Charakterisierung GATA-3-spezifischer DNAzyme und Analyse der therapeutischen Wirksamkeit in experimentellen Modellen des allergischen Asthma bronchiale

Das allergische Asthma bronchiale ist eine chronisch entzündliche Erkrankung der Atemwege begleitet von einer erhöhten Mukussekretion und Atemwegs-hyperreagibilität. Die häufigste Therapie basiert auf einer Kombination von inhalativen Kortikosteroiden (ICS) und langwirksamen β2-Sympathomimetika. Diese Medikamente wirken allerdings rein symptomatisch, verursachen unerwünschte Nebenwirkungen und sind bei einem Teil der Patienten nicht wirksam. In der vorliegenden Arbeit sollte daher ein neuer, kausal wirksamer und möglichst nebenwirkungsarmer Therapieansatz für das allergische Asthma bronchiale entwickelt werden. Als Zielmolekül der Interventions-strategie wurde der Transkriptionsfaktor GATA-3 gewählt, der durch seine Funktion bei der Differenzierung und Aktivierung von T-Helfer-2-Zellen (Th2) und der Expression in Eosinophilen, Mastzellen und natürlichen Killer T- (NKT-) Zellen eine zentrale Rolle bei allergischen Entzündungsreaktionen spielt. Transkriptionsfaktoren liegen intrazellulär vor und sind therapeutisch folglich schwierig zu adressieren. Antisense-Strategien stellen dafür eine neue Möglichkeit dar, da sie direkt mit der mRNA des Zielmoleküls interagieren. Als therapeutisches Werkzeug wurden von unserer Arbeitsgruppe entwickelte GATA 3-spezifische DNAzyme verwendet. Dabei handelt es sich um einzelsträngige Desoxyoligonukleotide mit hoher Spezifität für die GATA-3-mRNA und inhärenter RNA-spaltender katalytischer Aktivität. Eingesetzt wurden die GATA-3-spezifischen DNAzyme gd21 und hgd40, sowie das Kontroll-DNAzym ODNg. Letzteres besitzt die katalytische Sequenz, kann aber GATA-3-mRNA nicht binden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die GATA-3-spezifischen DNAzyme bezüglich ihrer Spezifität und möglichen Off-Target-Effekte zu charakterisieren, Nachweis-systeme zur Untersuchung von Stabilität und Bioverfügbarkeit zu entwickeln und die Wirksamkeit in experimentellen Modellen für allergische Atemwegsentzündungen zu untersuchen. Analysen zur Spezifität ergaben, dass gd21 nur die murine und hgd40 die humane, murine und Ratten-GATA-3-mRNA dosisabhängig schneiden können. Die katalytische Aktivität ist nur spezifisch für GATA-3-mRNA, auf andere mRNAs bzw. GATA-3-DNA wurde kein Einfluss beobachtet. Mit Fokus auf mögliche Off-Target-Effekte konnte in in vitro und in vivo Experimenten ausgeschlossen werden, dass die DNAzyme eine Aktivierung angeborener Immunmechanismen, insbesondere durch Interaktion mit dem Toll-like-Rezeptor-9 (TLR-9), bewirken. Für Untersuchungen zur Stabilität und Bioverfügbarkeit der GATA-3-spezifischen DNAzyme wurden ein sensitiver Hybridisierungs-ELISA und eine Anionenaustausch-Chromatographie-Methodik entwickelt. Mittels dieser Methoden konnte gezeigt werden, dass die verwendeten DNAzyme auch bei erhöhter Lagerungstemperatur langzeitig stabil sind. Der Nachweis von DNAzym im Serum nach lokaler Applikation in die Lunge bestätigt, dass DNAzym über die Lunge aufgenommen und somit bioverfügbar wird. Die in vivo Wirksamkeit von GATA-3-spezifischen DNAzymen wurde in tierexperimentellen Modellen der akuten allergischen Atemwegsentzündung untersucht. Sowohl eine präventive als auch eine therapeutische Applikation von GATA-3-spezifischen DNAzymen führte zu einer Reduktion der Entzündungsreaktion in der Lunge und zu einer deutlichen Verbesserung der Atemwegsreaktivität. Im direkten Vergleich von hgd40 mit dem ICS Budesonid wurde gezeigt, dass die Wirkungen der DNAzyme auf die akute allergische Atemwegsentzündung vergleichbar oder besser zu denen des Budesonids sind. Auch in einem Modell für chronisch allergisches Asthma bronchiale, das noch besser die Situation des humanen Asthma bronchiale widerspiegelt, konnten positive therapeutische Effekte nachgewiesen werden, die hier auch eine Verminderung der Umbauprozesse der Atemwege (Remodelling) einschlossen. Schlussfolgernd kann festgestellt werden, dass die intranasale Applikation von GATA 3-spezifischen DNAzymen eine viel versprechende neue Therapieform für allergisches Asthma bronchiale darstellen kann, deren Wirksamkeit nun bei humanen Asthmapatienten bestätigt werden muss

Charakterisierung GATA-3-spezifischer DNAzyme und Analyse der therapeutischen Wirksamkeit in experimentellen Modellen des allergischen Asthma bronchiale

Das allergische Asthma bronchiale ist eine chronisch entzündliche Erkrankung der Atemwege begleitet von einer erhöhten Mukussekretion und Atemwegs-hyperreagibilität. Die häufigste Therapie basiert auf einer Kombination von inhalativen Kortikosteroiden (ICS) und langwirksamen β2-Sympathomimetika. Diese Medikamente wirken allerdings rein symptomatisch, verursachen unerwünschte Nebenwirkungen und sind bei einem Teil der Patienten nicht wirksam. In der vorliegenden Arbeit sollte daher ein neuer, kausal wirksamer und möglichst nebenwirkungsarmer Therapieansatz für das allergische Asthma bronchiale entwickelt werden. Als Zielmolekül der Interventions-strategie wurde der Transkriptionsfaktor GATA-3 gewählt, der durch seine Funktion bei der Differenzierung und Aktivierung von T-Helfer-2-Zellen (Th2) und der Expression in Eosinophilen, Mastzellen und natürlichen Killer T- (NKT-) Zellen eine zentrale Rolle bei allergischen Entzündungsreaktionen spielt. Transkriptionsfaktoren liegen intrazellulär vor und sind therapeutisch folglich schwierig zu adressieren. Antisense-Strategien stellen dafür eine neue Möglichkeit dar, da sie direkt mit der mRNA des Zielmoleküls interagieren. Als therapeutisches Werkzeug wurden von unserer Arbeitsgruppe entwickelte GATA 3-spezifische DNAzyme verwendet. Dabei handelt es sich um einzelsträngige Desoxyoligonukleotide mit hoher Spezifität für die GATA-3-mRNA und inhärenter RNA-spaltender katalytischer Aktivität. Eingesetzt wurden die GATA-3-spezifischen DNAzyme gd21 und hgd40, sowie das Kontroll-DNAzym ODNg. Letzteres besitzt die katalytische Sequenz, kann aber GATA-3-mRNA nicht binden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die GATA-3-spezifischen DNAzyme bezüglich ihrer Spezifität und möglichen Off-Target-Effekte zu charakterisieren, Nachweis-systeme zur Untersuchung von Stabilität und Bioverfügbarkeit zu entwickeln und die Wirksamkeit in experimentellen Modellen für allergische Atemwegsentzündungen zu untersuchen. Analysen zur Spezifität ergaben, dass gd21 nur die murine und hgd40 die humane, murine und Ratten-GATA-3-mRNA dosisabhängig schneiden können. Die katalytische Aktivität ist nur spezifisch für GATA-3-mRNA, auf andere mRNAs bzw. GATA-3-DNA wurde kein Einfluss beobachtet. Mit Fokus auf mögliche Off-Target-Effekte konnte in in vitro und in vivo Experimenten ausgeschlossen werden, dass die DNAzyme eine Aktivierung angeborener Immunmechanismen, insbesondere durch Interaktion mit dem Toll-like-Rezeptor-9 (TLR-9), bewirken. Für Untersuchungen zur Stabilität und Bioverfügbarkeit der GATA-3-spezifischen DNAzyme wurden ein sensitiver Hybridisierungs-ELISA und eine Anionenaustausch-Chromatographie-Methodik entwickelt. Mittels dieser Methoden konnte gezeigt werden, dass die verwendeten DNAzyme auch bei erhöhter Lagerungstemperatur langzeitig stabil sind. Der Nachweis von DNAzym im Serum nach lokaler Applikation in die Lunge bestätigt, dass DNAzym über die Lunge aufgenommen und somit bioverfügbar wird. Die in vivo Wirksamkeit von GATA-3-spezifischen DNAzymen wurde in tierexperimentellen Modellen der akuten allergischen Atemwegsentzündung untersucht. Sowohl eine präventive als auch eine therapeutische Applikation von GATA-3-spezifischen DNAzymen führte zu einer Reduktion der Entzündungsreaktion in der Lunge und zu einer deutlichen Verbesserung der Atemwegsreaktivität. Im direkten Vergleich von hgd40 mit dem ICS Budesonid wurde gezeigt, dass die Wirkungen der DNAzyme auf die akute allergische Atemwegsentzündung vergleichbar oder besser zu denen des Budesonids sind. Auch in einem Modell für chronisch allergisches Asthma bronchiale, das noch besser die Situation des humanen Asthma bronchiale widerspiegelt, konnten positive therapeutische Effekte nachgewiesen werden, die hier auch eine Verminderung der Umbauprozesse der Atemwege (Remodelling) einschlossen. Schlussfolgernd kann festgestellt werden, dass die intranasale Applikation von GATA 3-spezifischen DNAzymen eine viel versprechende neue Therapieform für allergisches Asthma bronchiale darstellen kann, deren Wirksamkeit nun bei humanen Asthmapatienten bestätigt werden muss

Compartmental and Temporal Dynamics of Chronic Inflammation and Airway Remodelling in a Chronic Asthma Mouse Model

<div><p>Background</p><p>Allergic asthma is associated with chronic airway inflammation and progressive airway remodelling. However, the dynamics of the development of these features and their spontaneous and pharmacological reversibility are still poorly understood. We have therefore investigated the dynamics of airway remodelling and repair in an experimental asthma model and studied how pharmacological intervention affects these processes.</p><p>Methods</p><p>Using BALB/c mice, the kinetics of chronic asthma progression and resolution were characterised in absence and presence of inhaled corticosteroid (ICS) treatment. Airway inflammation and remodelling was assessed by the analysis of bronchoalveolar and peribronichal inflammatory cell infiltrate, goblet cell hyperplasia, collagen deposition and smooth muscle thickening.</p><p>Results</p><p>Chronic allergen exposure resulted in early (goblet cell hyperplasia) and late remodelling (collagen deposition and smooth muscle thickening). After four weeks of allergen cessation eosinophilic inflammation, goblet cell hyperplasia and collagen deposition were resolved, full resolution of lymphocyte inflammation and smooth muscle thickening was only observed after eight weeks. ICS therapy when started before the full establishment of chronic asthma reduced the development of lung inflammation, decreased goblet cell hyperplasia and collagen deposition, but did not affect smooth muscle thickening. These effects of ICS on airway remodelling were maintained for a further four weeks even when therapy was discontinued.</p><p>Conclusions</p><p>Utilising a chronic model of experimental asthma we have shown that repeated allergen exposure induces reversible airway remodelling and inflammation in mice. Therapeutic intervention with ICS was partially effective in inhibiting the transition from acute to chronic asthma by reducing airway inflammation and remodelling but was ineffective in preventing smooth muscle hypertrophy.</p></div

Inhaled corticosteroids attenuate some but not all characteristics of chronic asthma.

<p>Mice were sensitised and challenged for six weeks with PBS or OVA (black bars). OVA treatment was continued for another eight weeks (light grey bars), with or without parallel treatment with inhaled corticosteroids (ICS). OVA treatment was then continued for another 4 weeks without ICS application (dark grey bars) (Protocol C). Data are presented as mean ± SEM of n = 6–8 animals per group, *p≤0.05, **p≤0.01, ***p≤0.001.</p

Resolution of airway tissue inflammation and remodelling following chronic allergen exposure.

<p>Chronic asthma was established by challenging OVA sensitized mice for 12 weeks twice weekly. OVA challenge was then discontinued and replaced with PBS for four or eight weeks. Outcome measurements were made at either 12 (+ 0), 16 (+ 4) or 20 (+ 8) weeks of challenge (<a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0085839#pone-0085839-g001" target="_blank">Figure 1</a>, Protocol B). (A) Representative photomicrographs of haematoxylin & eosin (H&E) stained sections (arrows indicate eosinophils, (B) immunohistochemical staining of CD3, (C) periodic acid-Schiff (PAS), (D) Sirius Red staining and (E) immunohistochemical staining of smooth muscle actin (SMA). (F) Histological quantification of lung inflammation, (G) eosinophil numbers as determined by morphological criteria in H&E stained lung sections, (H) CD3⁺ lymphocytes, (I) fraction of basal membrane (BM) covered by goblet cells, (J) collagen deposition and (K) SMA thickness. Box and whisker plots show mean and percentiles of n = 6–8 animals per group, *p≤0.05, **p≤0.01, ***p≤0.001.</p

Chronic allergen exposure induces airway inflammation and remodelling.

<p>Mice were challenged with OVA for up to 18 weeks (<a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0085839#pone-0085839-g001" target="_blank">Figure 1</a>, Protocol A) and analysed for airway inflammation, as determined by (A) BALF cell counts and morphometric quantification of peribronchial inflammation. (B) Airway remodelling was determined by quantification of goblet cell hyperplasia, subepithelial collagen deposition and smooth muscle thickening. Data points represent means ± SEM of n = 6–8 animals per group.</p

Schematic representation of treatment protocol.

<p>Mice were sensitised to OVA by three intraperitoneal (i.p.) injections on days 0, 14 and 21 with OVA absorbed to alum. Mice were sensitised and challenged with aerosolised OVA twice weekly for up to 18 weeks as indicated. Control mice were sensitised and challenged with PBS. Analysis was performed after 6, 8, 12, 14, 16 and 18 weeks of challenge (Protocol A). To investigate the resolution of airway inflammation and remodelling, OVA was replaced with PBS after 12 weeks for either 4 or 8 weeks (Protocol B). In a third study, inhaled corticosteroids (ICS) were given intranasally (i.n.) starting after 6 weeks of OVA challenge for 4 weeks (Protocol C).</p

Anti-ulcer treatment during pregnancy induces food allergy in mouse mothers and a Th2-bias in their offspring

The treatment of dyspeptic disorders with anti-acids leads to an increased risk of sensitization against food allergens. As these drugs are taken by 30-50% of pregnant women due to reflux and heartburn, we aimed here to investigate the impact of maternal therapy with anti-acids on the immune response in the offspring in a murine model. Codfish extract as model allergen was fed with or without sucralfate, an anti-acid drug, to pregnant BALB/c mice during pregnancy and lactation. These mothers developed a codfish-specific allergic response shown as high IgG1 and IgE antibody levels and positive skin tests. In the next step we analyzed whether this maternal sensitization impacts a subsequent sensitization in the offspring. Indeed, in stimulated splenocytes of these offspring we found a relative Th2-dominance, because the Th1- and T-regulatory cytokines were significantly suppressed. Our data provide evidence that the anti-acid drug sucralfate supports sensitization against food in pregnant mice and favors a Th2-milieu in their offspring. From these results we propose that anti-acid treatment during pregnancy could be responsible for the increasing number of sensitizations against food allergens in young infants

Plants Know Where It Hurts: Root and Shoot Jasmonic Acid Induction Elicit Differential Responses in Brassica oleracea

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