Physiopathological study of Crouzon syndrome with acanthosis nigricans related to FGFR3

Fibroblast Growth Factor Receptor 3 (Fgfr3) est un récepteur à activité tyrosine kinase. Sa fonction est de réguler la survie, la prolifération et la différenciation cellulaire dans de nombreux tissus.Les mutations gain-de-fonction du gène codant Fgfr3 sont responsables de deux types de maladies génétiques : les chondrodysplasies, caractérisées par des anomalies de la croissance des os longs, et les craniosynostoses, caractérisées par une fusion prématurée des sutures crâniennes. Les patients atteints de craniosynostoses liées à des mutations du gène Fgfr3 présentent également des troubles comportementaux et cognitifs.L’objectif de ma thèse fut de mieux comprendre la physiopathologie d’une forme particulière de craniosynostose, le syndrome de Crouzon avec Acanthosis Nigricans (CAN). Le CAN est une forme rare de craniosynostose associée à une mutation Fgfr3 spécifique (A391E). Il est caractérisé par une fusion prématurée des sutures coronales, une hypoplasie de l’étage moyen de la face et un acanthosis nigricans, une hyperpigmentation et un épaississement localisé de la peau. La prise en charge de ces patients est chirurgicale et nécessite des interventions séquentielles afin de permettre le bon développement du crâne et du cerveau.Dans un premier temps, j’ai étudié l’effet de la mutation A391E responsable du CAN sur la phosphorylation de la protéine FGFR3. Les expériences de transfections dans des cultures cellulaires ont montré que la mutation A391E affecte sa maturation et entraine une suractivation du récepteur en absence ou en présence de son ligand.En parallèle, nous avons généré le premier modèle murin CAN en insérant la mutation gain-de-fonction A385E dans le gène Fgfr3 de manière ubiquitaire (Fgfr3A385E/+). L’analyse du phénotype squelettique à l’aide d’études radiologique, morphométrique (sur scanners µCT) et histologique de ce modèle n’ont pas montré d’anomalies majeures au niveau du squelette et du crâne. En parallèle, nous nous sommes intéressés au cerveau de ces souris. Nos travaux ont permis de montrer que FGFR3 était exprimé et suractivé au niveau de l’hippocampe. Ils ont également permis d’observer des anomalies dans les processus de neurogenèse dans le gyrus denté de ces animaux. Afin d’étudier l’impact de la mutation A391E, nous avons réalisé des tests comportementaux. Nos expériences montrent que les souris Fgfr3A385E/+ présentaient des défauts cognitifs. Nous avons observé des défauts de mémoire importants tandis que l’anxiété était non affectée. Un effet antidépresseur a également été observé chez les mutants. Afin d’établir un lien entre ces anomalies cognitives et le récepteur Fgfr3 activé, nous avons traité ces animaux mutants à l’aide d’injections intraventriculaire cérébrale avec un inhibiteur spécifique de Fgfr3 (BGJ398). Ce traitement a permis de restaurer les défauts cognitifs et comportementaux observés précédemment.L’ensemble de ces travaux ont permis de mettre en évidence pour la première fois des anomalies du comportement dans un modèle murin FGFR3 de craniosynostose. Ils permettent de mieux comprendre le rôle joué par Fgfr3 à la fois dans le développement craniofacial et squelettique, mais également dans les processus de mémorisation et de réponses émotionnelles.Fibroblast Growth Factor 3 (Fgfr3) is a receptor with tyrosine kinase activity. Its purpose is to regulate survival, proliferation and differentiation of cells in various tissues.Gain-of-function mutations in Fgfr3 coding gene are responsible for two types of genetic diseases: chondrodysplasias, characterized by anomalies in long bones growth, and craniosynostoses, characterized by premature fusion of cranial sutures. Patients with craniosynostoses associated to Fgfr3 mutations also present behavioral and cognitive disorders.The aim of my thesis was to better understand the physiopathology of a particular form of craniosynostosis, Crouzon syndrome with Acanthosis Nigricans (CAN).CAN is a rare form of craniosynostosis associated to an Fgfr3 specific mutation (A391E). It is characterized by premature fusion of coronal sutures, midface hypoplasia and acanthosis nigricans, a hyperpigmentation and thickening of the skin. Management of these patients requires sequential interventions to allow proper development of the skull and brain.First, I studied the effect of the CAN related A391E mutation on FGFR3 protein phosphorylation. Cell transfection experiments showed that the A391E mutation affect protein maturation and cause an overactivation of receptor in absence or in presence of ligand.In parallel, we generated the first mouse model for CAN by inserting the gain-of-function A385E mutation in the Fgfr3 murine gene in a ubiquitous manner (Fgfr3A385E/+).Analysis of skeletal phenotype by radiography, morphometry (on µCT scanners) and histology of this model did not show major anomalies of the skull and skeleton. In parallel, we were also interested in the brain of these mice. Our work showed that FGFR3 was expressed and overactivated at the level of the hippocampus. It also allowed to observe anomalies in neurogenesis processes in the dentate gyrus of these animals. In order to study the impact of the A391E mutation, we performed behavioral tests. Our experiments showed that the Fgfr3A385E/+ mice presented cognitive disorders. We observed important memory defects while anxiety remained unchanged. An antidepressant effect was also observed in mutants. To establish a link between these cognitive anomalies and the activated Fgfr3 receptor, we treated the animals with cerebral intraventricular injection of a specific Fgfr3 inhibitor (BGJ398). This treatment allowed to restore the behavioral and cognitive defects previously observed.This work highlight for the first time behavior anomalies in a FGFR3 related craniosynostosis mouse model. It allow a better understanding of the role played by Fgfr3 in craniofacial and skeletal development as well as in memorization and learning processes and emotional responses

Etude de la physiopathologie du syndrome de Crouzon avec acanthosis nigricans lié à FGFR3

Fibroblast Growth Factor 3 (Fgfr3) is a receptor with tyrosine kinase activity. Its purpose is to regulate survival, proliferation and differentiation of cells in various tissues.Gain-of-function mutations in Fgfr3 coding gene are responsible for two types of genetic diseases: chondrodysplasias, characterized by anomalies in long bones growth, and craniosynostoses, characterized by premature fusion of cranial sutures. Patients with craniosynostoses associated to Fgfr3 mutations also present behavioral and cognitive disorders.The aim of my thesis was to better understand the physiopathology of a particular form of craniosynostosis, Crouzon syndrome with Acanthosis Nigricans (CAN).CAN is a rare form of craniosynostosis associated to an Fgfr3 specific mutation (A391E). It is characterized by premature fusion of coronal sutures, midface hypoplasia and acanthosis nigricans, a hyperpigmentation and thickening of the skin. Management of these patients requires sequential interventions to allow proper development of the skull and brain.First, I studied the effect of the CAN related A391E mutation on FGFR3 protein phosphorylation. Cell transfection experiments showed that the A391E mutation affect protein maturation and cause an overactivation of receptor in absence or in presence of ligand.In parallel, we generated the first mouse model for CAN by inserting the gain-of-function A385E mutation in the Fgfr3 murine gene in a ubiquitous manner (Fgfr3A385E/+).Analysis of skeletal phenotype by radiography, morphometry (on µCT scanners) and histology of this model did not show major anomalies of the skull and skeleton. In parallel, we were also interested in the brain of these mice. Our work showed that FGFR3 was expressed and overactivated at the level of the hippocampus. It also allowed to observe anomalies in neurogenesis processes in the dentate gyrus of these animals. In order to study the impact of the A391E mutation, we performed behavioral tests. Our experiments showed that the Fgfr3A385E/+ mice presented cognitive disorders. We observed important memory defects while anxiety remained unchanged. An antidepressant effect was also observed in mutants. To establish a link between these cognitive anomalies and the activated Fgfr3 receptor, we treated the animals with cerebral intraventricular injection of a specific Fgfr3 inhibitor (BGJ398). This treatment allowed to restore the behavioral and cognitive defects previously observed.This work highlight for the first time behavior anomalies in a FGFR3 related craniosynostosis mouse model. It allow a better understanding of the role played by Fgfr3 in craniofacial and skeletal development as well as in memorization and learning processes and emotional responses.Fibroblast Growth Factor Receptor 3 (Fgfr3) est un récepteur à activité tyrosine kinase. Sa fonction est de réguler la survie, la prolifération et la différenciation cellulaire dans de nombreux tissus.Les mutations gain-de-fonction du gène codant Fgfr3 sont responsables de deux types de maladies génétiques : les chondrodysplasies, caractérisées par des anomalies de la croissance des os longs, et les craniosynostoses, caractérisées par une fusion prématurée des sutures crâniennes. Les patients atteints de craniosynostoses liées à des mutations du gène Fgfr3 présentent également des troubles comportementaux et cognitifs.L’objectif de ma thèse fut de mieux comprendre la physiopathologie d’une forme particulière de craniosynostose, le syndrome de Crouzon avec Acanthosis Nigricans (CAN). Le CAN est une forme rare de craniosynostose associée à une mutation Fgfr3 spécifique (A391E). Il est caractérisé par une fusion prématurée des sutures coronales, une hypoplasie de l’étage moyen de la face et un acanthosis nigricans, une hyperpigmentation et un épaississement localisé de la peau. La prise en charge de ces patients est chirurgicale et nécessite des interventions séquentielles afin de permettre le bon développement du crâne et du cerveau.Dans un premier temps, j’ai étudié l’effet de la mutation A391E responsable du CAN sur la phosphorylation de la protéine FGFR3. Les expériences de transfections dans des cultures cellulaires ont montré que la mutation A391E affecte sa maturation et entraine une suractivation du récepteur en absence ou en présence de son ligand.En parallèle, nous avons généré le premier modèle murin CAN en insérant la mutation gain-de-fonction A385E dans le gène Fgfr3 de manière ubiquitaire (Fgfr3A385E/+). L’analyse du phénotype squelettique à l’aide d’études radiologique, morphométrique (sur scanners µCT) et histologique de ce modèle n’ont pas montré d’anomalies majeures au niveau du squelette et du crâne. En parallèle, nous nous sommes intéressés au cerveau de ces souris. Nos travaux ont permis de montrer que FGFR3 était exprimé et suractivé au niveau de l’hippocampe. Ils ont également permis d’observer des anomalies dans les processus de neurogenèse dans le gyrus denté de ces animaux. Afin d’étudier l’impact de la mutation A391E, nous avons réalisé des tests comportementaux. Nos expériences montrent que les souris Fgfr3A385E/+ présentaient des défauts cognitifs. Nous avons observé des défauts de mémoire importants tandis que l’anxiété était non affectée. Un effet antidépresseur a également été observé chez les mutants. Afin d’établir un lien entre ces anomalies cognitives et le récepteur Fgfr3 activé, nous avons traité ces animaux mutants à l’aide d’injections intraventriculaire cérébrale avec un inhibiteur spécifique de Fgfr3 (BGJ398). Ce traitement a permis de restaurer les défauts cognitifs et comportementaux observés précédemment.L’ensemble de ces travaux ont permis de mettre en évidence pour la première fois des anomalies du comportement dans un modèle murin FGFR3 de craniosynostose. Ils permettent de mieux comprendre le rôle joué par Fgfr3 à la fois dans le développement craniofacial et squelettique, mais également dans les processus de mémorisation et de réponses émotionnelles

Etude de la physiopathologie du syndrome de Crouzon avec acanthosis nigricans lié à FGFR3

Fibroblast Growth Factor 3 (Fgfr3) is a receptor with tyrosine kinase activity. Its purpose is to regulate survival, proliferation and differentiation of cells in various tissues.Gain-of-function mutations in Fgfr3 coding gene are responsible for two types of genetic diseases: chondrodysplasias, characterized by anomalies in long bones growth, and craniosynostoses, characterized by premature fusion of cranial sutures. Patients with craniosynostoses associated to Fgfr3 mutations also present behavioral and cognitive disorders.The aim of my thesis was to better understand the physiopathology of a particular form of craniosynostosis, Crouzon syndrome with Acanthosis Nigricans (CAN).CAN is a rare form of craniosynostosis associated to an Fgfr3 specific mutation (A391E). It is characterized by premature fusion of coronal sutures, midface hypoplasia and acanthosis nigricans, a hyperpigmentation and thickening of the skin. Management of these patients requires sequential interventions to allow proper development of the skull and brain.First, I studied the effect of the CAN related A391E mutation on FGFR3 protein phosphorylation. Cell transfection experiments showed that the A391E mutation affect protein maturation and cause an overactivation of receptor in absence or in presence of ligand.In parallel, we generated the first mouse model for CAN by inserting the gain-of-function A385E mutation in the Fgfr3 murine gene in a ubiquitous manner (Fgfr3A385E/+).Analysis of skeletal phenotype by radiography, morphometry (on µCT scanners) and histology of this model did not show major anomalies of the skull and skeleton. In parallel, we were also interested in the brain of these mice. Our work showed that FGFR3 was expressed and overactivated at the level of the hippocampus. It also allowed to observe anomalies in neurogenesis processes in the dentate gyrus of these animals. In order to study the impact of the A391E mutation, we performed behavioral tests. Our experiments showed that the Fgfr3A385E/+ mice presented cognitive disorders. We observed important memory defects while anxiety remained unchanged. An antidepressant effect was also observed in mutants. To establish a link between these cognitive anomalies and the activated Fgfr3 receptor, we treated the animals with cerebral intraventricular injection of a specific Fgfr3 inhibitor (BGJ398). This treatment allowed to restore the behavioral and cognitive defects previously observed.This work highlight for the first time behavior anomalies in a FGFR3 related craniosynostosis mouse model. It allow a better understanding of the role played by Fgfr3 in craniofacial and skeletal development as well as in memorization and learning processes and emotional responses.Fibroblast Growth Factor Receptor 3 (Fgfr3) est un récepteur à activité tyrosine kinase. Sa fonction est de réguler la survie, la prolifération et la différenciation cellulaire dans de nombreux tissus.Les mutations gain-de-fonction du gène codant Fgfr3 sont responsables de deux types de maladies génétiques : les chondrodysplasies, caractérisées par des anomalies de la croissance des os longs, et les craniosynostoses, caractérisées par une fusion prématurée des sutures crâniennes. Les patients atteints de craniosynostoses liées à des mutations du gène Fgfr3 présentent également des troubles comportementaux et cognitifs.L’objectif de ma thèse fut de mieux comprendre la physiopathologie d’une forme particulière de craniosynostose, le syndrome de Crouzon avec Acanthosis Nigricans (CAN). Le CAN est une forme rare de craniosynostose associée à une mutation Fgfr3 spécifique (A391E). Il est caractérisé par une fusion prématurée des sutures coronales, une hypoplasie de l’étage moyen de la face et un acanthosis nigricans, une hyperpigmentation et un épaississement localisé de la peau. La prise en charge de ces patients est chirurgicale et nécessite des interventions séquentielles afin de permettre le bon développement du crâne et du cerveau.Dans un premier temps, j’ai étudié l’effet de la mutation A391E responsable du CAN sur la phosphorylation de la protéine FGFR3. Les expériences de transfections dans des cultures cellulaires ont montré que la mutation A391E affecte sa maturation et entraine une suractivation du récepteur en absence ou en présence de son ligand.En parallèle, nous avons généré le premier modèle murin CAN en insérant la mutation gain-de-fonction A385E dans le gène Fgfr3 de manière ubiquitaire (Fgfr3A385E/+). L’analyse du phénotype squelettique à l’aide d’études radiologique, morphométrique (sur scanners µCT) et histologique de ce modèle n’ont pas montré d’anomalies majeures au niveau du squelette et du crâne. En parallèle, nous nous sommes intéressés au cerveau de ces souris. Nos travaux ont permis de montrer que FGFR3 était exprimé et suractivé au niveau de l’hippocampe. Ils ont également permis d’observer des anomalies dans les processus de neurogenèse dans le gyrus denté de ces animaux. Afin d’étudier l’impact de la mutation A391E, nous avons réalisé des tests comportementaux. Nos expériences montrent que les souris Fgfr3A385E/+ présentaient des défauts cognitifs. Nous avons observé des défauts de mémoire importants tandis que l’anxiété était non affectée. Un effet antidépresseur a également été observé chez les mutants. Afin d’établir un lien entre ces anomalies cognitives et le récepteur Fgfr3 activé, nous avons traité ces animaux mutants à l’aide d’injections intraventriculaire cérébrale avec un inhibiteur spécifique de Fgfr3 (BGJ398). Ce traitement a permis de restaurer les défauts cognitifs et comportementaux observés précédemment.L’ensemble de ces travaux ont permis de mettre en évidence pour la première fois des anomalies du comportement dans un modèle murin FGFR3 de craniosynostose. Ils permettent de mieux comprendre le rôle joué par Fgfr3 à la fois dans le développement craniofacial et squelettique, mais également dans les processus de mémorisation et de réponses émotionnelles

The PAX2-null immunophenotype defines multiple lineages with common expression signatures in benign and neoplastic oviductal epithelium.

The oviducts contain high-grade serous cancer (HGSC) precursors (serous tubal intraepithelial neoplasia or STINs), which are gamma-H2AXp - and TP53 mutation-positive. Although they express wild-type p53, secretory cell outgrowths (SCOUTs) are associated with older age and serous cancer; moreover, both STINs and SCOUTs share a loss of PAX2 expression (PAX2n ). We evaluated PAX2 expression in proliferating adult and embryonic oviductal cells, normal mucosa, SCOUTs, Walthard cell nests (WCNs), STINs, and HGSCs, and the expression of genes chosen empirically or from SCOUT expression arrays. Clones generated in vitro from embryonic gynaecological tract and adult Fallopian tube were Krt7p /PAX2n /EZH2p and underwent ciliated (PAX2n /EZH2n /FOXJ1p ) and basal (Krt7n /EZH2n /Krt5p ) differentiation. Similarly, non-ciliated cells in normal mucosa were PAX2p but became PAX2n in multi-layered epithelium undergoing ciliated or basal (WCN) cell differentiation. PAX2n SCOUTs fell into two groups: type 1 were secretory or secretory/ciliated with a 'tubal' phenotype and were ALDH1n and beta-cateninmem (membraneous only). Type 2 displayed a columnar to pseudostratified (endometrioid) phenotype, with an EZH2p , ALDH1p , beta-cateninnc (nuclear and cytoplasmic), stathminp , LEF1p , RCN1p , and RUNX2p expression signature. STINs and HGSCs shared the type 1 immunophenotype of PAX2n , ALDH1n , beta-cateninmem , but highly expressed EZH2p , LEF1p , RCN1p , and stathminp . This study, for the first time, links PAX2n with proliferating fetal and adult oviductal cells undergoing basal and ciliated differentiation and shows that this expression state is maintained in SCOUTs, STINs, and HGSCs. All three entities can demonstrate a consistent perturbation of genes involved in potential tumour suppressor gene silencing (EZH2), transcriptional regulation (LEF1), regulation of differentiation (RUNX2), calcium binding (RCN1), and oncogenesis (stathmin). This shared expression signature between benign and neoplastic entities links normal progenitor cell expansion to abnormal and neoplastic outgrowth in the oviduct and exposes a common pathway that could be a target for early prevention. Copyright (c) 2014 Pathological Society of Great Britain and Ireland. Published by John Wiley & Sons, Ltd

The SNARE protein SNAP-25 is required for normal exocytosis at auditory hair cell ribbon synapses

International audienceHearing depends on fast and sustained calcium-dependent synaptic vesicle fusion at the ribbon synapses of cochlear inner hair cells (IHCs). The implication of the canonical neuronal SNARE complex in this exocytotic process has so far remained controversial. We investigated the role of SNAP-25, a key component of this complex, in hearing, by generating and analyzing a conditional knockout mouse model allowing a targeted postnatal deletion of Snap-25 in IHCs. Mice subjected to IHC Snap-25 inactivation after hearing onset developed severe to profound deafness because of defective IHC exocytosis followed by ribbon degeneration and IHC loss. Viral transfer of Snap-25 in these mutant mice rescued their hearing function by restoring IHC exocytosis and preventing synapses and hair cells from degeneration. These results demonstrate that SNAP-25 is essential for normal hearing function, most likely by ensuring IHC exocytosis and ribbon synapse maintenance

The SNARE protein SNAP-25 is required for normal exocytosis at auditory hair cell ribbon synapses

Summary: Hearing depends on fast and sustained calcium-dependent synaptic vesicle fusion at the ribbon synapses of cochlear inner hair cells (IHCs). The implication of the canonical neuronal SNARE complex in this exocytotic process has so far remained controversial. We investigated the role of SNAP-25, a key component of this complex, in hearing, by generating and analyzing a conditional knockout mouse model allowing a targeted postnatal deletion of Snap-25 in IHCs. Mice subjected to IHC Snap-25 inactivation after hearing onset developed severe to profound deafness because of defective IHC exocytosis followed by ribbon degeneration and IHC loss. Viral transfer of Snap-25 in these mutant mice rescued their hearing function by restoring IHC exocytosis and preventing synapses and hair cells from degeneration. These results demonstrate that SNAP-25 is essential for normal hearing function, most likely by ensuring IHC exocytosis and ribbon synapse maintenance

The SNARE protein SNAP-25 is required for normal exocytosis at auditory hair cell ribbon synapses

International audienceHearing depends on fast and sustained calcium-dependent synaptic vesicle fusion at the ribbon synapses of cochlear inner hair cells (IHCs). The implication of the canonical neuronal SNARE complex in this exocytotic process has so far remained controversial. We investigated the role of SNAP-25, a key component of this complex, in hearing, by generating and analyzing a conditional knockout mouse model allowing a targeted postnatal deletion of Snap-25 in IHCs. Mice subjected to IHC Snap-25 inactivation after hearing onset developed severe to profound deafness because of defective IHC exocytosis followed by ribbon degeneration and IHC loss. Viral transfer of Snap-25 in these mutant mice rescued their hearing function by restoring IHC exocytosis and preventing synapses and hair cells from degeneration. These results demonstrate that SNAP-25 is essential for normal hearing function, most likely by ensuring IHC exocytosis and ribbon synapse maintenance

Theobroma cacao improves bone growth by modulating defective ciliogenesis in a mouse model of achondroplasia

International audienceAbstract A gain-of-function mutation in the fibroblast growth factor receptor 3 gene ( FGFR3 ) results in achondroplasia (ACH), the most frequent form of dwarfism. Constitutive activation of FGFR3 impairs bone formation and elongation and many signal transduction pathways. Identification of new and relevant compounds targeting the FGFR3 signaling pathway is of broad importance for the treatment of ACH, and natural plant compounds are prime drug candidate sources. Here, we found that the phenolic compound (-)-epicatechin, isolated from Theobroma cacao , effectively inhibited FGFR3’s downstream signaling pathways. Transcriptomic analysis in an Fgfr3 mouse model showed that ciliary mRNA expression was modified and influenced significantly by the Indian hedgehog and PKA pathways. (-)-Epicatechin is able to rescue mRNA expression impairments that control both the structural organization of the primary cilium and ciliogenesis-related genes. In femurs isolated from a mouse model ( Fgfr3 Y367C/+ ) of ACH, we showed that (-)-epicatechin eliminated bone growth impairment during 6 days of ex vivo culture. In vivo, we confirmed that daily subcutaneous injections of (-)-epicatechin to Fgfr3 Y367C/+ mice increased bone elongation and rescued the primary cilium defects observed in chondrocytes. This modification to the primary cilia promoted the typical columnar arrangement of flat proliferative chondrocytes and thus enhanced bone elongation. The results of the present proof-of-principle study support (-)-epicatechin as a potential drug for the treatment of ACH

FGFR3 overactivation in the brain is responsible for memory impairments in Crouzon syndrome mouse model

International audienceCrouzon syndrome with acanthosis nigricans (CAN, a rare type of craniosynostosis characterized by premature suture fusion and neurological impairments) has been linked to a gain-of-function mutation (p.Ala391Glu) in fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3). To characterize the CAN mutation's impact on the skull and on brain functions, we developed the first mouse model (Fgfr3 A385E/+) of this syndrome. Surprisingly, Fgfr3 A385E/+ mice did not exhibit craniosynostosis but did show severe memory impairments, a structurally abnormal hippocampus, low activity-dependent synaptic plasticity, and overactivation of MAPK/ERK and Akt signaling pathways in the hippocampus. Systemic or brain-specific pharmacological inhibition of FGFR3 overactivation by BGJ398 injections rescued the memory impairments observed in Fgfr3 A385E/+ mice. The present study is the first to have demonstrated cognitive impairments associated with brain FGFR3 overactivation, independently of skull abnormalities. Our results provide a better understanding of FGFR3's functional role and the impact of its gain-of-function mutation on brain functions. The modulation of FGFR3 signaling might be of value for treating the neurological disorders associated with craniosynostosis