Sensitivity evaluation of the computer-assisted sperm analysis (CASA) in the determination of frozen-thawed bull semen concentration

Tradicionalmente, a concentração espermática é avaliada por meio da contagem de células em câmara hemocitométrica de Neubauer, técnica laboriosa adotada na rotina dos laboratórios de andrologia. Uma alternativa para essa contagem é a técnica computadorizada de avaliação espermática (CASA), método que pode aumentar a eficiência e acurácia na determinação da concentração de espermatozoides em uma amostra de sêmen. O presente trabalho relata a avaliação da sensibilidade da técnica CASA para o acesso da concentração de espermatozoides bovinos em pósdescongelação. Foram selecionadas 425 doses de sêmen de reprodutores de diferentes raças, descongeladas a 37°C por 30 segundos e homogeneizadas. Alíquotas de 40 µL de sêmen foram transferidas para tubos cônicos de 1,5 mL previamente preenchidos com 960 µL de água destilada, fixando a taxa de diluição em 1:25 para contagem em câmara de Neubauer. Em contrapartida, alíquotas de 5 µL de cada dose de sêmen foram avaliadas com o emprego do sistema CASA considerando o número mínimo de cinco campos aleatórios e 2 mil espermatozoides por análise. A concentração média de células espermáticas foi de 38,96a ± 1,28 e 35,14b ± 0,82,respectivamente para amostras avaliadas em câmara de Neubauer ou sistema computadorizado, apresentando o coeficiente de correlação de 0,87 (P < 0.0001) e concordância de 0,78 (escala de 0 a 1). Conclui-se que as duas técnicas de avaliação da concentração espermática possuem eficiência similar. No entanto, em virtude da precisão, rapidez e por dispensar a diluição prévia das amostras para a contagem, a CASA é uma alternativa para a contagem de células espermáticas em câmara de Neubauer, sobretudo para grandes centrais de produção de sêmen bovino congelado.Sperm concentration is traditionally evaluated by counting cells in a hemocytometric Neubauer chamber, often a highly subjective, time-consuming, and laborious technique prevalent in andrology laboratories around the world. However, the Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) represents a more consistent method of evaluating sperm concentration that may provide enhancing efficiencies of sperm count. The purpose of this study is to compare the results of these two methods in the analysis of post-thaw concentration of bovine semen. Four hundred and twenty five batches of semen from different bulls were selected, thawed at 37°C for 30 seconds and then homogenized. Aliquots of 40 μL of semen were diluted in 960 μL of distilled water, fixing the rate at 1:25 dilution for analysis in a Neubauer chamber. Conversely, aliquots of 5 μL for each semen dose were submitted to CASA, considered a minimum of five random fields and 2000 sperm count per analysis. The average concentration of sperm cells was 38.96a ± 1.28 in the Neubauer analysis and 35.14b ± 0.82 for the CASA, with the correlation coefficient of 0.87 (P < 0.0001) and reliability of 0.78 (scale ranging from 0 to 1) between the two methods. In conclusion, the results of two techniques for assessing sperm concentration have similar results. However the CASA methodology would yield greater benefit due to precision, consistency, and reduced disposal issues, particularly for large processing laboratories

Use of Bayesian Inference to Correlate In Vitro Embryo Production and In Vivo Fertility in Zebu Bulls

The objective of this experiment was to test in vitro embryo production (IVP) as a tool to estimate fertility performance in zebu bulls using Bayesian inference statistics. Oocytes were matured and fertilized in vitro using sperm cells from three different Zebu bulls (V, T, and G). The three bulls presented similar results with regard to pronuclear formation and blastocyst formation rates. However, the cleavage rates were different between bulls. The estimated conception rates based on combined data of cleavage and blastocyst formation were very similar to the true conception rates observed for the same bulls after a fixed-time artificial insemination program. Moreover, even when we used cleavage rate data only or blastocyst formation data only, the estimated conception rates were still close to the true conception rates. We conclude that Bayesian inference is an effective statistical procedure to estimate in vivo bull fertility using data from IVP

A força de centrifugação pode comprometer a integridade de membrana plasmática, acrossomal e DNA de espermatozoides caprinos?

Protocols for cooling or freezing goat semen usually recommend centrifugation for seminal plasma removal. However, little is known about the effect of this process on goat sperm viability and functionality. The present study evaluated the effects of centrifugation force on the plasma membrane, acrosomes, and DNA integrity of goat semen. Four ejaculates from each of the four different Anglo Nubian male goats were used. Semen samples were obtained using artificial vagina, and immediately after collection, ejaculates were diluted using Ringer’s sodium lactate solution and split into three groups: Control (CG, without centrifugation), G1 (centrifugation 600 x g/10 min), G2 (centrifugation 1200 x g/10 min). After centrifugation, seminal plasma was removed, the sperm pellets were resuspended using Tris-egg yolk extender (80 x 106 spermatozoa/mL) and the sperm morphology was analyzed. Samples were cooled at 5°C for 5, 24, 36, and 48 h and then sperm plasma membrane and acrosome integrity (PMAI, %) and sperm DNA fragmentation index (SDF, %) were evaluated at each time-point, using a flow cytometer. Additionally, sperm movement was determined using computer semen analysis (CASA) after 5, 24, and 48 h of refrigeration period. The semen centrifugation did not induce additional sperm morphology defect or reduction in sperm kinetics in the experimental groups. Differences were not observed (p > 0.05) in PMAI and SDF among different groups, in any of each timepointof the cooling process. In conclusion, centrifugation, even at high speeds, did not affect goat sperm integrity and functionality when submitted to refrigeration process.A maior parte dos protocolos de refrigeração e criopreservação do sêmen caprino recomenda o uso de centrifugação para remoção do plasma seminal. No entanto, não existe consenso sobre o risco que esse tipo de processamento pode ocasionar à viabilidade espermática. Nesse contexto, o presente trabalho investigou os possíveis efeitos deletérios da centrifugação sobre a integridade estrutural e DNA de espermatozoides caprinos. Para a pesquisa foram selecionados quatro reprodutores para colheita de sêmen (n = 4 ejaculados/bode). Cada ejaculado foi fracionado em três alíquotas iguais, diluídas em ringer e divididas em três grupos: Controle (GC, não centrifugado), G1 (centrifugação a 600 g/10 minutos) e G2 (centrifugação a 1200 g/10 minutos). As amostras seminais por grupo foram diluídas em meio Tris gema respeitando-se a concentração final de 80 milhões de espermatozoides/mL e foram submetidas à avaliação de morfologia espermática. Todas as amostras foram acondicionadas a 5°C, sendo analisadas nos momentos 5, 24, 36 e 48 horas do processo de refrigeração por meio da avaliação da integridade de membrana plasmática e acrossomal (MPAI, %) e índice de fragmentação de DNA (IDF, %). Adicionalmente, a cinética espermática foi avaliada com o emprego de um sistema computadorizado de análise (CASA) nos momentos 5, 24 e 48 horas da refrigeração. A centrifugação não induziu a manifestação de defeitos morfológicos ou redução significativa da cinética de espermatozoides caprinos. Não foram observadas diferenças para a integridade de membrana plasmática e para o índice de fragmentação de DNA quando comparados, respectivamente, GC, G1 e G2 em cada um dos quatro momentos experimentais. Conclui-se que mesmo quando empregadas altas forças de rotação não ocorre lesão à ultraestrutura dos espermatozoides caprinos submetidos ao processo de refrigeração

Sêmen bovino sexado: A produção in vitro de embriões pode ser influenciada pelo touro doador do material genético?

O estudo teve por objetivo avaliar a possível influência do touro doador de sêmen sexado na taxa de formação de blastocistos e resultados de concepção de embriões produzidos in vitro. Para o estudo foram utilizadas 29 vacas holandesas doadoras de embriões oriundas de uma única fazenda pertencente à iniciativa privada. As doadoras foram selecionadas de acordo com sua produção leiteira, histórico reprodutivo e mérito genético e foram submetidas à aspiração folicular e posterior seleção de ovócitos viáveis, que foram fertilizados com material genético sexado de fêmea de 7 touros da raça Gir. A taxa de formação de embriões no cultivo in vitro e índices de concepção pós-transferência de embriões (TE) foram computados e analisados através de teste Qui-quadrado utilizando software Graph Pad Prism Instat 5.0®, considerando nível de significância de 5%. Foi observada grande variação na taxa de produção de embriões, que oscilou de 16,09% a 47,83%, com média de 31,97±8,57, havendo tendência de influência do touro/sêmen sexado sobre as taxas de formação de blastocistos (P=0.0659). Na taxa de concepção dos embriões transferidos observou-se efeito significativo exercido pelo sêmen sexado (p=0.0230), com resultados oscilando entre 12,5% a 77,78%, na dependência do touro doador do sêmen. Conclui-se que existe variação nas taxas de produção embrionária e na fertilidade de embriões produzidos in vitro de acordo com o touro doador do sêmen sexado

Action of Cholesterol-Loaded Cyclodextrin on Viability of Ram Semen

Background: Studies report that cyclodextrins have the property of carrying cholesterol to the membrane, but in some cases can also remove this cholesterol from the plasma membrane. The mechanism of action of CLC is not well understood, however, it seems to involve sperm protection during the freezing and thawing process. Studies show that its use enhancing increased osmotic tolerance and reduced premature sperm capacitation reaction. In this sense, studies report that cyclodextrins have the property of carrying cholesterol to the membrane, but in some cases can also remove this cholesterol from the plasma membrane. Improvements were reported in the sperm parameters of buffaloes, bulls, stallions and sheep. Ram naturally present less lipids in their membrane, on average 27%, while bulls have 31%, rabbits 62%, and humans 50%. The aimed of the present study was to evaluate the use of cholesterol-loaded cyclodextrin (CLC), a commercial diluent, in the kinetics and viability of frozen and thawed ram spermatozoa. Materials, Methods & Results: Five ejaculates, from five rams of Dorper breed were collected and divided into three groups: control, 1 mg CLC and 2 mg CLC. Semen was diluted in different concentrations of CLC (0, 1, and 2 mg/120×106 spermatozoa), and incubated at room temperature (21°C) for 10 min. Samples were conditioned in 0.5 mL straws and incubated at 5°C for 4 h, exposed to LN2 vapor for 10 min and storing a cryogenic container. The parameters as spermatic kinetics, plasma membrane, acrosomal membrane (MPAI, %), and intracellular levels of superoxide anion (O2-) were evaluated. Sperm progressive motility (PM), rapid spermatozoa percentage (RAP), linearity (LIN, %), average path velocity (VAP, μm/s) and MPAI (%) were more satisfactory with the use of 1 mg compared to 2 mg (P < 0.05). In addition, 1 mg CLC showed decreased levels of superoxide anion formation (O2-), a free radical detrimental to spermatozoa (P < 0.05). The use of 2 mg of CLC reduce VAP (P < 0.05) and did not have any beneficial effect on the evaluated parameters. Discussion: Authors did not observe improvement in the parameters of progressive motility when using 1 mg of CLC in goat semen and 2 mg in bull semen with the slow freezing protocol. This differs from our work, as we found that 1 mg of CLC improved the PM parameters, but not at the concentration of 2 mg CLC. Additionally, authors verified that cyclodextrin at 3 mg concentration was effective in protecting the sperm against the deleterious effects of H2O2. They obtained superior plasma membrane motility, viability, and integrity of the CLC-treated samples compared to the control group. The superoxide anion (O2-) is a free radical formed from molecular oxygen by the addition of an electron. It is generated spontaneously, mainly in the membrane of the mitochondria, by the respiratory chain and by flavoenzimes, lipoxygenases, and cicloxygenases. In our study, we found a difference between the study group with 1 mg CLC and the control group. Thus, we suggest that CLC may have a beneficial effect in stabilizing the sperm plasma membrane. Use of CLC at a concentration of 1 mg was found to be effective for the improvement of parameters of sperm progressive motility, rapid sperm percentage, and plasma and acrosomal membrane integrity. In addition, the study group with 1 mg of CLC showed decreased levels of superoxide anion formation, a free radical detrimental to spermatozoa

The use of açaí as a potential antioxidant for bovine semen cryopreservation

Semen cryopreservation is an important tool for animal reproduction due to its potential for fast dissemination of genetics from males with high genetic merit. However, cryopreservation protocols continue to provoke negative effects on sperm cell structure and function, thus leading to lower viability. This reduction in viability is correlated with excessive production of reactive oxygen species (ROS) that generate oxidative stress, which is responsible for lowering sperm motility, alteration in plasma membrane fluidity, and lipidic peroxidation. Due to these facts, it becomes necessary to add substances with the antioxidant potential for semen cryopreservation to confer additional protection to sperm cells. A variety of compounds from plants and fruits have been incorporated to such media due to their antioxidant potential. In such context, açaí has gained attention by researchers due to its substantial antioxidant capacity, particularly attributed to its polyphenolic fraction, which is rich in anthocyanins. Moreover, it also contains resveratrol and quercetin in its composition, which has activity against free radicals. In general terms, the antioxidant of natural sources (i.e., açaí) deserves special attention since it contributes to the preservation of the national flora, also displays a significant potential to improve the quality of frozen-thawed bovine semen

Comparação de diferentes métodos para avaliação da concentração espermática bovina: existem opções a serem comparadas ao NucleoCounter®? / Comparison of different methods to access bull sperm concentration: are there options to be compared to NucleoCounter®?

Diversos métodos podem ser utilizados para a determinação da concentração espermática, o que pode gerar variabilidade em estimativas conduzidas através de diferentes técnicas. Dentre as diferentes opções, o NucleoCounter® (NC) se destaca como método de maior acurácia para determinação da concentração de espermatozoides; no entanto, o alto custo do equipamento e seus insumos torna a técnica pouco acessível a muitos laboratórios de andrologia. Nesse contexto, o objetivo do trabalho foi comparar a sensibilidade de diferentes métodos para a determinação da concentração de espermatozoides bovinos. Para o estudo foram selecionados 120 ejaculados de diferentes touros. Após a coleta cada ejaculado foi submetido a análise de concentração espermática em três métodos distintos, NucleoCounter®, técnica espectrofotométrica (AccuRead®) e sistema portátil de análise computadorizada de sêmen (CASA, iSperm®). Os resultados gerados por cada avaliação foram submetidos à análise estatística descritiva, sendo as médias comparadas a através de análise de variância (PROC-GLM, SAS®). Menores concentrações espermáticas foram observadas a partir do teste espectrofotométrico (P&lt;0,0001), sendo constatada baixa concordância com os sistemas iSperm® e NC. No entanto, alta concordância foi observada para a estimativa da concentração espermática conduzida nos sistemas NC e iSperm®. Conclui-se que o sistema portátil de análise computadorizada representa uma alternativa ao NC para acesso a concentração espermática de touros

Efeito de meios diluidores na congelabilidade do semen canino/ Effect of diluting media on canine semen freezability

Este estudo teve como objetivo avaliar a eficácia de dois meios diluentes de congelação, para sêmen canino. Para tanto, foram utilizados 3 machos, adultos, de diferentes raças, com idades entre 2 a 5 anos e fertilidade comprovada. Realizaram-se 4 colheitas de sêmen de cada animal, pelo método de manipulação digital do bulbo peniano, priorizando a segunda fração do ejaculado. As amostras colhidas foram divididas em 2 grupos, com concentração de 80 x 106 espermatozoides por mL. As amostras foram centrifugadas a 600g por 10 minutos e em seguida, o pellet foi ressuspendido em meio de congelação. No grupo 1, foram diluídas em meio de TRIS-gema e no grupo 2, diluídas em meio de congelação comercial Botudog® (Botupharma Biotecnologia Animal). As amostras foram envasadas em palhetas de 0,25 mL na concentração de 40x106 espermatozoides viáveis. Em seguida, as amostras permaneceram por 1 hora em estabilização a 5ºC. Logo após, transferidas para o vapor de nitrogênio durante 20 minutos, e por fim, mergulhadas em nitrogênio e armazenadas em botijão criogênico. As palhetas foram descongeladas a 46ºC por 15 segundos e avaliados os parâmetros de cinética espermática, integridade de membrana plasmática e acrossomal (IMPA, %). Os parâmetros de motilidade total (%), motilidade progressiva (%), velocidade linear progressiva (VSL; µm/s), velocidade média da trajetória (VAP; µm/s), linearidade (%), percentagem de espermatozoides rápidos (%), integridade de membrana plasmática e acrossomal avaliados por citometria de fluxo foram superiores no grupo 2 (TRIS-gema). Desta forma, concluímos que o protocolo de congelação de sêmen canino, utilizando o diluente Botudog® apresenta melhores parâmetros de cinética e viabilidade espermática pós descongelação, quando comparados ao meio TRIS-gema

Efeito do meio diluidor e da dose inseminante sobre a congebilidade e fertilidade do sêmen bovino utilizado em programas de inseminação artificial em tempo-fixo(LATF)

A despeito das inúmeras variáveis que influenciam direta e indiretamente a fertilidade das fêmeas bovinas, a qualidade das amostras seminais exerce um papel importante na determinação das taxas de concepção dos programas de inseminação artificial. Os objetivos dessa pesquisa foram comparar a efetividade de dois diluidores de criopreservação de sêmen bovino no processamento de amostras seminais apresentando diferentes concentrações espermáticas em relação aos índices de congelabilidade determinados laboratorialmente (Experimento I) e as taxas de concepção proporcionadas por cada metodologia quando utilizada em programas de inseminação artificial em tempo fixo (IATF) em bovinos (Experimento II). No Experimento I foram utilizados 14 ejaculados de diferentes touros da raça Nelore. Cada ejaculado foi fracionado em oito alíquotas iguais, submetidas a criopreservação com os diluidores Tris-gema de ovo-frutose (meio TRIS) e MKA nas concentrações de 12, 25, 50 e 100 milhões de espermatozóides totais por mililitro de meio, formando oito grupos experimentais em função das variáveis diluidor e concentração. As amostras foram descongeladas a 46 ºC por 20 segundos, avaliando-se os padrões de motilidade através do método computadorizado (CASA), integridade de membrana plasmática (IMP), resistência ao teste de termorresistência rápido (TTR) e taxa de recuperação e IMP após seleção espermática pela técnica de swim-up. Para o Experimento II foram selecionados sete touros utilizados no Experimento I, obtendo-se um ejaculado de cada animal por eletroejaculação...Although there are many variables which directly or indirectly influence female bovine fertility, the quality of sperm samples plays a important role in the determination of conception rates in artificial insemination programs. The aim of the present study was to compare the efficiency of two bovine semen extenders for sperm freezing with different spermatic concentrations in the freezability determined by lab tests (Experiment I), and conception rates after fixed time artificial insemination (FTAI; Experiment II). In Experiment I 14 ejaculates of different Nelore bulls were used. Each ejaculate was splitsampled in to eight equal parts and then submitted to cryopreservation with Tris-egg yolk fructose (TRIS) and MKA extenders, at concentrations of 12, 25, 50 and 100 millions spermatozoa per milliliter forming eight experimental groups. The samples were thawed at 46 ºC for 20 seconds, and the following parameters were evaluated: sperm motility and movement (by computer-assisted semen analysis - CASA), sperm membrane integrity (SMI), resistance to the fast thermoresistance test (TT), recovery rate and sperm membrane integrity after sperm selection through swim-up technique. Seven of 14 bulls used in Experiment I were selected for Experiment II, and semen was collected from each of the animals by electroejaculation. The seven ejaculates obtained were mixed (semen pool) and cryopreserved, thus forming eight experimental groups according to the freezing extenders and sperm concentrations/straws: TRIS 12, 25, 50 and 100, and MKA 12, 25, 50 and 100...(Complete abstract, click electronic address below)Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP

Estudo comparativo de diferentes metodologiasde preservação do sêmen bovino para a utilização e programas de inseminação artificial em tempo-fixo(IATF)

O objetivo do estudo foi comparar a efetividade de três diluidores empregados para criopreservação e refrigeração do sêmen bovino em relação aos padrões de motilidade, integridade de membrana plasmática e acrossomal, índice de peroxidação lipídica e fertilidade nos programas de inseminação artificial em tempo-fixo (IATF). No Trabalho científico número 1 foi comparado a viabilidade e fertilidade pós-descongelação proporcionada pelos diluidores Tris-frutose (TRIS, Controle) e Botu-Bov® (BB), ambos contendo 20% de gema de ovo como fonte de lipoproteínas, frente à diluição em Botu- Bov®-Lecitina de Soja (meio BB-L) apresentando 1% de lecitina em substituição ao produto de origem animal. No Trabalho 2 foram avaliados os mesmos diluentes quando utilizados para a refrigeração do sêmen bovino por 48 horas a 5°C. Já no Trabalho número 3 foi avaliada a taxa de concepção na inseminação artificial (C/IA) proporcionada pelo sêmen bovino refrigerado por 24 horas em meio Botu-Bov® em comparação ao sêmen convencionalmente criopreservado no mesmo diluidor. Os meios TRIS e BB a base de gema de ovo foram mais efetivos na manutenção da viabilidade espermática pósdescongelação, conferindo melhores resultados de C/IA (P<0,05) em relação ao meio BBL. No entanto, quando utilizado o sêmen na forma líquida e refrigerado (Trabalho número 2) foi observada uma maior proteção contra o estresse oxidativo proporcionado pelo diluidor a base de lecitina de soja, resultando em maior probabilidade de prenhez quando comparado às amostras refrigeradas em TRIS ou BB, alcançando índice de concepção similar ao obtido com o sêmen congelado. A utilização do sêmen bovino refrigerado por 24 horas levou ao aumento da C/IA de vacas submetidas a IATF quando comparado ao sêmen congelado em meio Botu-Bov®. Conclui-se que embora a lecitina de soja represente...The aim of this study was to compare three different extenders used for cryopreservation of bovine semen, based on the results obtained during the cooling storage and post-thaw evaluation for motility patterns, integrity of plasmatic and acrossomal membranes, lipid peroxidation rate, as well as conception rate after fixed-time artificial insemination (FTAI). In Paper.1, the efficiency of Tris-Fructose extender (TRIS, control group), Botu-Bov® extender (BB), both containing 20% of egg yolk, and Botu-Bov®-Lecithin extender (BBL), which has 1% of soy lecithin instead of egg yolk, were compared in cryopreservation of bovine semen. In Paper.2, ejaculates from different bulls were cooled to 5°C for 48 hours using the same extenders of Paper.1. In Paper.3 the fertility trial was conducted either with frozen-thawed semen or cooled semen for 24 hours in the BB extender. The egg yolk extenders, TRIS and BB, demonstrated significant differences on the viability and the fertility of frozen-thawed bovine semen when compared to BB-L (P<0.05). However, the use of lecithin instead of egg yolk on semen extender resulted in a greater protection against oxidative stress; moreover, this extender improved the conception rates, reaching the results obtained in FTAI programs with frozen-thawed semen. The use of cooled bovine semen at 5°C for 24 hours improves the conception rate of Nelore cows submitted to FTAI. Although soy lecithin is an interesting alternative source of phospholipids in the elaboration of chemically defined extenders and decrease the risk of microbiological contamination, the egg yolk semen extenders are more effective in preserving the viability and fertility of frozen-thawed bovine semen. However, there was a higher production of free radicals in cooled semen with the use of egg yolk based extenders, resulting in lower conception rates when compared to frozen-thawed... (Complete abstract click electronic access below)Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP