Kinetics of CheY phosphorylation by small molecule phosphodonors

AbstractThe chemotaxis response regulator CheY can acquire phosphoryl groups either from its associated autophosphorylating protein kinase, CheA, or from small phosphodonor molecules such as acetyl phosphate. We report a stopped-flow kinetic analysis of CheY phosphorylation by acetyl phosphate. The results show that CheY has a very low affinity for this phosphodonor (Ks≫0.1 M), consistent with the conclusion that, whereas CheY provides catalytic functions for the phosphotransfer reaction, the CheA kinase may act simply to increase the effective phosphodonor concentration at the CheY active site

Enantioselectivity of human AMP, dTMP and UMP-CMP kinases

l-Nucleoside analogues such as lamivudine are active for treating viral infections. Like d-nucleosides, the biological activity of the l-enantiomers requires their stepwise phosphorylation by cellular or viral kinases to give the triphosphate. The enantioselectivity of NMP kinases has not been thoroughly studied, unlike that of deoxyribonucleoside kinases. We have therefore investigated the capacity of l-enantiomers of some natural (d)NMP to act as substrates for the recombinant forms of human uridylate-cytidylate kinase, thymidylate kinase and adenylate kinases 1 and 2. Both cytosolic and mitochondrial adenylate kinases were strictly enantioselective, as they phosphorylated only d-(d)AMP. l-dTMP was a substrate for thymidylate kinase, but with an efficiency 150-fold less than d-dTMP. Both l-dUMP and l-(d)CMP were phosphorylated by UMP-CMP kinase although much less efficiently than their natural counterparts. The stereopreference was conserved with the 2′-azido derivatives of dUMP and dUMP while, unexpectedly, the 2′-azido-d-dCMP was a 4-fold better substrate for UMP-CMP kinase than was CMP. Docking simulations showed that the small differences in the binding of d-(d)NMP to their respective kinases could account for the differences in interactions of the l-isomers with the enzymes. This in vitro information was then used to develop the in vivo activation pathway for l-dT

Conformational study of an artificial metal-dependent regulation site for use in designer proteins

This report describes the dimerisation of glutathione, and by extension, other cysteine-containing peptides or protein fragments, with a 5, 5’-disubstituted-2, 2’-bipyridine or 6, 6”-disubstituted-2, 2’:6’,2”-terpyridine unit. The resulting bipy-GS(2) and terpy-GS(2) were investigated as potential metal ion dependent switches in aqueous solution, and were found to predominantly adopt the transoïd conformation at physiological pH. Metal complexation with Cu(II) and Zn(II) at this pH has been studied by UV/Vis, CD, NMR and ion-mobility mass spectrometry. Zn(II) titrations are consistent with the formation of a 1:1 Zn(II):terpy-GS(2) complex at pH 7.4, but bipy-GS(2) was shown to form both 1:1 and 1:2 complexes with the former being predominant under dilute micromolar conditions. Formation constants for the resulting 1:1 complexes were determined to be log K(M) 6.86 (bipy-GS(2)) and 6.22 (terpy-GS(2)), consistent with a higher affinity for the unconstrained bipyridine, compared to the strained terpyridine. Cu(II) coordination involves the initial formation of 1:1 complexes, followed by 1.5Cu:1bipy-GS(2) and 2Cu:1terpy-GS(2) complexes at micromolar concentrations. Binding constants for formation of the 1:1 complexes (log K(M) 12.5 (bipy-GS(2)); 8.04 and 7.14 (terpy-GS(2))) indicate a higher affinity for Cu(II) than Zn(II). Finally, ion-mobility MS studies detected the free ligands in their protonated form, and were consistent with the formation of two different Cu adducts with different conformations in the gas-phase. We illustrate that the bipyridine and terpyridine dimerisation units can behave like conformational switches in response to Cu/Zn complexation, and propose that in future these can be employed in synthetic biology with larger peptide or protein fragments, to control large scale folding and related biological function

Structure et spécificité de la thymidylate kinase du virus de la vaccine (vers une stratégie antipoxvirus)

La thymidylate kinase du virus de Vaccine (VaccTMPK) présente une spécificité de substrat plus étendue que celle de son homologue humain. Elle est capable de catalyser la phosphorylation de TMP, dUMP mais surtout du dGMP. Les paramètres cinétiques obtenus pour le TMP sont proches de ceux de la TMPK humaine (kcat = 2 s-1 ; KM = 20 M). Les données cristallographiques de l enzyme virale liés au TDP montre que VaccTMPK adopte le même repliement que l enzyme humaine avec une association orthogonale des sous-unités, probablement due à un défaut de compaction au niveau du domaine à NMP. Cette singularité permet à l enzyme de lier des susbtrats plus volumineux comme le dGMP et le 5-bromo-vinyl-dUMP et s accompagne d une stabilité moins grande comme l indiquent les expériences de microcalorimétrie. Dans le cadre de la recherche de nouveaux substrats antipoxvirus de VaccTMPK, une série de phosphonates analogues du dUMP, composés d une partie acyclique de 3, 4 ou 5 carbones à la place du désoxyribose, ont été testés pour leur réactivité avec les TMPK virale et humaine. De plus, un groupement méthyle-, halogène- ou aryl- est ajouté en position C5 de la base. Les dérivés methylés ou halogénés, des séries allyl- et pentenyl-, sont substrats des TMPKs alors que les dérivés substitués par un aryl- ne le sont pas. D autre part, une série d analogues alkylés et oxydés de dGMP a été testés pour leur réactivité avec VaccTMPK et la GMPK humaine. Ils sont tous substrats des deux enzymes sauf le O6-Me-dGMP qui est spécifiquement phosphorylé par VaccTMPKPARIS-BIUSJ-Thèses (751052125) / SudocPARIS-BIUSJ-Physique recherche (751052113) / SudocSudocFranceF

PHOSPHORYLATION DES ANALOGUES DE NUCLEOTIDES ANTIRETROVIRAUX PAR LA NUCLEOSIDE DIPHOSPHATE KINASE

LES ANALOGUES DE NUCLEOTIDES ADMINISTRES DANS LES THERAPIES ANTIRETROVIRALES (DDN, AZT, D4T, 3TC) SONT TRANSFORMES DANS LA CELLULE EN TRIPHOSPHATE PAR DES KINASES CELLULAIRES AVANT D'ATTEINDRE LEUR CIBLE, LA TRANSCRIPTASE INVERSE DU VIRUS VIH. CETTE ACTIVATION IMPLIQUE LES ENZYMES DE LA VOIE DE RECUPERATION DES NUCLEOTIDES. LE DERNIER PHOSPHATE EST AJOUTE PAR LA NUCLEOSIDE DIPHOSPHATE (NDP) KINASE, VERITABLE ENZYME DE MENAGE, AVEC UNE SPECIFICITE LARGE POUR TOUS LES NUCLEOTIDES. LA REACTIVITE DE LA NDP KINASE AVEC LES ANALOGUES ANTIRETROVIRAUX S'EST AVEREE BEAUCOUP PLUS FAIBLE QUE SUPPOSEE. A L'AIDE D'UNE METHODE MESURANT LA FLUORESCENCE INTRINSEQUE DE LA PROTEINE, NOUS AVONS ETUDIE LA REACTIVITE DE L'ENZYME AVEC DIFFERENTS ANALOGUES DE NUCLEOTIDES DONNEUR (NTP) OU ACCEPTEUR (NDP) DE PHOSPHATE. BIEN QUE L'EQUILIBRE DE LA REACTION AVEC LES NTP ET NDP SOIT LE MEME QUE POUR LES NUCLEOTIDES NATURELS, LA VITESSE DE TRANSFERT DE PHOSPHATE EST TRES DIMINUEE (1000 A 10000 FOIS) POUR LES ANALOGUES ANTIVIRAUX, SUBSTRATS LENTS DE LA NDP KINASE. L'AFFINITE RELATIVE DES NTP A ETE MESUREE DIRECTEMENT POUR UN MUTANT INACTIF DE L'ENZYME. TOUS LES ANTIVIRAUX SE LIENT MOINS BIEN AU SITE ACTIF QUE LEURS HOMOLOGUES NATURELS A L'EXCEPTION DU D4T TRIPHOSPHATE QUI SE LIE A L'ENZYME AVEC LA MEME AFFINITE QUE LA THYMIDINE TRIPHOSPHATE. L'ABSENCE DE 3'OH SUR LE RIBOSE EMPECHE L'ETABLISSEMENT D'UNE LIAISON HYDROGENE INTRAMOLECULAIRE AVEC L'O 7 DU PHOSPHATE , CRUCIALE POUR UNE CATALYSE EFFICACE. SEUL LE D4T EST CAPABLE D'EFFECTUER PARTIELLEMENT UNE INTERACTION DE CE TYPE. C'EST LE MEILLEUR ANTIVIRAL PHOSPHORYLE PAR LA NDP KINASE. L'EXAMEN DE LA STRUCTURE D'UN NUCLEOTIDE LIE AU SITE ACTIF MONTRE QUE L'OXYGENE PRO-RP DU PHOSPHATE DU NUCLEOTIDE N'INTERAGIT NI AVEC LE MG 2 +, NI AVEC LA PROTEINE. EN COLLABORATION AVEC L'UNITE DE CHIMIE ORGANIQUE DE L'INSTITUT PASTEUR, UN GROUPEMENT BORANO (-BH 3) A ETE INTRODUIT A LA PLACE DE CET OXYGENE. LES DERIVES RP-BH 3 DE L'AZT ET DU D4T DI- ET TRIPHOSPHATE SONT DIX FOIS MIEUX PHOSPHORYLES PAR LA NDP KINASE, EN RAISON DE LEUR MEILLEURE AFFINITE POUR L'ENZYME. LE DIASTEREOISOMERE RP EST AUSSI UN MEILLEUR TERMINATEUR DE CHAINE DE L'ACTIVITE TRANSCRIPTASE INVERSE : LES NUCLEOTIDES -BORANO SONT PLUS EFFICACEMENT INCORPORES DANS L'ADN VIRAL. ILS SONT EGALEMENT MOINS SENSIBLES A L'EXCISION (PYROPHOSPHOROLYSE) PAR L'ENZYME SAUVAGE COMME PAR DES VARIANTS RESISTANTS DE LA POLYMERASE VIRALE. A CAUSE DU ROLE ESSENTIEL DE LA FONCTION 3'OH DU NUCLEOTIDE, NOUS AVONS ESSAYE DE COMPENSER SON ABSENCE DANS LES ANALOGUES ANTIVIRAUX EN INTRODUISANT UNE FONCTION - OH DANS LE SITE ACTIF DE LA NDP KINASE. PLUSIEURS MUTANTS ONT ETE CREES PAR MUTAGENESE DIRIGEE : UN SEUL MUTANT POUR LEQUEL L'ASN 119 A ETE SUBSTITUEE PAR UNE SER PHOSPHORYLE MIEUX LES ANTIVIRAUX AVEC UNE EFFICACITE CATALYTIQUE ENTRE DEUX ET DIX FOIS SUPERIEURE, DUE A UNE FIXATION PLUS AISEE AU SITE ACTIF. L'INTRODUCTION DE LA SER EN 119 PERMET DE RESTAURER LE RESEAU DE LIAISONS HYDROGENE INDISPENSABLE AU TRANSFERT DE PHOSPHATE. EN PARALLELE, NOUS AVONS RECHERCHE DE NOUVEAUX INHIBITEURS DE LA NDP KINASE : L'ADENOSINE 3 PHOSPHATE 5 PHOSPHOSULFATE (PAPS) INHIBE L'ACTIVITE NDP KINASE AVEC UNE AFFINITE DE 10 M. L'ANALYSE DES COCRISTAUX DE L'ENZYME COMPLEXEE AVEC LE PAPS MONTRE QUE L'ANALOGUE DE NUCLEOTIDE SE LIE AU SITE ACTIF SELON UN MODE DIFFERENT DU NUCLEOTIDE NATUREL. LE PAPS REPRESENTE AINSI L'INHIBITEUR DE PLUS FORTE AFFINITE CONNU POUR CETTE ENZYME.PARIS-BIUSJ-Thèses (751052125) / SudocCentre Technique Livre Ens. Sup. (774682301) / SudocPARIS-BIUSJ-Physique recherche (751052113) / SudocSudocFranceF

Etude des kinases assurant l'activation cellulaire des inhibiteurs nucléosidiques utilisés dans les traitements antiviraux

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