CHIP promotes Runx2 degradation and negatively regulates osteoblast differentiation

Runx2, an essential transactivator for osteoblast differentiation, is tightly regulated at both the transcriptional and posttranslational levels. In this paper, we report that CHIP (C terminus of Hsc70-interacting protein)/STUB1 regulates Runx2 protein stability via a ubiquitination-degradation mechanism. CHIP interacts with Runx2 in vitro and in vivo. In the presence of increased Runx2 protein levels, CHIP expression decreases, whereas the expression of other E3 ligases involved in Runx2 degradation, such as Smurf1 or WWP1, remains constant or increases during osteoblast differentiation. Depletion of CHIP results in the stabilization of Runx2, enhances Runx2-mediated transcriptional activation, and promotes osteoblast differentiation in primary calvarial cells. In contrast, CHIP overexpression in preosteoblasts causes Runx2 degradation, inhibits osteoblast differentiation, and instead enhances adipogenesis. Our data suggest that negative regulation of the Runx2 protein by CHIP is critical in the commitment of precursor cells to differentiate into the osteoblast lineage

Feedback regulation of the methylerythritol 4-phosphate (MEP) pathway

Els isoprenoides són una de les famílies més grans de metabòlits i tenen un gran interès en les indústries farmacèutiques, biocombustibles i agroalimentàries. Tots els isoprenoides deriven del difosfat d’isopentenil (IPP) i del seu isòmer de doble enllaç altament electròfil dimetilalil difosfat (DMAPP). L’IPP i el DMAPP es deriven de la via de l’àcid mevalònic (MVA) a les arquees i el citosol de les cèl·lules eucariotes, mentre que la majoria dels bacteris i els plastids de les cèl·lules vegetals produeixen IPP i DMAPP pel 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfat. via MEP). En comparació amb la via MVA, la via MEP té una capacitat teòrica més alta per produir precursors d’isoprenoides, la qual cosa ha estimulat una àmplia investigació per millorar encara més el flux de la via MEP per a la producció biotecnològica d’isoprenoides d’interès en biofàbriques microbianes i vegetals. Tanmateix, la regulació de retroalimentació del flux de la via MEP per IPP i DMAPP alenteix el flux de la via tan aviat com augmenten els nivells d’IPP i DMAPP. Es va informar que IPP/DMAPP va disminuir els nivells i l’activitat del primer enzim de la via MEP, la desoxi-D-xilulosa 5-fosfat (DXP) sintasa (DXS), però el mecanisme específic es desconeixia. D’altra banda, no es va explorar la possible inhibició d’altres enzims de la via MEP per IPP/DMAPP. L’objectiu principal d’aquesta tesi era abordar aquestes preguntes obertes utilitzant Escherichia coli i el tomàquet (Solanum lycopersicum) com a models bacterians i vegetals, respectivament. A diferència d’E. coli, que només té un únic gen que codifica DXS, tres gens codifiquen proteïnes semblants a DXS al tomàquet. A la primera part de la tesi vam determinar que les isoformes SlDXS1 i SlDXS2 són autèntics enzims DXS que es localitzen junts en plastids i poden formar heterodímers, mentre que SlDXS3 no té activitat DXS possiblement a causa de la unió deteriorada del cofactor tiamina difosfat (TPP). En el segon capítol de la tesi, demostrem que IPP i DMAPP inhibeixen al·lostèricament l’activitat dels enzims DXS bacterians (E.coli) i vegetals (tomàquet) EcDXS i SlDXS1 en unir-se directament lluny del lloc actiu de l’enzim. Es va trobar que la unió IPP i DMAPP promou la monomerització del dímer DXS actiu. Els monòmers DXS exposen dominis hidròfobs que d’altra manera estan ocults al dímer i poden provocar la seva agregació i la seva eventual degradació. Proposem que la monomerització de DXS podria ser una resposta relativament ràpida i reversible a nivells elevats d’IPP/DMAPP, mentre que l’agregació i eliminació de monòmers representarien una resposta lenta i irreversible quan persisteixi l’excés d’IPP/DMAPP. En el tercer i últim capítol de la tesi, investiguem el possible efecte de l’IPP i la DMAPP sobre l’activitat del següent enzim de la via MEP, la DXS reductoisomerasa (DXR), i un enzim semblant a DXR (DRL) que substitueix a DXR. en alguns bacteris. Hem trobat que IPP/DMAPP també inhibeix l’activitat DXR (però no DRL). De manera similar a la descrita per a DXS, la regulació de l’activitat de DXR per IPP/DMAPP pot tenir dues fases. La competència d’IPP/DMAPP amb el cofactor DXR NADPH cofactor per unir-se al lloc actiu de l’enzim definiria la primera fase, mentre que l’observació que DMAPP també pot inhibir al·lostèricament DXR per monomerització del dímer actiu podria representar una segona (lenta i no). fase -reversible). Aquests resultats ens ajuden a entendre la complexitat de la xarxa de regulació de retroalimentació que opera en diversos passos de la via MEP i representen una base sòlida per millorar el flux de la via MEP.Los isoprenoides son una de las familias más grandes de metabolitos y tienen un gran interés en las industrias farmacéutica, de biocombustibles y agroalimentaria. Todos los isoprenoides derivan del difosfato de isopentenilo (IPP) y su isómero de doble enlace altamente electrofílico difosfato de dimetilalilo (DMAPP). IPP y DMAPP se derivan de la vía del ácido mevalónico (MVA) en las arqueas y el citosol de las células eucariotas, mientras que la mayoría de las bacterias y los plástidos de las células vegetales producen IPP y DMAPP por el 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfato ( vía MEP). En comparación con la vía MVA, la vía MEP tiene una mayor capacidad teórica para producir precursores de isoprenoides, lo que ha estimulado una amplia investigación para mejorar aún más el flujo de la vía MEP para la producción biotecnológica de isoprenoides de interés en biofactorías microbianas y vegetales. Sin embargo, la regulación de retroalimentación del flujo de la ruta MEP por parte de IPP y DMAPP ralentiza el flujo de la ruta tan pronto como aumentan los niveles de IPP y DMAPP. Se informó que IPP/DMAPP disminuye los niveles y la actividad de la primera enzima de la vía MEP, la desoxi-D-xilulosa 5-fosfato (DXP) sintasa (DXS), pero se desconoce el mecanismo específico. Por otro lado, no se exploró la posible inhibición de otras enzimas de la vía MEP por IPP/DMAPP. El principal objetivo de esta tesis fue abordar estas cuestiones abiertas utilizando Escherichia coli y tomate (Solanum lycopersicum) como modelos bacteriano y vegetal, respectivamente. A diferencia de E. coli, que solo tiene un gen que codifica DXS, tres genes codifican proteínas similares a DXS en el tomate. En la primera parte de la tesis, determinamos que las isoformas SlDXS1 y SlDXS2 son verdaderas enzimas DXS que se localizan juntas en plástidos y pueden formar heterodímeros, mientras que SlDXS3 carece de actividad DXS posiblemente debido a la unión alterada del cofactor tiamina difosfato (TPP). En el segundo capítulo de la tesis, demostramos que IPP y DMAPP inhiben alostéricamente la actividad de las enzimas DXS bacterianas (E.coli) y vegetales (tomate) EcDXS y SlDXS1 al unirse directamente desde el sitio activo de la enzima. Se descubrió que la unión de IPP y DMAPP promueve la monomerización del dímero DXS activo. Los monómeros DXS exponen dominios hidrofóbicos que de otro modo estarían ocultos en el dímero y pueden provocar su agregación y degradación eventual. Proponemos que la monomerización de DXS podría ser una respuesta relativamente rápida y reversible a niveles altos de IPP/DMAPP, mientras que la agregación y eliminación de monómeros representaría una respuesta lenta e irreversible cuando persiste un exceso de IPP/DMAPP. En la tercera y última parte del capítulo de la tesis, investigamos el posible efecto de IPP y DMAPP en la actividad de la siguiente enzima de la vía MEP, la DXS reductoisomerasa (DXR), y una enzima similar a DXR (DRL) que reemplaza a DXR. en algunas bacterias. Encontramos que IPP/DMAPP también inhibe la actividad DXR (pero no DRL). Similar a lo descrito para DXS, la regulación de la actividad DXR por IPP/DMAPP podría tener dos fases. La competencia de IPP/DMAPP con el cofactor NADPH del cofactor DXR por unirse al sitio activo de la enzima definiría la primera fase, mientras que la observación de que DMAPP también puede inhibir alostéricamente DXR mediante la monomerización del dímero activo podría representar una segunda (lenta y no -reversible) fase. Estos resultados nos ayudan a comprender la complejidad de la red de regulación de retroalimentación que opera en varios pasos de la ruta MEP y representan una base sólida para mejorar eventualmente el flujo de la ruta MEP.Isoprenoids are one of the largest families of metabolites and they have a huge interest in the pharma, biofuel and agrofood industries. All isoprenoids derive from isopentenyl diphosphate (IPP) and its highly electrophilic double-bond isomer dimethylallyl diphosphate (DMAPP). IPP and DMAPP are derived from the mevalonic acid (MVA) pathway in archaea and the cytosol of eukaryotic cells, whereas most bacteria and the plastids of plant cells produce IPP and DMAPP by the 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate (MEP) pathway. Compared with the MVA pathway, the MEP pathway has a higher theoretical capacity to produce isoprenoid precursors, which has stimulated extensive research on further improving MEP pathway flux for the biotechnological production of isoprenoids of interest in microbial and plant biofactories. However, feedback regulation of the MEP pathway flux by IPP and DMAPP slows down the pathway flux as soon as IPP and DMAPP levels increase. IPP/DMAPP were reported to decrease the levels and activity of the first enzyme of the MEP pathway, deoxy-D-xylulose 5-phosphate (DXP) synthase (DXS), but the specific mechanism was unknown. On the other hand, the possible inhibition of other MEP pathway enzymes by IPP/DMAPP was unexplored. The main objective of this thesis was to address these open questions using Escherichia coli and tomato (Solanum lycopersicum) as bacterial and plant models, respectively. Unlike E. coli, which only has a single DXS-encoding gene, three genes encode DXS-like proteins in tomato. In the first part of the thesis we determined that isoforms SlDXS1 and SlDXS2 are true DXS enzymes that localize together in plastids and can form heterodimers whereas SlDXS3 lacks DXS activity possibly due to impaired binding of the cofactor thiamine diphosphate (TPP). In the second chapter of the thesis, we demonstrate that IPP and DMAPP allosterically inhibit the activity of bacterial (E.coli) and plant (tomato) DXS enzymes EcDXS and SlDXS1 by directly binding away from the active site of the enzyme. IPP and DMAPP binding was found to promote monomerization of the active DXS dimer. DXS monomers expose hydrophobic domains that are otherwise hidden in the dimer and can cause their aggregation and eventual degradation. We propose that DXS monomerization might be a relatively fast and reversible response to high IPP/DMAPP levels, whereas monomer aggregation and removal would represent a slow and irreversible response when excess IPP/DMAPP persists. In the third and last chapter part of the thesis, we investigate the possible effect of IPP and DMAPP on the activity of the next enzyme of the MEP pathway, DXS reductoisomerase (DXR), and a DXR-like (DRL) enzyme that replaces DXR in some bacteria. We found that IPP/DMAPP also feedback inhibit DXR activity (but not DRL). Similar to that described for DXS, regulation of DXR activity by IPP/DMAPP might have two phases. Competition of IPP/DMAPP with the DXR cofactor NADPH cofactor for binding to the active site of the enzyme would define the first phase, whereas the observation that DMAPP may also allosterically inhibit DXR by monomerization of the active dimer might represent a second (slow and non-reversible) phase. These results help us to understand the complexity of the feedback regulation network that operates at several steps of the MEP pathway and represent a solid foundation to eventually improve MEP pathway flux.Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Biologia i Biotecnologia Vegeta

Feedback regulation of the methylerythritol 4-phosphate (MEP) pathway

Tesis presentada el día 14 de noviembre de 2022 para la obtención del título de doctor en Biología y Biotecnologia Vegetal por la Universidad Autónoma de Barcelona.[EN] Isoprenoids are one of the largest families of metabolites and they have a huge interest in the pharma, biofuel and agrofood industries. All isoprenoids derive from isopentenyl diphosphate (IPP) and its highly electrophilic double-bond isomer dimethylallyl diphosphate (DMAPP). IPP and DMAPP are derived from the mevalonic acid (MVA) pathway in archaea and the cytosol of eukaryotic cells, whereas most bacteria and the plastids of plant cells produce IPP and DMAPP by the 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate (MEP) pathway. Compared with the MVA pathway, the MEP pathway has a higher theoretical capacity to produce isoprenoid precursors, which has stimulated extensive research on further improving MEP pathway flux for the biotechnological production of isoprenoids of interest in microbial and plant biofactories. However, feedback regulation of the MEP pathway flux by IPP and DMAPP slows down the pathway flux as soon as IPP and DMAPP levels increase. IPP/DMAPP were reported to decrease the levels and activity of the first enzyme of the MEP pathway, deoxy-D-xylulose 5-phosphate (DXP) synthase (DXS), but the specific mechanism was unknown. On the other hand, the possible inhibition of other MEP pathway enzymes by IPP/DMAPP was unexplored. The main objective of this thesis was to address these open questions using Escherichia coli and tomato (Solanum lycopersicum) as bacterial and plant models, respectively. Unlike E. coli, which only has a single DXS-encoding gene, three genes encode DXS-like proteins in tomato. In the first part of the thesis we determined that isoforms SlDXS1 and SlDXS2 are true DXS enzymes that localize together in plastids and can form heterodimers whereas SlDXS3 lacks DXS activity possibly due to impaired binding of the cofactor thiamine diphosphate (TPP). In the second chapter of the thesis, we demonstrate that IPP and DMAPP allosterically inhibit the activity of bacterial (E. coli) and plant (tomato) DXS enzymes EcDXS and SlDXS1 by directly binding away from the active site of the enzyme. IPP and DMAPP binding was found to promote monomerization of the active DXS dimer. DXS monomers expose hydrophobic domains that are otherwise hidden in the dimer and can cause their aggregation and eventual degradation. We propose that DXS monomerization might be a relatively fast and reversible response to high IPP/DMAPP levels, whereas monomer aggregation and removal would represent a slow and irreversible response when excess IPP/DMAPP persists. In the third and last chapter part of the thesis, we investigate the possible effect of IPP and DMAPP on the activity of the next enzyme of the MEP pathway, DXS reductoisomerase (DXR), and a DXR-like (DRL) enzyme that replaces DXR in some bacteria. We found that IPP/DMAPP also feedback inhibit DXR activity (but not DRL). Similar to that described for DXS, regulation of DXR activity by IPP/DMAPP might have two phases. Competition of IPP/DMAPP with the DXR cofactor NADPH cofactor for binding to the active site of the enzyme would define the first phase, whereas the observation that DMAPP may also allosterically inhibit DXR by monomerization of the active dimer might represent a second (slow and non-reversible) phase. These results help us to understand the complexity of the feedback regulation network that operates at several steps of the MEP pathway and represent a solid foundation to eventually improve MEP pathway flux.[ES] Los isoprenoides son una de las familias más grandes de metabolitos y tienen un gran interés en las industrias farmacéutica, de biocombustibles y agroalimentaria. Todos los isoprenoides derivan del difosfato de isopentenilo (IPP) y su isómero de doble enlace altamente electrofílico difosfato de dimetilalilo (DMAPP). IPP y DMAPP se derivan de la vía del ácido mevalónico (MVA) en las arqueas y el citosol de las células eucariotas, mientras que la mayoría de las bacterias y los plástidos de las células vegetales producen IPP y DMAPP por el 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfato ( vía MEP). En comparación con la vía MVA, la vía MEP tiene una mayor capacidad teórica para producir precursores de isoprenoides, lo que ha estimulado una amplia investigación para mejorar aún más el flujo de la vía MEP para la producción biotecnológica de isoprenoides de interés en biofactorías microbianas y vegetales. Sin embargo, la regulación de retroalimentación del flujo de la ruta MEP por parte de IPP y DMAPP ralentiza el flujo de la ruta tan pronto como aumentan los niveles de IPP y DMAPP. Se informó que IPP/DMAPP disminuye los niveles y la actividad de la primera enzima de la vía MEP, la desoxi-D-xilulosa 5-fosfato (DXP) sintasa (DXS), pero se desconoce el mecanismo específico. Por otro lado, no se exploró la posible inhibición de otras enzimas de la vía MEP por IPP/DMAPP. El principal objetivo de esta tesis fue abordar estas cuestiones abiertas utilizando Escherichia coli y tomate (Solanum lycopersicum) como modelos bacteriano y vegetal, respectivamente. A diferencia de E. coli, que solo tiene un gen que codifica DXS, tres genes codifican proteínas similares a DXS en el tomate. En la primera parte de la tesis, determinamos que las isoformas SlDXS1 y SlDXS2 son verdaderas enzimas DXS que se localizan juntas en plástidos y pueden formar heterodímeros, mientras que SlDXS3 carece de actividad DXS posiblemente debido a la unión alterada del cofactor tiamina difosfato (TPP). En el segundo capítulo de la tesis, demostramos que IPP y DMAPP inhiben alostéricamente la actividad de las enzimas DXS bacterianas (E. coli) y vegetales (tomate) EcDXS y SlDXS1 al unirse directamente desde el sitio activo de la enzima. Se descubrió que la unión de IPP y DMAPP promueve la monomerización del dímero DXS activo. Los monómeros DXS exponen dominios hidrofóbicos que de otro modo estarían ocultos en el dímero y pueden provocar su agregación y degradación eventual. Proponemos que la monomerización de DXS podría ser una respuesta relativamente rápida y reversible a niveles altos de IPP/DMAPP, mientras que la agregación y eliminación de monómeros representaría una respuesta lenta e irreversible cuando persiste un exceso de IPP/DMAPP. En la tercera y última parte del capítulo de la tesis, investigamos el posible efecto de IPP y DMAPP en la actividad de la siguiente enzima de la vía MEP, la DXS reductoisomerasa (DXR), y una enzima similar a DXR (DRL) que reemplaza a DXR. en algunas bacterias. Encontramos que IPP/DMAPP también inhibe la actividad DXR (pero no DRL). Similar a lo descrito para DXS, la regulación de la actividad DXR por IPP/DMAPP podría tener dos fases. La competencia de IPP/DMAPP con el cofactor NADPH del cofactor DXR por unirse al sitio activo de la enzima definiría la primera fase, mientras que la observación de que DMAPP también puede inhibir alostéricamente DXR mediante la monomerización del dímero activo podría representar una segunda (lenta y no -reversible) fase. Estos resultados nos ayudan a comprender la complejidad de la red de regulación de retroalimentación que opera en varios pasos de la ruta MEP y representan una base sólida para mejorar eventualmente el flujo de la ruta MEP.[CA] Els isoprenoides són una de les famílies més grans de metabòlits i tenen un gran interès en les indústries farmacèutiques, biocombustibles i agroalimentàries. Tots els isoprenoides deriven del difosfat d'isopentenil (IPP) i del seu isòmer de doble enllaç altament electròfil dimetilalil difosfat (DMAPP). L'IPP i el DMAPP es deriven de la via de l'àcid mevalònic (MVA) a les arquees i el citosol de les cèl·lules eucariotes, mentre que la majoria dels bacteris i els plastids de les cèl·lules vegetals produeixen IPP i DMAPP pel 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfat. via MEP). En comparació amb la via MVA, la via MEP té una capacitat teòrica més alta per produir precursors d'isoprenoides, la qual cosa ha estimulat una àmplia investigació per millorar encara més el flux de la via MEP per a la producció biotecnològica d'isoprenoides d'interès en biofàbriques microbianes i vegetals. Tanmateix, la regulació de retroalimentació del flux de la via MEP per IPP i DMAPP alenteix el flux de la via tan aviat com augmenten els nivells d'IPP i DMAPP. Es va informar que IPP/DMAPP va disminuir els nivells i l'activitat del primer enzim de la via MEP, la desoxi-D-xilulosa 5-fosfat (DXP) sintasa (DXS), però el mecanisme específic es desconeixia. D'altra banda, no es va explorar la possible inhibició d'altres enzims de la via MEP per IPP/DMAPP. L'objectiu principal d'aquesta tesi era abordar aquestes preguntes obertes utilitzant Escherichia coli i el tomàquet (Solanum lycopersicum) com a models bacterians i vegetals, respectivament. A diferència d'E. coli, que només té un únic gen que codifica DXS, tres gens codifiquen proteïnes semblants a DXS al tomàquet. A la primera part de la tesi vam determinar que les isoformes SlDXS1 i SlDXS2 són autèntics enzims DXS que es localitzen junts en plastids i poden formar heterodímers, mentre que SlDXS3 no té activitat DXS possiblement a causa de la unió deteriorada del cofactor tiamina difosfat (TPP). En el segon capítol de la tesi, demostrem que IPP i DMAPP inhibeixen al·lostèricament l'activitat dels enzims DXS bacterians (E. coli) i vegetals (tomàquet) EcDXS i SlDXS1 en unir-se directament lluny del lloc actiu de l'enzim. Es va trobar que la unió IPP i DMAPP promou la monomerització del dímer DXS actiu. Els monòmers DXS exposen dominis hidròfobs que d'altra manera estan ocults al dímer i poden provocar la seva agregació i la seva eventual degradació. Proposem que la monomerització de DXS podria ser una resposta relativament ràpida i reversible a nivells elevats d'IPP/DMAPP, mentre que l'agregació i eliminació de monòmers representarien una resposta lenta i irreversible quan persisteixi l'excés d'IPP/DMAPP. En el tercer i últim capítol de la tesi, investiguem el possible efecte de l'IPP i la DMAPP sobre l'activitat del següent enzim de la via MEP, la DXS reductoisomerasa (DXR), i un enzim semblant a DXR (DRL) que substitueix a DXR. en alguns bacteris. Hem trobat que IPP/DMAPP també inhibeix l'activitat DXR (però no DRL). De manera similar a la descrita per a DXS, la regulació de l'activitat de DXR per IPP/DMAPP pot tenir dues fases. La competència d'IPP/DMAPP amb el cofactor DXR NADPH cofactor per unir-se al lloc actiu de l'enzim definiria la primera fase, mentre que l'observació que DMAPP també pot inhibir al·lostèricament DXR per monomerització del dímer actiu podria representar una segona (lenta i no). fase -reversible). Aquests resultats ens ajuden a entendre la complexitat de la xarxa de regulació de retroalimentació que opera en diversos passos de la via MEP i representen una base sòlida per millorar el flux de la via MEP

Feedback regulation of the methylerythritol 4-phosphate (MEP) pathway

Els isoprenoides són una de les famílies més grans de metabòlits i tenen un gran interès en les indústries farmacèutiques, biocombustibles i agroalimentàries. Tots els isoprenoides deriven del difosfat d'isopentenil (IPP) i del seu isòmer de doble enllaç altament electròfil dimetilalil difosfat (DMAPP). L'IPP i el DMAPP es deriven de la via de l'àcid mevalònic (MVA) a les arquees i el citosol de les cèl·lules eucariotes, mentre que la majoria dels bacteris i els plastids de les cèl·lules vegetals produeixen IPP i DMAPP pel 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfat. via MEP). En comparació amb la via MVA, la via MEP té una capacitat teòrica més alta per produir precursors d'isoprenoides, la qual cosa ha estimulat una àmplia investigació per millorar encara més el flux de la via MEP per a la producció biotecnològica d'isoprenoides d'interès en biofàbriques microbianes i vegetals. Tanmateix, la regulació de retroalimentació del flux de la via MEP per IPP i DMAPP alenteix el flux de la via tan aviat com augmenten els nivells d'IPP i DMAPP. Es va informar que IPP/DMAPP va disminuir els nivells i l'activitat del primer enzim de la via MEP, la desoxi-D-xilulosa 5-fosfat (DXP) sintasa (DXS), però el mecanisme específic es desconeixia. D'altra banda, no es va explorar la possible inhibició d'altres enzims de la via MEP per IPP/DMAPP. L'objectiu principal d'aquesta tesi era abordar aquestes preguntes obertes utilitzant Escherichia coli i el tomàquet (Solanum lycopersicum) com a models bacterians i vegetals, respectivament. A diferència d'E. coli, que només té un únic gen que codifica DXS, tres gens codifiquen proteïnes semblants a DXS al tomàquet. A la primera part de la tesi vam determinar que les isoformes SlDXS1 i SlDXS2 són autèntics enzims DXS que es localitzen junts en plastids i poden formar heterodímers, mentre que SlDXS3 no té activitat DXS possiblement a causa de la unió deteriorada del cofactor tiamina difosfat (TPP). En el segon capítol de la tesi, demostrem que IPP i DMAPP inhibeixen al·lostèricament l'activitat dels enzims DXS bacterians (E.coli) i vegetals (tomàquet) EcDXS i SlDXS1 en unir-se directament lluny del lloc actiu de l'enzim. Es va trobar que la unió IPP i DMAPP promou la monomerització del dímer DXS actiu. Els monòmers DXS exposen dominis hidròfobs que d'altra manera estan ocults al dímer i poden provocar la seva agregació i la seva eventual degradació. Proposem que la monomerització de DXS podria ser una resposta relativament ràpida i reversible a nivells elevats d'IPP/DMAPP, mentre que l'agregació i eliminació de monòmers representarien una resposta lenta i irreversible quan persisteixi l'excés d'IPP/DMAPP. En el tercer i últim capítol de la tesi, investiguem el possible efecte de l'IPP i la DMAPP sobre l'activitat del següent enzim de la via MEP, la DXS reductoisomerasa (DXR), i un enzim semblant a DXR (DRL) que substitueix a DXR. en alguns bacteris. Hem trobat que IPP/DMAPP també inhibeix l'activitat DXR (però no DRL). De manera similar a la descrita per a DXS, la regulació de l'activitat de DXR per IPP/DMAPP pot tenir dues fases. La competència d'IPP/DMAPP amb el cofactor DXR NADPH cofactor per unir-se al lloc actiu de l'enzim definiria la primera fase, mentre que l'observació que DMAPP també pot inhibir al·lostèricament DXR per monomerització del dímer actiu podria representar una segona (lenta i no). fase -reversible). Aquests resultats ens ajuden a entendre la complexitat de la xarxa de regulació de retroalimentació que opera en diversos passos de la via MEP i representen una base sòlida per millorar el flux de la via MEP.Los isoprenoides son una de las familias más grandes de metabolitos y tienen un gran interés en las industrias farmacéutica, de biocombustibles y agroalimentaria. Todos los isoprenoides derivan del difosfato de isopentenilo (IPP) y su isómero de doble enlace altamente electrofílico difosfato de dimetilalilo (DMAPP). IPP y DMAPP se derivan de la vía del ácido mevalónico (MVA) en las arqueas y el citosol de las células eucariotas, mientras que la mayoría de las bacterias y los plástidos de las células vegetales producen IPP y DMAPP por el 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfato ( vía MEP). En comparación con la vía MVA, la vía MEP tiene una mayor capacidad teórica para producir precursores de isoprenoides, lo que ha estimulado una amplia investigación para mejorar aún más el flujo de la vía MEP para la producción biotecnológica de isoprenoides de interés en biofactorías microbianas y vegetales. Sin embargo, la regulación de retroalimentación del flujo de la ruta MEP por parte de IPP y DMAPP ralentiza el flujo de la ruta tan pronto como aumentan los niveles de IPP y DMAPP. Se informó que IPP/DMAPP disminuye los niveles y la actividad de la primera enzima de la vía MEP, la desoxi-D-xilulosa 5-fosfato (DXP) sintasa (DXS), pero se desconoce el mecanismo específico. Por otro lado, no se exploró la posible inhibición de otras enzimas de la vía MEP por IPP/DMAPP. El principal objetivo de esta tesis fue abordar estas cuestiones abiertas utilizando Escherichia coli y tomate (Solanum lycopersicum) como modelos bacteriano y vegetal, respectivamente. A diferencia de E. coli, que solo tiene un gen que codifica DXS, tres genes codifican proteínas similares a DXS en el tomate. En la primera parte de la tesis, determinamos que las isoformas SlDXS1 y SlDXS2 son verdaderas enzimas DXS que se localizan juntas en plástidos y pueden formar heterodímeros, mientras que SlDXS3 carece de actividad DXS posiblemente debido a la unión alterada del cofactor tiamina difosfato (TPP). En el segundo capítulo de la tesis, demostramos que IPP y DMAPP inhiben alostéricamente la actividad de las enzimas DXS bacterianas (E.coli) y vegetales (tomate) EcDXS y SlDXS1 al unirse directamente desde el sitio activo de la enzima. Se descubrió que la unión de IPP y DMAPP promueve la monomerización del dímero DXS activo. Los monómeros DXS exponen dominios hidrofóbicos que de otro modo estarían ocultos en el dímero y pueden provocar su agregación y degradación eventual. Proponemos que la monomerización de DXS podría ser una respuesta relativamente rápida y reversible a niveles altos de IPP/DMAPP, mientras que la agregación y eliminación de monómeros representaría una respuesta lenta e irreversible cuando persiste un exceso de IPP/DMAPP. En la tercera y última parte del capítulo de la tesis, investigamos el posible efecto de IPP y DMAPP en la actividad de la siguiente enzima de la vía MEP, la DXS reductoisomerasa (DXR), y una enzima similar a DXR (DRL) que reemplaza a DXR. en algunas bacterias. Encontramos que IPP/DMAPP también inhibe la actividad DXR (pero no DRL). Similar a lo descrito para DXS, la regulación de la actividad DXR por IPP/DMAPP podría tener dos fases. La competencia de IPP/DMAPP con el cofactor NADPH del cofactor DXR por unirse al sitio activo de la enzima definiría la primera fase, mientras que la observación de que DMAPP también puede inhibir alostéricamente DXR mediante la monomerización del dímero activo podría representar una segunda (lenta y no -reversible) fase. Estos resultados nos ayudan a comprender la complejidad de la red de regulación de retroalimentación que opera en varios pasos de la ruta MEP y representan una base sólida para mejorar eventualmente el flujo de la ruta MEP.Isoprenoids are one of the largest families of metabolites and they have a huge interest in the pharma, biofuel and agrofood industries. All isoprenoids derive from isopentenyl diphosphate (IPP) and its highly electrophilic double-bond isomer dimethylallyl diphosphate (DMAPP). IPP and DMAPP are derived from the mevalonic acid (MVA) pathway in archaea and the cytosol of eukaryotic cells, whereas most bacteria and the plastids of plant cells produce IPP and DMAPP by the 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate (MEP) pathway. Compared with the MVA pathway, the MEP pathway has a higher theoretical capacity to produce isoprenoid precursors, which has stimulated extensive research on further improving MEP pathway flux for the biotechnological production of isoprenoids of interest in microbial and plant biofactories. However, feedback regulation of the MEP pathway flux by IPP and DMAPP slows down the pathway flux as soon as IPP and DMAPP levels increase. IPP/DMAPP were reported to decrease the levels and activity of the first enzyme of the MEP pathway, deoxy-D-xylulose 5-phosphate (DXP) synthase (DXS), but the specific mechanism was unknown. On the other hand, the possible inhibition of other MEP pathway enzymes by IPP/DMAPP was unexplored. The main objective of this thesis was to address these open questions using Escherichia coli and tomato (Solanum lycopersicum) as bacterial and plant models, respectively. Unlike E. coli, which only has a single DXS-encoding gene, three genes encode DXS-like proteins in tomato. In the first part of the thesis we determined that isoforms SlDXS1 and SlDXS2 are true DXS enzymes that localize together in plastids and can form heterodimers whereas SlDXS3 lacks DXS activity possibly due to impaired binding of the cofactor thiamine diphosphate (TPP). In the second chapter of the thesis, we demonstrate that IPP and DMAPP allosterically inhibit the activity of bacterial (E.coli) and plant (tomato) DXS enzymes EcDXS and SlDXS1 by directly binding away from the active site of the enzyme. IPP and DMAPP binding was found to promote monomerization of the active DXS dimer. DXS monomers expose hydrophobic domains that are otherwise hidden in the dimer and can cause their aggregation and eventual degradation. We propose that DXS monomerization might be a relatively fast and reversible response to high IPP/DMAPP levels, whereas monomer aggregation and removal would represent a slow and irreversible response when excess IPP/DMAPP persists. In the third and last chapter part of the thesis, we investigate the possible effect of IPP and DMAPP on the activity of the next enzyme of the MEP pathway, DXS reductoisomerase (DXR), and a DXR-like (DRL) enzyme that replaces DXR in some bacteria. We found that IPP/DMAPP also feedback inhibit DXR activity (but not DRL). Similar to that described for DXS, regulation of DXR activity by IPP/DMAPP might have two phases. Competition of IPP/DMAPP with the DXR cofactor NADPH cofactor for binding to the active site of the enzyme would define the first phase, whereas the observation that DMAPP may also allosterically inhibit DXR by monomerization of the active dimer might represent a second (slow and non-reversible) phase. These results help us to understand the complexity of the feedback regulation network that operates at several steps of the MEP pathway and represent a solid foundation to eventually improve MEP pathway flux

Exploring the Deoxy-D-xylulose-5-phosphate Synthase Gene Family in Tomato (Solanum lycopersicum)

Isoprenoids are a wide family of metabolites including high-value chemicals, flavors, pigments, and drugs. Isoprenoids are particularly abundant and diverse in plants. The methyl-D-erythritol 4-phosphate (MEP) pathway produces the universal isoprenoid precursors isopentenyl diphosphate and dimethylallyl diphosphate in plant plastids for the downstream production of monoterpenes, diterpenes, and photosynthesis-related isoprenoids such as carotenoids, chlorophylls, tocopherols, phylloquinone, and plastoquinone. The enzyme deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase (DXS) is the first and main rate-determining enzyme of the MEP pathway. In tomato (Solanum lycopersicum), a plant with an active isoprenoid metabolism in several tissues, three genes encode DXS-like proteins (SlDXS1 to 3). Here, we show that the expression patterns of the three genes suggest distinct physiological roles without excluding that they might function together in some tissues. We also confirm that SlDXS1 and 2 are true DXS enzymes, whereas SlDXS3 lacks DXS activity. We further show that SlDXS1 and 2 co-localize in plastidial speckles and that they can be immunoprecipitated together, suggesting that they might form heterodimers in vivo in at least some tissues. These results provide novel insights for the biotechnological use of DXS isoforms in metabolic engineering strategies to up-regulate the MEP pathway flux

Exploring feedback regulation of the tomato DXS family

Trabajo presentado a la II Reunión Nacional sobre Carotenoides en Microorganismos, Plantas, Alimentación y Salud, celebrada en la Estación Experimental del Zaidín (EEZ-CSIC), Granada (España) del 7 al 8 de Noviembre de 2019

MEP pathway products allosterically promote monomerization of deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase to feedback-regulate their supply

Isoprenoids are a very large and diverse family of metabolites required by all living organisms. All isoprenoids derive from the double-bond isomers isopentenyl diphosphate (IPP) and dimethylallyl diphosphate (DMAPP), which are produced by the methylerythritol 4-phosphate (MEP) pathway in bacteria and plant plastids. It has been reported that IPP and DMAPP feedback-regulate the activity of deoxyxylulose 5-phosphate synthase (DXS), a dimeric enzyme that catalyzes the main flux-controlling step of the MEP pathway. Here we provide experimental insights into the underlying mechanism. Isothermal titration calorimetry and dynamic light scattering approaches showed that IPP and DMAPP can allosterically bind to DXS in vitro, causing a size shift. In silico ligand binding site analysis and docking calculations identified a potential allosteric site in the contact region between the two monomers of the active DXS dimer. Modulation of IPP and DMAPP contents in vivo followed by immunoblot analyses confirmed that high IPP/DMAPP levels resulted in monomerization and eventual aggregation of the enzyme in bacterial and plant cells. Loss of the enzymatically active dimeric conformation allows a fast and reversible reduction of DXS activity in response to a sudden increase or decrease in IPP/DMAPP supply, whereas aggregation and subsequent removal of monomers that would otherwise be available for dimerization appears to be a more drastic response in the case of persistent IPP/DMAPP overabundance (e.g., by a blockage in their conversion to downstream isoprenoids). Our results represent an important step toward understanding the regulation of the MEP pathway and rational design of biotechnological endeavors aimed at increasing isoprenoid contents in microbial and plant systems. The MEP pathway synthesizes the universal precursors of isoprenoids in plant plastids and most bacteria. This study shows that these precursors feedback-regulate their own production by direct allosteric binding to the first enzyme of the pathway, a dimeric enzyme that becomes monomeric and eventually aggregates when levels of MEP pathway products increase

MEP pathway products allosterically promote monomerization of deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase to feedback-regulate their supply

Isoprenoids are a very large and diverse family of metabolites required by all living organisms. All isoprenoids derive from the double-bond isomers isopentenyl diphosphate (IPP) and dimethylallyl diphosphate (DMAPP), which are produced by the methylerythritol 4-phosphate (MEP) pathway in bacteria and plant plastids. It has been reported that IPP and DMAPP feedback-regulate the activity of deoxyxylulose 5-phosphate synthase (DXS), a dimeric enzyme that catalyzes the main flux-controlling step of the MEP pathway. Here we provide experimental insights into the underlying mechanism. Isothermal titration calorimetry and dynamic light scattering approaches showed that IPP and DMAPP can allosterically bind to DXS in vitro, causing a size shift. In silico ligand binding site analysis and docking calculations identified a potential allosteric site in the contact region between the two monomers of the active DXS dimer. Modulation of IPP and DMAPP contents in vivo followed by immunoblot analyses confirmed that high IPP/DMAPP levels resulted in monomerization and eventual aggregation of the enzyme in bacterial and plant cells. Loss of the enzymatically active dimeric conformation allows a fast and reversible reduction of DXS activity in response to a sudden increase or decrease in IPP/DMAPP supply, whereas aggregation and subsequent removal of monomers that would otherwise be available for dimerization appears to be a more drastic response in the case of persistent IPP/DMAPP overabundance (e.g., by a blockage in their conversion to downstream isoprenoids). Our results represent an important step toward understanding the regulation of the MEP pathway and rational design of biotechnological endeavors aimed at increasing isoprenoid contents in microbial and plant systems

(A) Overexpression of CHIP inhibits Runx2-induced transcriptional activity

Luciferase assays were performed using NIH3T3 or COS7 cells transfected with the indicated expression vectors along with a Runx2-responsive reporter construct, 6xOSE2-OC/pGL3 and pRL-TK (internal control). Values were normalized using the internal control and presented relative to basal activity (NIH3T3, first bar; COS7, fifth bar) with the mean from three independent repeats. (B) Mutants of CHIP fail to inhibit Runx2-induced transcriptional activity. CHIP, CHIP mutants, and Flag-Smurf1 were compared for the inhibitory effect on Runx2 activity in NIH3T3 cells. (C) Knocking down CHIP by siRNA facilitates Runx2-mediated transcription in UMR106 cells. Luciferase assays were performed in UMR106 cells transfected with Runx2 in the presence of CHIP, EGFP RNAi, or CHIP RNAi. (D) CHIP did not affect the transcriptional activity of STAT3. NIH3T3 cells transfected with STAT3 in the presence or absence of CHIP along with pGL3–acute phase response element and treated with 10 ng/ml interleukin-6. All of the data are presented as mean with SEM (error bars) from three independent experiments. The same letter represents a significant difference within this group in a meaningful comparison (P < 0.05).<p><b>Copyright information:</b></p><p>Taken from "CHIP promotes Runx2 degradation and negatively regulates osteoblast differentiation"</p><p></p><p>The Journal of Cell Biology 2008;181(6):959-972.</p><p>Published online 16 Jun 2008</p><p>PMCID:PMC2426947.</p><p></p