν τέσσερις ομάδες των εννέα επίμυων, από τις οποίες οι δύο έλαβαν κοκαΐνη ή ηρωίνη βάσει πρωτοκόλλων που μιμούνται τον εθισμό στους ανθρώπους και οι άλλες δύο χρησιμοποιήθηκαν ως οι αντίστοιχοι μάρτυρες. Μία ώρα μετά την τελευταία χορήγηση τα ζώα θανατώθηκαν και αφαιρέθηκαν τα όργανά τους, τα οποία κατόπιν εμβάπτισης σε υγρό άζωτο αποθηκεύτηκαν στους -80°C. Με κατάλληλα πρωτόκολλα απομόνωσης του DNA ελήφθη υψηλής καθαρότητας γενετικό υλικό, το οποίο στη συνέχεια υδρολύθηκε ενζυματικά για να διασπαστεί στα επιμέρους νουκλεοτίδια. 10 μg υδρολυμένου DNA αναλύθηκαν με HPLC-UV. Η συγκεκριμένη μέθοδος αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε για τον ποιοτικό προσδιορισμό των τεσσάρων βάσεων του DNA και της πέμπτης βάσης, της 5-mdC και για την ποσοτικοποίηση δύο εξ αυτών, της 5-mdC και της dC. Η μέθοδος παρουσίασε γραμμικότητα, πολύ καλό διαχωρισμό και υψηλή επαναληψιμότητα και αναπαραγωγιμότητα. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ποσοστό της 5-mdC έναντι της συνολικής κυτοσίνης. Μετά από επεξεργασία και ανάλυση 72 δειγμάτων ιστών, συγκρίθηκε η καθολική μεθυλίωση στο ήπαρ και στον εγκέφαλο μεταξύ των πειραματοζώων που έλαβαν ηρωίνη ή κοκαΐνη και των αντίστοιχων υγιών μαρτύρων. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έδειξε ότι δεν υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά στην καθολική μεθυλίωση μεταξύ πειραματοζώων και μαρτύρων και για τους δύο ιστούς που μελετήθηκαν. Επιπρόσθετα, η % 5-mdC βρέθηκε πάντα να είναι στατιστικά σημαντικά μεγαλύτερη στον εγκέφαλο από ότι στο ήπαρ και στις τέσσερις ομάδες επίμυων. Η απουσία μεταβολών στην καθολική μεθυλίωση του DNA μετά τη χορήγηση ηρωίνης και κοκαΐνης ενδεχομένως οφείλεται σε αντισταθμιζόμενες επιδράσεις αυτών των ουσιών σε διαφορετικές περιοχές του γονιδιώματος. Είναι πιθανό κάποιες περιοχές του DNA να υπο-μεθυλιώνονται, ενώ κάποιες άλλες να υπερ-μεθυλιώνονται διατηρώντας έτσι τα συνολικά επίπεδα μεθυλίωσης αμετάβλητα. Εκτός αυτού, είναι εξίσου πιθανό να υπάρχουν διαφορετικές επιγενετικές επιδράσεις σε διαφορετικές ανατομικές περιοχές του ήπατος και του εγκεφάλου. Τέλος, μία άλλη αιτία μπορεί να είναι η ενεργοποίηση των φυσικών προστατευτικών μηχανισμών του γονιδιώματος, όπως είναι η de novo μεθυλίωση (στην περίπτωση που η επίδραση της ουσίας προκαλεί υπομεθυλίωση) ή η απομεθυλίωση του DNA, με πρώτο στάδιο το σχηματισμό της 5-hmdC (στην περίπτωση που η επίδραση της ουσίας προκαλεί υπερμεθυλίωση). Περαιτέρω διερεύνηση σε διαφορετικές περιοχές του γονιδιώματος, στις διάφορες ανατομικές περιοχές των οργάνων, καθώς και σε άλλους παράγοντες, όπως η 5-hmdC και οι DNMTs, θα μπορέσουν να απαντήσουν στα παραπάνω ερωτήματα

Worldwide legislative challenges related to psychoactive drugs

The discovery of a "new" psychoactive substance is a relatively exceptional event, while the regulatory response usually involved the assessment of risks to public health and inclusion of the novel substance in the national list of controlled substances. However, in recent years we have witnessed the rapid emergence of new chemical substances, which elude international control and pose a challenge to existing processes and a threat to the credibility of control systems. We currently review and present characteristics of these legal and illegal new substances and issues regarding their global monitoring and regulatory measures already taken, or in the process of being taken, for their control. The concept of prohibition applied in active substance-related legislation is rather hazard ridden as balance is required between the ban on substances of potential therapeutic use and the access on the market of high-risk substances

Monitoring the transition from cigarette smoking to vaping using exposure, biochemical, brain dynamics and psychometric markers: The SmokeFreeBrain Study

Introduction This project aims to monitor human volunteers as they switch from heavy (>10 cigarette/day) tobacco smoking to electronic cigarette (EC) use. Monitoring of markers will comprise expired carbon monoxide, DNA methylation, oxytocin, cortisol, nicotine cotinine and tobacco specific nitrosamine levels in urine and saliva together with psychometric data. In addition electroencephalography will be used to search for electrical changes in the brain correlated with changes in the above markers after transition to EC use. Methods Volunteers were recruited and consented at St George’s University of London. Volunteers were allowed to select their own EC and e-fluid including nicotine concentration. Blood, saliva, urine and buccal cell samples and questionnaire data (nicotine dependence, withdrawal, anxiety, depression, mood, quality of life and sleep quality) were collected at baseline (day-2 and day-1) and throughout the 28-day EC trial (days 3,21,28) and EEG data (eyes open-eyes fixed-eyes closed, each 3 x 30s) were collected at baseline (day-1) and on EC day 21. Nicotine, cotinine, NNK, NNAL and NNN were determined by UHPLC-HESI-HRMS, 5methyl cytosine by HPLC and oxytocin and cortisol by ELISA. Results Urinary and salivary nicotine, cotinine and tobacco specific nitrosamines and expired carbon monoxide decrease significantly following transition to EC. Behavioural data have revealed modest changes in nicotine craving, nicotine withdrawal symptoms, social anxiety and sleep quality following the transition to e-cigarettes. Preliminary comparison of regional spectral power extracted from EEG data collected pre- and post- transition to e-cigarettes use has identified significant changes in specific spectral bands across the brain. Conclusions Switching to EC quickly induces beneficial changes in exposure to toxicants and psychometrics. Changes in regional spectral power observed by EEG vary will be correlated to these other biomarkers. Funding This work is supported by H2020 funding from the European Union and by a PHE-funded PhD studentship

CYP polymorphisms and pathological conditions related to chronic exposure to organochlorine pesticides

The association between genetic variations in the cytochrome P450 (CYP) family genes and pathological conditions related to long-term exposure to organochlorine compounds (OCs) deserves further elucidation. OCs are persistent organic pollutants with bioaccumulative and lipophilic characteristics. They can act as endocrine disruptors and perturb cellular mechanisms. Prolonged exposure to OCs has been associated with different pathological manifestations. CYP genes are responsible for transcribing enzymes essential in xenobiotic metabolism. Therefore, polymorphisms in these genetic sequences a. alter the metabolic pathways, b. induce false cellular responses, and c. may provoke pathological conditions. The main aim of this review is to define the interaction between parameters a, b and c at a mechanistic/molecular level, with references in clinical cases. Keywords: Organochlorine compounds, Cytochrome P450, Genetic polymorphisms, Pathogenesis, Environmental pollutant