Multiphoton microscopy can visualize zonal damage and decreased cellular metabolic activity in hepatic ischemia-reperfusion injury in rats

Ischemia-reperfusion (I/R) injury is a common occurrence in liver surgery. In orthotopic transplantation, the donor liver is exposed to periods of ischemia and when oxygenated blood is reintroduced to the liver, oxidative stress may develop and lead to graft failure. The aim of this project was to investigate whether noninvasive multiphoton and fluorescence lifetime imaging microscopy, without external markers, were useful in detecting early liver damage caused by I/R injury. Localized hepatic ischemia was induced in rats for 1 h followed by 4 h reperfusion. Multiphoton and fluorescence lifetime imaging microscopy was conducted prior to ischemia and up to 4 h of reperfusion and compared to morphological and biochemical assessment of liver damage. Liver function was significantly impaired at 2 and 4 h of reperfusion. Multiphoton microscopy detected liver damage at 1 h of reperfusion, manifested by vacuolated cells and heterogeneous spread of damage over the liver. The damage was mainly localized in the midzonal region of the liver acinus. In addition, fluorescence lifetime imaging showed a decrease in cellular metabolic activity. Multiphoton and fluorescence lifetime imaging microscopy detected evidence of early I/R injury both structurally and functionally. This provides a simple noninvasive technique useful for following progressive liver injury without external markers. (C) 2011 Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers (SPIE). [DOI: 10.1117/1.3647597

Augmenter of liver regeneration: An important intracellular survival factor for hepatocytes

Background/Aims: Augmenter of liver regeneration (ALR), a protein synthesized and stored in hepatocytes, is associated with mitochondria, and possesses sulfhydryl oxidase and cytochrome c reductase activities. We sought to determine the effects of ALR depletion in hepatocytes by antisense oligonucleotide transfection. Methods: Rat hepatocytes in primary culture were transfected with antisense oligonucleotide for ALR mRNA (ALR-AS) or scrambled oligonucleotide. Various analyses were performed at times up to 24 h after transfection. Results: Treatment with ALR-AS caused a decrease in ALR mRNA, cellular depletion of ALR protein primarily from mitochondria, and decreased viability. Flow cytometric analysis of ALR-AS-transfected hepatocytes stained with annexin-Vcy3 and 7-aminoactinomycin D revealed apoptosis as the predominant cause of death up to 6 h; incubation beyond this time resulted in necrosis in addition to apoptosis. ALR-AS-transfection caused release of mitochondrial cytochrome c, activation of caspase-3, profound reduction in the ATP content, and cellular release of LDH. Inhibition of caspase-3 inhibited the early phase of ALR-AS-induced death but not the late phase that included ALR and LDH release. Conclusions: These results suggest that ALR is critically important for the survival of hepatocytes by its association with mitochondria and regulation of ATP synthesis. © 2008 European Association for the Study of the Liver

Methacholine bronchial provocation measured by spirometry versus wheeze detection in preschool children

BACKGROUND: Determination of PC(20)-FEV(1) during Methacholine bronchial provocation test (MCT) is considered to be impossible in preschool children, as it requires repetitive spirometry sets. The aim of this study was to assess the feasibility of determining PC(20)-FEV(1) in preschool age children and compares the results to the wheeze detection (PCW) method. METHODS: 55 preschool children (ages 2.8–6.4 years) with recurrent respiratory symptoms were recruited. Baseline spirometry and MCT were performed according to ATS/ERS guidelines and the following parameters were determined at baseline and after each inhalation: spirometry-indices, lung auscultation at tidal breathing, oxygen saturation, respiratory and heart rate. Comparison between PCW and PC(20)-FEV(1) and clinical parameters at these end-points was done by paired Student's t-tests. RESULTS AND DISCUSSION: Thirty-six of 55 children (65.4%) successfully performed spirometry-sets up to the point of PCW. PC(20)-FEV(1) occurred at a mean concentration of 1.70+/-2.01 while PCW occurred at a mean concentration of 4.37+/-3.40 mg/ml (p < 0.05). At PCW, all spirometry-parameters were markedly reduced: FVC by 41.3+/-16.4% (mean +/-SD); FEV(1) by 44.7+/-14.5%; PEFR by 40.5+/-14.5 and FEF(25–75) by 54.7+/-14.4% (P < 0.01 for all parameters). This reduction was accompanied by de-saturation, hyperpnoea, tachycardia and a response to bronchodilators. CONCLUSION: Determination of PC(20)-FEV(1) by spirometry is feasible in many preschool children. PC(20)-FEV(1) often appears at lower provocation dose than PCW. The lower dose may shorten the test and encourage participation. Significant decrease in spirometry indices at PCW suggests that PC(20)-FEV(1) determination may be safer

Diverse Effects of FK506 on the Apoptosis of Hepatocytes and Infiltrating Lymphocytes in an Allografted Rat Liver.

BACKGROUND: The current study investigated whether FK506 (FK) regulates the apoptotic systems in allografted rat liver and the contribution of Fas/Fas-ligand system and Bcl-2 family during acute rejection. MATERIALS AND METHODS: The recipients were divided into three groups, the allo, the allo-FK, and the syn group. Rats were euthanized 1, 3, 5, and 7 d after OLT. Apoptotic activity was explored using terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling (TUNEL) assay. The expression of Fas/Fas-ligand and Bcl-2/Bax in the grafted livers was investigated by Western blotting and immunohistochemistry. RESULTS: The apoptotic index (AI) of hepatocytes in the allo-FK group was less than that in the allo group. Fas in the allo group was more intense than that in the allo-FK group in the periportal areas on day 1 and 3, while Bcl-2 in the allo group was less intense than that in the allo-FK group in the pericaval areas at all time-points after OLT. CONCLUSION: FK provides beneficial antiapoptotic effects on hepatocytes in the grafted rat livers through both the down-regulation of Fas expression in the periportal areas and the up-regulation of Bcl-2 expression in the pericaval areas

Etude des conséquences de l'ischémie-reperfusion sur le processus de mort cellulaire et de leurs correction

En chirurgie hépatique, pour limiter les pertes sanguines, la circulation doit être interrompue dans le territoire hépatique concerné. Les phases d'ischémie auxquelles succèdent les phases de reperfusion de l'organe entraînent des lésions cellulaires conduisant à la fois à la nécrose et à l'apoptose des tissus. Le travail présenté utilise deux modèles expérimentaux chez les rat et/ou la souris : un modèle original d'ischémie-reperfusion (I/R) permettant, chez un même animal, d'étudier les trois conditions (ischémie, ischémie-reperfusion, témoin) et un modèle, in vitro, d'hépatocytes en culture primaire, soumis à des variations de la pression partielle d'oxygène, simulant les conditions chirurgicales. Dans la première partie de ce travail, nous avons montré les conséquences de l'ischémie-reperfusion (ou de l'hypoxie-réoxygénation) sur l'activation des protéines de stress. Les Stress-Activated Protein Kinases (SAPKs) sont sensibles à l'environnement cellulaire et peuvent être activées par différents stress tels que les ultraviolets, les chocs osmotiques ou les radicaux libres. Dans nos conditions d'étude, mimant celles de la chirurgie hépatique, l'ischémie-reperfusion et l'hypoxie-réoxygénation augmentent l'activation de JNK1 (mesurée par immunoprécipitation in vitro et par immunohistolocalisation, in vivo), et le taux d'apoptose (mise en évidence par la détermination de l'activité enzymatique et Western blot de la caspase 3, par la fragmentation de l'ADN, in vitro et par immunohistolocalisation et TUNEL, in vivo). L'utilisation d'un inhibiteur de SAPKs, le SB202190 (35 æM), diminue l'activation de JNK ainsi que le taux d'apoptose mettant ainsi en évidence la participation de JNK dans le processus apoptotique. Au cours de l'ischémie-reperfusion, la concentration intracellulaire de calcium augmente et entraîne des dommages cellulaires. L'utilisation de diltiazem, un inhibiteur des canaux-voltages dépendants de type-L, capable également d'inhiber les canaux ROCCs (receptor-operated calcium channel) présents sur la membrane des hépatocytes, réduit l'activation de JNK et le taux d'apoptose. Le tacrolimus (FK506), immunosuppresseur utilisé après transplantation et connu pour ses propriétés hépatoprotectrices, diminue aussi l'activation de JNK et l'apoptose induites par les variations de PO2. Enfin, la technique d'ischémie intermittente, fréquemment utilisée en chirurgie, qui consiste à fragmenter la durée totale de l'ischémie (hypoxie) entraîne également une diminution de l'activation de JNK et du taux d'apoptose. La deuxième partie de ce travail porte sur la nécrose et étudie les chimiokines, molécules chimio-attractantes dont le rôle principal est d'attirer les leucocytes sur le lieu du stress cellulaire et qui sont impliquées dans les lésions d'ischémie-reperfusion du foie. Nous avons mesuré (par RNAse Protection Assay) la modulation de la sécrétion de chimiokines par l'hypoxie et l'hypoxie-réoxygénation sur des hépatocytes de souris en culture primaires, en présence ou non de TNFa (20 ng/ml) ou sur des cocultures hépatocytes/cellules de Kupffer. Dans nos conditions d'études, seuls les ARNm de MCP-1 (monocyte chemoattractant protein) et MIP-2 (macrophage inflammatory protein-2) sont transcrits. La présence de TNFa (20 ng/ml) ou les cocultures avec les cellules de Kupffer augmentent cette transcription. La sécrétion des chimiokines MCP-1 et MIP-2 est mesurée par la technique ELISA, sur le milieu de culture des hépatocytes, soumis à un stress d'hypoxie-réoxygénation en présence ou non de TNFa (20 ng/ml). Aucun protocole chirurgical (hypoxie intermittente ou preconditioning) ne réduit la transcription de MCP-1 et MIP-2. La troisième partie de ce travail porte sur la stéatose non alcoolique qui est une pathologie en progression. Les foies stéatosiques sont récusés pour transplantation et présentent une hypersensibilité à l'ischémie-reperfusion qui se traduit notamment par une mort cellulaire de type nécrose. Afin de déterminer les causes de cette hypersensibilité, nous avons étudié les variations de la concentration en ATP des cellules hépatiques. L'utilisation de tacrolimus limite la chute de l'ATP intracellulaire pendant l'ischémie permettant ainsi de diminuer la nécrose induite par l'ischémie-reperfusion et améliorant le taux de survie des rats Zucker obèses. Les perturbations induites par l'ischémie-reperfusion sont nombreuses et multifactorielles. Nous avons, dans ce travail, mis en évidence quelques unes d'entre elles et nous avons proposé des moyens de correction faciles à transposer chez l'homme, puisque utilisant des molécules et/ou des techniques déjà connues et maîtrisées. Nous espérons ainsi participer à l'amélioration de la prise en charge des patients.NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF