Transcriptome Profile of Trichoderma harzianum IOC-3844 Induced by Sugarcane Bagasse

Profiling the transcriptome that underlies biomass degradation by the fungus Trichoderma harzianum allows the identification of gene sequences with potential application in enzymatic hydrolysis processing. in the present study, the transcriptome of T. harzianum IOC-3844 was analyzed using RNA-seq technology. the sequencing generated 14.7 Gbp for downstream analyses. de novo assembly resulted in 32,396 contigs, which were submitted for identification and classified according to their identities. This analysis allowed us to define a principal set of T. harzianum genes that are involved in the degradation of cellulose and hemicellulose and the accessory genes that are involved in the depolymerization of biomass. An additional analysis of expression levels identified a set of carbohydrate-active enzymes that are upregulated under different conditions. the present study provides valuable information for future studies on biomass degradation and contributes to a better understanding of the role of the genes that are involved in this process.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)Univ Campinas UNICAMP, CBMEG, Campinas, SP, BrazilBrazilian Ctr Res Energy & Mat CNPEM, Brazilian Bioethanol Sci & Technol Lab CTBE, Campinas, SP, BrazilUniv São Paulo, Phys Inst Sao Carlos, Sao Carlos, SP, BrazilFed Univ São Paulo UNIFESP, Inst Sci & Technol, Sao Jose Dos Campos, SP, BrazilUniv Campinas UNICAMP, Dept Plant Biol, Inst Biol, Campinas, SP, BrazilFed Univ São Paulo UNIFESP, Inst Sci & Technol, Sao Jose Dos Campos, SP, BrazilWeb of Scienc

Bioprospecting of cellulase fungi producer in the amazon region for production cellulosic ethanol

Prospecting for cellulose-producing fungi is one of the possible strategies for obtaining the necessary enzymes to hydrolyze the lignocellulosic material and to contribute to the viability of cellulosic ethanol production. Among the different biomes, the Amazon represents a potential source of cellulolytic fungi due to its unique soil and climatic conditions that favor the continued degradation of the biomass of the forest undergrowth. In this context, the objective of this study was the isolation and selection of fungi producing complex cellulase present in the Amazon biome with high efficiency through the process of solid-state fermentation (SSF) of 100 soil samples collected at 50 different points of Reserve Embrapa Eastern Amazon, in Belém - PA. After isolation of fungi, a total of 110, they were transferred to plates containing crystalline cellulose (Avicel) as sole carbon source for selection. Of these 110, 10 fungi were selected that showed the highest growth. The selected strains were grown at 35 ° C for 120 hours in SSF, using as a substrate for a first selection of strains producing endoglucanases, wheat bran with 60 % humidity. The two fungi had higher enzyme production in wheat bran, Aspergillus fumigatus (P40M2) and Aspergillus niger (P47C3) were evaluated in several other substrates, with different percentage of humidity. In these other substrates, has also evaluated the production of endoglucanases, Fpase, xylanase and β- glucosidase.The fungus Aspergillus fumigatus P40M2 showed, in general, the best production of these enzymes. So, finally, the enzymes produced by Aspergillus fumigatus P40M2 were characterized optimum pH, optimum temperature and thermal stability, and their bands of activities identified by electrophoresis (zymograms). The extract obtained by the fungus is characteristic thermophilic and acidophilic being very important for hydrolysis of biomass to ethanol production.Financiadora de Estudos e ProjetosA prospecção de fungos produtores de celulases é uma das possíveis estratégias para a obtenção das enzimas necessárias para hidrolisar o material lignocelulósico e com isso contribuir para a viabilização da produção de etanol celulósico. Dentre os diferentes biomas do país, o Amazônico representa uma fonte em potencial de fungos celulolíticos devido as suas condições edafoclimáticas peculiares que propiciam a constante degradação da biomassa rasteira da floresta. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi realizar o isolamento e a seleção de fungos produtores do complexo de celulases presentes no Bioma Amazônico com alta eficiência por meio do processo de fermentação em estado sólido (FES) de 100 amostras de solo coletados em 50 pontos diferentes da Reserva Embrapa Amazônia Oriental, na cidade de Belém PA. Após o isolamento dos fungos, um total de 110, eles foram transferidos para placas contendo celulose cristalina (Avicel) como única fonte de carbono para avaliação e seleção quanto a sua produção de celulase. Desses 110, foram selecionados os 10 fungos que apresentaram maior crescimento. As linhagens selecionadas foram cultivadas a 35°C, por 120 horas em FES, utilizando como substrato, para uma primeira seleção de linhagens produtoras de endoglucanases, o farelo de trigo com 60 % de umidade. Os dois fungos que obtiveram maior produção enzimática no farelo de trigo, o Aspergillus fumigatus P40M2 e o Aspergillus niger P47C3, foram avaliados em diversos outros substratos, com diferentes percentuais de umidade. Nestes outros substratos, além da avaliação quanto a produção de endoglucanases, essas linhagens também foram avaliadas quanto a produção de xilanase, FPase e β- glicosidase. Dessas duas linhagens, o Aspergillus fumigatus P40M2 foi o que apresentou, de maneira geral, a melhor produção dessas enzimas. Assim, por fim, as enzimas produzidas pelo Aspergillus fumigatus P40M2 foram caracterizadas quanto ao pH ótimo, temperatura ótima e estabilidade térmica, e suas bandas de atividades identificadas por eletroforese (zimograma).O extrato obtido pelo fungo apresentou características termofílicas e acidofílicas sendo muito importantes para hidrólise da biomassa visando a produção de etanol

Production of cellulases by Trichoderma harzianum for biomass process to bioethanol

Currently the great challenge for the production of second generation ethanol is to reduce thecost of the enzymes. It is possible to reduce part of this cost by carrying out an optimization ofthe process fermentation using sources of cellulase-induction that allow further growth of fungalbiomass, and increased secretion of proteins. The use of a mutant strain with overexpression ofhemicelulolytics activators could increase expression of the enzymes of interest and therebycontribute to cost reduction. This work aimed to study the production of enzymes involved inthe degradation of biomass by the newly isolated strain of Trichoderma harzianum P49P11focusing on the improvement of the submerged fermentation processes and on the use molecularbiology tools to improve the fungal strain. Regarding the fermentation process, the effects ofdifferent inducing sources were evaluated in flasks and bioreactor using statistical experimentaldesign tools and strategies to enhance biomass in the pre-culture step. For fungal strainimprovement, it was used molecular biology tools for the overexpression of two activators ofcellulases (xyr1 and lae1). A proteomic analysis of the T. harzianum enzymatic extract obtainedusing sugarcane bagasse pretreated by steam explosion followed by delignification (BED) wasperformed. The results showed that the best source for inducing cellulase was BED + sucrose(3: 1), reaching values of 1.21 FPU/mL 80.0U/mL of xylanase and 17.30 U/mL of β-glucosidase. The proteomic analyis identificated 24 different glycoside hydrolases and fourCBM proteins, within 12 different CAZy families. From this study, the enzymatic cocktailproduced "on site" could be supplemented using two accessory enzymes, pectinase and α-Larabinofuranosidase,leading to an increase of 100% of the hydrolysis yield. Regarding thestudy of carbon sources in the pre-culture step, it was possible to increase cellulases productionin 2 times using glycerol as the initial carbon source, followed by inducing carbon source(BED). The xyr1 and lae1 overexpression influencied positively the FPase, CMCase, xylanaseand β-glucosidase production, representing a new approach to increase production of theseenzymes.Financiadora de Estudos e ProjetosAtualmente o grande desafio para a produção de etanol de segunda geração consiste emdiminuir o custo das enzimas degradantes da fibra lignocelulósica. Uma alternativa quepode levar a redução de parte desse custo é a otimização do processo fermentativoutilizando fontes indutoras das enzimas (hemi)celulolíticas que permitam um maiorcrescimento da biomassa fúngica e maior secreção de proteínas. A utilização de umalinhagem mutante com a superexpressão dos ativadores dessas enzimas também podecontribuir nesse sentido. Portanto, o objetivo deste trabalho foi estudar a produção deenzimas envolvidas na degradação da biomassa pelo fungo recém-isolado Trichodermaharzianum P49P11 com foco no melhoramento dos processos fermentativos submersose no uso de ferramentas de biologia molecular para o melhoramento da linhagemfúngica. Em relação ao processo fermentativo foi avaliado o efeito de diferentes fontesindutoras em frascos agitados e em biorreator utilizando ferramentas estatísticas deplanejamento de experimentos e estratégias de aumento de biomassa na fase de préinóculo.Em relação ao melhoramento da linhagem fungica foram utilizadas ferramentasde biologia molecular para a superexpressão de dois ativadores de celulases (xyr1 elae1). Para um melhor entendimento das proteínas produzidas em cultivo submerso foirealizado o proteôma do extrato enzimático secretado pelo fungo selvagem em bagaçode cana pré-tratado. Os resultados mostraram que a melhor fonte de carbono indutora decelulases foi o bagaço de cana explodido e deslignificado (BED) + sacarose naproporção 3:1, alcançando valores de 1,21 FPU/mL, 80.0U/mL de xilanse e 17,30 U/mL de β-glicosidase. O proteôma do extrato enzimático de T. harzianum resultou naidentificação de 24 hidrolases glicosídicas diferentes, 4 proteínas CBM dentro de 12diferentes famílias do CAZy. A partir deste estudo pode-se suplementar o coquetelenzimático on site com duas enzimas acessórias, pectinase e α-L-arabinofuranosidaseque aumentaram o rendimento de hidrólise em mais de 100%. Em relação ao estudo dasfontes de carbono na fase de pré-inóculo foi possível aumentar a produção de celulasesem 130% utilizando o glicerol como fonte de carbono inicial, seguida de fonte de18carbono indutora (BED). A aplicação de técnicas de biologia molecular para a mutaçãodo T. harzianum visando a superexpressão de xyr1 e lae teve influência positiva naprodução das enzimas FPase, CMCase, xilanase e β-glicosidase, representando umanova abordagem para aumentar a produção dessas enzimas

Caracterização de fungos isolados da região Amazônica quanto ao potencial para produção das enzimas envolvidas na conversão da biomassa vegetal

<p>A conversão da biomassa vegetal proveniente de resíduos agroindustriais e florestais em biocombustíveis e bioprodutos, dentro do conceito de biorrefinarias, é de grande interesse, principalmente para o Brasil, onde a agroenergia possui um enorme potencial de desenvolvimento. Entretanto, para garantir a viabilidade do processo de conversão, é fundamental reduzir o custo das enzimas utilizadas na etapa de hidrólise. Para isso, deve-se dispor da peça chave deste processo, que é o microrganismo. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar fungos isolados da região Amazônica em relação ao potencial de produção das enzimas celulases e xilanases. De um total de 40 isolados cultivados por fermentação em estado sólido (FES), durante 10 dias, os fungos que se destacaram quanto à produção de endoglucanase (351,79Ug^-1 em 120h) e β-glicosidase (62,31Ug^-1em 72h) foi o P47C3 (A. niger), e na produção de xilanase (1076,94Ug^-1 em 72h) e FPase (2,46Ug^-1 em 120h) foram o P6B2 (A. oryzae) e o P40B3, respectivamente. Os resultados obtidos demonstram o enorme potencial de aplicação das enzimas produzidas pelos fungos isolados da Amazônia, contribuindo, assim, para gerar os avanços tecnológicos necessários para o aumento da eficiência do uso da biomassa vegetal como fonte de energia renovável</p

Contribution to the taxonomy and ecology of the Azorean benthic marine algae

Evolution and Conservation in the North Atlantic Islands (Madeira, Canaries, Azores). Manchester, Reino Unido, 4-6 de Setembro de 1990

The capability of endophytic fungi for production of hemicellulases and related enzymes

Abstract\ud \ud BACKGROUND: \ud \ud There is an imperative necessity for alternative sources of energy able to reduce the world dependence of fossil oil. One of the most successful options is ethanol obtained mainly from sugarcane and corn fermentation. The foremost residue from sugarcane industry is the bagasse, a rich lignocellulosic raw material uses for the production of ethanol second generation (2G). New cellulolytic and hemicellulytic enzymes are needed, in order to optimize the degradation of bagasse and production of ethanol 2G.\ud \ud RESULTS: \ud \ud The ability to produce hemicellulases and related enzymes, suitable for lignocellulosic biomass deconstruction, was explored using 110 endophytic fungi and 9 fungi isolated from spoiled books in Brazil. Two initial selections were performed, one employing the esculin gel diffusion assay, and the other by culturing on agar plate media with beechwood xylan and liquor from the hydrothermal pretreatment of sugar cane bagasse. A total of 56 isolates were then grown at 29°C on steam-exploded delignified sugar cane bagasse (DEB) plus soybean bran (SB) (3:1), with measurement of the xylanase, pectinase, β-glucosidase, CMCase, and FPase activities. Twelve strains were selected, and their enzyme extracts were assessed using different substrates. Finally, the best six strains were grown under xylan and pectin, and several glycohydrolases activities were also assessed. These strains were identified morphologically and by sequencing the internal transcribed spacer (ITS) regions and the partial β-tubulin gene (BT2). The best six strains were identified as Aspergillus niger DR02, Trichoderma atroviride DR17 and DR19, Alternaria sp. DR45, Annulohypoxylon stigyum DR47 and Talaromyces wortmannii DR49. These strains produced glycohydrolases with different profiles, and production was highly influenced by the carbon sources in the media.\ud \ud CONCLUSIONS: \ud \ud The selected endophytic fungi Aspergillus niger DR02, Trichoderma atroviride DR17 and DR19, Alternaria sp. DR45, Annulohypoxylon stigyum DR47 and Talaromyces wortmannii DR49 are excellent producers of hydrolytic enzymes to be used as part of blends to decompose sugarcane biomass at industrial level.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)National Laboratory of Science and Technology of Bioethanol (CTBE