Enhanced oligomerization of full-length RAGE by synergy of the interaction of its domains.

The pattern recognition receptor RAGE (receptor for advanced glycation end-products) transmits proinflammatory signals in several inflammation-related pathological states, including vascular diseases, cancer, neurodegeneration and diabetes. Its oligomerization is believed to be important in signal transduction, but RAGE oligomeric structures and stoichiometries remain unclear. Different oligomerization modes have been proposed in studies involving different truncated versions of the extracellular parts of RAGE. Here, we provide basic characterization of the oligomerization patterns of full-length RAGE (including the transmembrane (TM) and cytosolic regions) and compare the results with oligomerization modes of its four truncated fragments. For this purpose, we used native mass spectrometry, analytical ultracentrifugation, and size-exclusion chromatography coupled with multi-angle light scattering. Our results confirm known oligomerization tendencies of separate domains and highlight the enhanced oligomerization properties of full-length RAGE. Mutational analyses within the GxxxG motif of the TM region show sensitivity of oligomeric distributions to the TM sequence. Using hydrogen-deuterium exchange, we mapped regions involved in TM-dependent RAGE oligomerization. Our data provide experimental evidence for the major role of the C2 and TM domains in oligomerization, underscoring synergy among different oligomerization contact regions along the RAGE sequence. These results also explain the variability of obtained oligomerization modes in RAGE fragments

Interaction interface in the C-terminal parts of centriole proteins Sas6 and Ana2

The centriole is a ninefold symmetrical structure found at the core of centrosomes and, as a basal body, at the base of cilia, whose conserved duplication is regulated by Plk4 kinase. Plk4 phosphorylates a single serine residue at the N-terminus of Ana2 to promote Ana2's loading to the site of procentriole formation. Four conserved serines in Ana2's STAN motif are then phosphorylated by Plk4, enabling Sas6 recruitment. Crystallographic data indicate that the coiled–coil domain of Ana2 forms a tetramer but the structure of full-length Ana2 has not been solved. Here, we have employed hydrogen–deuterium exchange coupled with mass spectrometry (HDX-MS) to uncover the conformational dynamics of Ana2, revealing the high flexibility of this protein with one rigid region. To determine the elusive nature of the interaction surfaces between Ana2 and Sas6, we have confirmed complex formation between the phosphomimetic form of Ana2 (Ana2-4D) and Sas6 in vitro and in vivo. Analysis of this complex by HDX-MS identifies short critical regions required for this interaction, which lie in the C-terminal parts of both proteins. Mutational studies confirmed the relevance of these regions for the Ana2–Sas6 interaction. The Sas6 site required for Ana2 binding is distinct from the site required for Sas6 to bind Gorab and Sas6 is able to bind both these protein partners simultaneously

Can we accurately measure the concentration of clinically relevant vitamin D metabolites in the circulation? The problems and their consequences

Wzrost zainteresowania oznaczeniami stężenia witaminy D przyczynił się do opracowania w ostatnich latach nowych testów immunochemicznych (manualnych oraz do automatycznych analizatorów). Do laboratoriów diagnostycznych wprowadza się również techniki dotychczas niestosowane w rutynowych oznaczeniach witaminy D, takie jak HPLC (wysokosprawna chromatografia cieczowa) oraz LC-MS/MS (tandemowa spektrometria mas sprzężona z wysokosprawną chromatografią cieczową). W związku z różnorodnością testów i metod pojawia się pytanie o ich wiarygodność. W niniejszej pracy przeglądowej opisano występujące w krwiobiegu metabolity witaminy D, przedstawiamy zalety i wady stosowanych metod oznaczania ich stężenia oraz omawiamy czynniki mające wpływ na wiarygodność wyników tych oznaczeń. (Endokrynol Pol 2013; 64 (3): 238–245)Increased interest in vitamin D measurements in clinical studies has contributed to the development in recent years of several new immunochemical assays (manual and for automatic analyzers). New methods, including HPLC (high performance liquid chromatography), and LC-MS/MS (liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry) have also been introduced into routine diagnostic laboratories. Because of the variety of assays and methods used, the question arises which one is the most accurate for the measurement of vitamin D metabolites concentration. In this review, we summarise the advantages and disadvantages of these methods, describe the complexity of vitamin D metabolites pattern in the circulation, and discuss the problem of accurate measuring its concentration. (Endokrynol Pol 2013; 64 (3): 238–245

Protein partners of the eEF1Bβ subunit of the translation elongation complex eEF1B in the nuclear fraction of human lung carcinoma cells

Aim. To identify novel protein partners of translation factor eEF1Bβ in nucleus of human lung carcinoma cells. Methods. Protein partners of eEF1Bβ in the nuclear fraction of A549 cells were identified by co-immunoprecipitation (co-IP) combined with liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Specific protein partners of eEF1Bβ were further selected by using the results of previously published global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellu-lar localization with help of “Mapofthecell” program. Results. 104 high-scored proteins interact-ing with eEF1Bβ in the nuclear fraction of A549 cells have been identified by mass-spectrometry. Among these proteins, 9 partners of eEF1Bβ were confirmed by the co-fractionation approach. Functional analysis of the partners has divided them on the pro-oncogenic (lung-cancer related) and neutral/anti-oncogenic moieties. These two groups are estimated to be spatially separated in human cancer cells. Conclusions. The position of eEF1Bβ as a link between the oncogenic and neutral/tumor-suppressor moieties of its protein partners in nucleus of lung cancer cells is sug-gested. Deciphering of a possible role of the eEF1Bβ distribution between the pro-cancer or anti-cancer communities of its protein partners can be a subject of further research.Мета. Виявити нових білків-партнерів фактора трансляції eEF1Bβ в ядрі клітин карциноми легені. Методи. Білки-партнери eEF1Bβ, отримані з ядерного екстракту клітин А549 методом ко-імунопреципітації (co-IP), були ідентифіковані за допомогою высокоефективної рідинної хроматографії з тандемною мас-спектрометрією (LC-MS/MS). Подальше підтвердження білків-партнерів проводили із використанням опублікованих даних глобального, кількісного і динамічного картування субклітинної локалізації білків за допомогою програми Mapofthecell. Результати. 104 білки, які взаємодіють із eEF1Bβ в ядерній фракції клітин карциноми легені A549 були ідентифіковані мас-спектрометрією. Проміж цих білків, 9 партнерів eEF1Bβ були підтверджені даними із прецизійного субклітинного фракціонування. За допомогою функціонального аналізу ці білки-партнери можуть бути поділені на про-онкогенну і нейтральну/анти-онкогенну групи. Передбачено, що ці групи можуть бути просторово розділені в ракових клітинах людини. Висновки. Запропоновано, що eEF1Bβ може бути проміжною ланкою між онкогенною і нейтральною/пухлиносупресорною групами партнерів цього білка в ядрі ракових клітин. Розшифрування можливої ролі залучення eEF1Bβ до про-ракової або анти-раковими спільнот білкових партнерів цього білку може бути предметом подальших дослiджень.Цель. Выявление новых белков-партнеров фактора трансляции eEF1Bβ в ядре клеток карциномы легкого. Методы. Белки-партнёры eEF1Bβ, полученные из ядерного экстракта клеток А549 методом ко-иммунопреципитации (co-IP), были идентифицированы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS). Дальнейшее подтверждение белков-партнеров проводили с использованием опубликованных ранее данных глобального, количественного и динамичного картирования субклеточной локализации белков с помощью программы «Mapofthecell». Результаты. Методом масс-спектрометрии было идентифицировано 104 белка, взаимодействующих с eEF1Bβ в ядре клеток A549. Из этих белков, 9 партнеров eEF1Bβ были подтверждены данными, полученными при подробном субклеточном фракционировании. С помощью функционального анализа эти белки-партнеры можно разделить на про-онкогенную і нейтральную/анти-онкогенную группы. Предсказано, что эти группы могут быть разделены в пространстве в раковых клетках человека. Выводы. Выдвинуто предположение, что eEF1Bβ может быть промежуточным звеном между онкогенной и нейтральной/опухоле-супрессорной группами его партнеров в ядре раковых клеток. Расшифровка возможной роли вовлечения eEF1Bβ в про-раковую или анти-раковую группы его белковых партнеров может быть предметом дальнейших исследований