Identification and sequencing of genes involved in the biosynthesis of microcystins and saxitoxins in the cyanobacterium Microcystis aeruginosa SPC777

As toxinas produzidas por cianobactérias em ecossistemas aquáticos de superfície utilizados para abastecimento público constituem uma preocupação mundial, com casos de intoxicação relatados em diversos países.Sérios problemas de saúde e até mesmo óbito podem ocorrer como consequência dessas intoxicações. Em ambientes de água doce eutrofizados, florações de espécies de Microcystis são frequentemente observadas e, devido à sua ampla distribuição geográfica e capacidade de produzir toxinas, este é um dos gêneros de cianobactérias mais extensivamente estudados. Microcystis spp. são conhecidas pela produção da potente hepatotoxina microcistina. No entanto, um estudo recente com a linhagem M. aeruginosa SPC777 isolada da represa Billings (São Paulo, SP) relatou a sua capacidade de produção simultânea da [L-ser7] microcistina-RR e da neurotoxina saxitoxina (goniautoxinas 1, 2, 3 e 4). Esse foi o primeiro relato de produção de saxitoxina por uma cianobactéria unicelular. Nesse contexto, o presente estudo teve como objetivo identificar e sequenciar os genes envolvidos na biossíntese da microcistina e saxitoxina na linhagem M. aeruginosa SPC777 e reavaliar a produção destas toxinas após vários anos de cultivo em laboratório. Para isso, foi feito o sequenciamento do genoma de M. aeruginosa SPC777 na plataforma SOLiD V3 e a montagem ab initio das leituras foi realizada usando os algoritmos Edena e Velvet. Análises Blast no banco de dados do NCBI foram realizadas na busca de similaridade por sequências dos genes mcy e sxt e de genes que flanqueiam os agrupamentos envolvidos na biossíntese de ambas as toxinas. Além disso, PCR e sequenciamento Sanger foram empregados para auxiliar a busca dos genes de interesse. Os dez genes envolvidos na biossíntese da microcistina (mcyA-J) foram encontrados e anotados a partir do genoma da M. aeruginosa SPC777, assim como os genes dnaN e uma1, que são normalmente encontrados flanqueando o agrupamento gênico da microcistina. O arranjo dos genes mcy no agrupamento seguiu a mesma ordem de outros descritos na literatura, mas foram encontradas diferenças na sequência de nucleotídeos para alguns dos genes. Para saxitoxina, apenas cinco genes entre aqueles diretamente envolvidos na biossíntese desta neurotoxina foram encontrados usando PCR e sequenciamento Sanger. As sequências parciais dos genes sxt apresentaram alta identidade com outros encontrados em cianobactérias tóxicas. Além disso, a tradução dessas sequências em aminoácidos e as funções protéicas e domínios preditos confirmaram sua identidade como genes da sintetase de saxitoxina. Análises químicas em HPLC-MS/MS mostraram a produção de microcistina, com a detecção do íon m/z 1036, que corresponde à microcistina-YM. Entretanto, não foi observada produção de saxitoxinas. Pelo que sabemos, este é o primeiro agrupamento gênico de microcistina sequenciado de uma linhagem de Microcystis isolada da América do Sul,além de serem os primeiros genes sxt descritos em uma cianobactéria unicelular. Este estudo propiciou novos conhecimentos sobre a origem dos genes mcy e sxt e contribuiu para uma melhor compreensão da evolução destas toxinasThe toxins produced by cyanobacteria in surface aquatic ecosystems used for public supply constitute a worldwide concern, with poisoning cases reported in several countries. Serious health problems and even death can occur as a consequence of these poisonings. In eutrophic freshwater environments, blooms of Microcystis species are often observed and, due to its wide geographic distribution and ability to produce toxins, this is one of the most extensively studied cyanobacterial genera. Microcystis spp. are known for the production of the potent hepatotoxin microcystin. Nonetheless, a recent study with the strain M. aeruginosa SPC777 isolated from Billings reservoir (São Paulo, SP) reported its ability for simultaneous production of [L-ser7] microcystin-RR and the neurotoxin saxitoxin (gonyautoxins 1, 2, 3 and 4). This was the first report of saxitoxin production by a unicellular cyanobacterium. In this context, the present study aimed at the identification and sequencing of the genes involved in the biosynthesis of microcystin and saxitoxin in the strain M. aeruginosa SPC777 and re-evaluation ofthe production of these toxins after several years of cultivation in laboratory. For this, whole genome sequencing of M. aeruginosa SPC777 was done in the platform SOLiD V3 and ab initio assembly of the reads was performed using the algorithms Edena and Velvet. Blast analyses in the NCBI database were performed in the searchfor similarity to mcy and sxt gene sequences and to genes flanking the clusters involvedin the biosynthesis of both toxins. Furthermore, PCR and Sanger sequencing were employed to help the search for the genes of interest. The ten genes involved in microcystin biosynthesis (mcyA-J) were found and annotated from the genome of M. aeruginosa SPC777, as well as the genes dnaN and uma1, which are usually found flanking the microcystin gene cluster. The arrangement of mcy genes in the cluster has followed the same order than others described in literature, but differences were found in the sequence of nucleotides for some of the genes. For saxitoxin, only five genes among those directly involved in the biosynthesis of this neurotoxin were found using PCR and Sanger sequencing. The partial sxt gene sequences have shown high identities to others found in toxic cyanobacteria. Additionally, their translation into amino acids and the predicted protein functions and domains confirmed their identity as saxitoxin synthetase genes.HPLC-MS/MS chemical analyses have shown the production of microcystin, with the detection of the ion m/z1036, which corresponds to the microcystin-YM. Nevertheless, saxitoxin production was not observed. As far as we know, this is the first microcystin gene cluster sequenced from a Microcystis strain isolated from South America and it is also the first time that sxt genes are described in a unicellular cyanobacterium. This study has brought new insightson the origin of the mcy and sxt genes and contributed to a better understanding of the evolution of these toxin

Detection and quantification of hydrocarbon-degrading bacteria in petroleum samples using group-specific primer sets

Orientador: Valeria Maia de OliveiraDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A abordagem tradicional empregada em estudos de Microbiologia Ambiental, baseada em métodos de isolamento seletivo e cultivo de microrganismos em laboratório, embora seja útil para a determinação do potencial fisiológico dos organismos isolados, é inadequada para a realização de uma caracterização abrangente da comunidade microbiana destes ambientes ou para detectar microrganismos de difícil cultivo ou que vivem em consórcios. O emprego de técnicas moleculares em estudos de comunidades microbianas, as quais envolvem o isolamento direto de DNA a partir de amostras ambientais, a amplificação de genes conservados pela técnica de PCR e a análise de seqüências de rDNA 165, tem demonstrado resultados promissores em Ecologia Microbiana, uma vez que permite identificar organismos de ambientes naturais sem a necessidade de cultivo dos mesmos. A detecção de microrganismos com potencial para biodeterioração, biodegradação e biocorrosão encontrados em depósitos petrolíferos é de grande importância na medida em que estes organismos podem estar relacionados com a perda da qualidade do petróleo nos reservatórios e etapas subseqüentes de exploração (extração, . armazenamento e refino). O presente trabalho teve como objetivos desenvolver um método molecular para a detecção rápida de grupos específicos de microrganismos degradadores de hidrocarbonetos e avaliar a sua distribuição e abundância em diferentes amostras de óleo e água de formação provenientes de depósitos petrolíferos da bacia de Campos (RJ). Nossos resultados revelaram a presença dos grupos Bacíllus spp., Streptomyces spp., Achromobacter xy/osoxidans, Bacíllus pumilus, Micrococcus spp. e Dietzia spp. nas amostras de petróleo estudadas. Alguns destes microrganismos apresentaram ampla ocorrência, embora em baixa abundância, nas amostras dos cinco poços avaliados, independentemente do grau de biodegradação dos óleos e condições de pro{undidade e temperatura dos reservatórios. O desenvolvimento de um método molecular para a rápida detecção de grupos de microrganismos potencialmente biodegradadores em amostras ambientais seria extremamente útil como uma ferramenta de apoio para a avaliação da qualidade do óleo em reservatórios de produçãoAbstract: The traditional approach used in Environmental Microbiology studies, based on selective isolation and cultivation methods, although very useful for determination of the physiological potential of the isolated organisms, is inadequate for a broad characterization of the microbial community in these environments, since it does not allow the recovery of fastidious microorganisms or the ones that live in consortia. The use of molecular techniques in microbial community studies, which involve the direct DNA isolation from environmental samples, amplification of conserved genes by PCR and sequence analysis, has shown promising results in Microbial Ecology, as it allows the identification of organisms trom natural environments without the need of cultivation. The detection of microorganisms with potential for biodeterioration, biodegradation and biocorrosion in petroleum deposits is of great importance, as these organisms may be related to a decrease in petroleum quality in the reservoirs and subsequent exploration steps (extraction, storage and refining). The present work aimed at developing a molecular method for the rapid detection of specific groups of hydrocarbondegrading microorganisms and evaluating their distribution and abundance in different oil and formation water samples originated trom petroleum reservoirs in the Campos basin (RJ). Our results revealed the presence of the target groups Bacillus spp., Streptomyces spp., Achromobacter xylosoxidans, Bacillus pumilus, Micrococcus spp. and Dietzia spp. in the environmental samples under study. Some of these microorganisms were of broad occurrence, although in low abundance, in ali the five samples trom the petroleum wells analyzed, in spite of the oil biodegradation levei and depth and temperature conditions. The development of a molecular method for the rapid detectión of specific groups of biodegrading microorganisms in environmental samples would be extremely useful as a supporting toei for the evaluation of oil. quality in the production reservoirsMestradoGenetica de MicroorganismosMestre em Genética e Biologia Molecula

Searching for monooxygenases and hydrolases in bacteria from an extreme environment

Microbial oxidation potentials of extremophiles recovered from Pampo Sul oil field, Campos Basin, Brazil, in pure culture or in consortia, were investigated using high-throughput screening (HTS) and multibioreactions. Camphor (1), cis-jasmone (2), 2-methyl-cyclohexanone (3), 1,2-epoxyoctane (4), phenylethyl acetate (5), phenylethyl propionate (6), and phenylethyl octanoate (7) were used to perform multibioreaction assays. Eighty-two bacterial isolates were recovered from oil and formation water samples and those presenting outstanding activities in HTS assays were identified by sequencing their 16S rRNA genes. These results revealed that most microorganisms belonged to the genus Bacillus and presented alcohol dehydrogenase, monooxygenase, epoxide hydrolase, esterase, and lipase activities

Searching For Monooxygenases And Hydrolases In Bacteria From An Extreme Environment.

Microbial oxidation potentials of extremophiles recovered from Pampo Sul oil field, Campos Basin, Brazil, in pure culture or in consortia, were investigated using high-throughput screening (HTS) and multibioreactions. Camphor (1), cis-jasmone (2), 2-methyl-cyclohexanone (3), 1,2-epoxyoctane (4), phenylethyl acetate (5), phenylethyl propionate (6), and phenylethyl octanoate (7) were used to perform multibioreaction assays. Eighty-two bacterial isolates were recovered from oil and formation water samples and those presenting outstanding activities in HTS assays were identified by sequencing their 16S rRNA genes. These results revealed that most microorganisms belonged to the genus Bacillus and presented alcohol dehydrogenase, monooxygenase, epoxide hydrolase, esterase, and lipase activities.87319-2