Synthèse et réactivité de silylènes stables Si-fonctionnalisés (-Si-H, -Si-Cl, -Si-SnR3, Si-SiR3)

L'objectif principal de cette thèse est l'étude de silylènes stabilisés par coordination d'une phosphine. Cette étude porte plus particulièrement sur l'influence de la nature du ligand et du substituant porté par l'atome de silicium sur les propriétés de ces espèces. Le premier chapitre est une étude bibliographique qui permet de faire le point sur les différents modes de stabilisation des silylènes, avec une attention particulière portée aux complexes silylènes-base de Lewis. Le deuxième chapitre concerne la synthèse du premier hydrogénosilylène stabilisé par un ligand phosphine. En présence d'une oléfine, il donne lieu à une réaction d'hydrosilylation dans des conditions douces et sans catalyseur. Cette réaction d'insertion migratoire a été extrapolée à deux autres types de silylènes fonctionnalisés par des groupements silylés et stannylés. Il est intéressant de noter que dans le cas des silylènes stannylés, la réaction d'insertion est réversible dans des conditions douces. Cette réaction de Béta-élimination d'alcène sur le centre silicié démontre que les complexes de silylènes préparés présentent un comportement similaire à celui des complexes de métaux de transition. Le troisième chapitre est consacré à l'étude de la dimérisation des complexes de silylènes, en jouant sur l'encombrement stérique des substituants portés par l'azote et/ou le phosphore. La diminution de la protection cinétique du centre Si(II) conduit à la formation de silylènes moins stables qui se dimérisent via un processus original, impliquant une activation réversible d'une liaison Si-H ou Si-Cl. Dans le quatrième chapitre est développée l'étude de la réactivité d'un C-phosphino-silyne. L'implication du groupement phosphino dans la stabilisation de la triple liaison SiC, induit un comportement de dipôle-1,3, qui a été mis à profit dans des réactions de cycloaddition [3+2] avec le benzonitrile. Les cycloadduits obtenus présentent une structure électronique similaire aux carbodiphosphoranes cycliques avec un caractère nucléophile très important.The main objective of this thesis concerns the study of silylenes stabilized by coordination of a phosphine ligand. Particularly, this study is focused on the influence of the nature of the ligand and the silicon substituents on the properties of these phosphine-silylene complexes. The first part of this thesis is a review concerning the different modes known about the stabilization of the silylene moiety, with a particular focus on silylene-Lewis base complexes. The second chapter deals with the first synthesis of phosphine-stabilized hydrogenosilylenes. In the presence of an olefin, an original hydrosilylation reaction was observed in mild conditions and without any catalyst. Functionalized silyl- and stannyl-silylenes also react readily with olefins through an insertion migration process, which is perfectly reversible in the case of the stannylsilylene derivative. This Béta-elimination reaction of the olefin at the silicon center demonstrates that phosphine-stabilized silylenes can behave in some cases like transition metal complexes. The third chapter is devoted to the study of the dimerization process of phosphine-silylene complexes, playing on the steric hindrance of nitrogen and phosphorus substituents. A lower kinetic protection of the Si(II) center led to unstable silylenes, which dimerise through an original and reversible Si-H or Si-Cl bond activation. In the fourth chapter is reported a study concerning the reactivity of a C-phosphino-silyne. Due to the implication of the phosphino group on the stabilization of the SiC-triple bond, this molecule can behave as a 1,3-dipole, and reacts readily with benzonitrile through a [3+2] cycloaddition process. The corresponding cycloadducts can be related to cyclic carbodiphosphoranes, particularly concerning the electronic properties, and therefore they present a strong nucleophilic character

Projet d’implantation de nouveaux outils diagnostiques (échographie, radiographie, biologie délocalisée, télé-expertise) sur l’île de Porquerolles : évaluation théorique de l’impact sur la fréquence des évacuations médicales de l’île

La médecine sur l’île de Porquerolles revêt de nombreuses spécificités ayant pour dénominateur commun la présence d’une frontière maritime l’isolant du maillage organisationnel standard du parcours de soin d’un patient. Faisant suite à un travail connexe ayant permis de comprendre les causes, modalités et les conséquences médico-économiques des évacuations médicales de Porquerolles, cette nouvelle recherche s’est intéressée aux outils qui pourraient permettre, en théorie, d’en diminuer la fréquence.A ce titre, les rôles théoriques de la radiographie, de l’échographie, de la biologie délocalisée et de la télé-expertise ont été analysés au travers d’une étude prospective observationnelle ayant été menée de mai à novembre 2018.Celle-ci a mis en avant les avantages et les inconvénients inhérents à la mise en place potentielle de chacun de ces nouveaux outils sur l’île de Porquerolles.Son objectif in fine ayant été l’amélioration de la prise en charge des patients sur l’île tout en diminuant les dépenses collectives de santé

Characterization of the effects of IL-17F on CHO cell line generation

CHO is the most commonly used mammalian host for the generation of cell lines allowing for the production of high quality therapeutic proteins. The generation of such cell lines is a lengthy and resource-intensive process requiring extensive screening in order to isolate candidates with optimal characteristics, such as growth, stability and productivity. For this reason, the biotechnology industry invests much effort in attempts to optimize CHO expression systems in order to streamline and shorten the cell line selection process. Based on preliminary observations of a facilitated selection of CHO-GS cell lines expressing members of the IL-17 cytokine family, this study investigates the use of IL-17F as a novel enhancing factor for CHO cell line generation. Using two different CHO expression systems (exploiting GS and DHFR-based selection), we demonstrated that IL-17F expression caused a significant increase in the occurrence of colonies during the selection process. All colonies selected produced substantial amounts of IL-17F, suggesting that benefits were conferred, during selection, to those cells expressing the cytokine. Furthermore, transgene expression levels were significantly increased when the selection pressure was raised to a level that would not normally be permissive for colony selection (i.e. 100 |o.M MSX for the CHO-GS expression system or 1000 nM MTX for the CHO-DHFR system). Finally, IL-17F expression was also found to enhance the rate of appearance of clones during single cell subcloning in the absence of selection pressure. Overall, these benefits have the potential to allow a substantial reduction in the length of cell line generation while significantly increasing cell line productivity. Nevertheless, we found that the high IL-17F expression levels required to convey enhancing effects was a limitation when attempting to co-express IL-17F and a recombinant soluble protein of therapeutic interest from independent CMV promoters within the same expression vector. In order to understand and overcome this limitation, studies were designed to characterize the IL-17F enhancing effect at the molecular and cellular level. Regular supplementation of recombinant biologically-active IL-17F into the culture medium during cell line selection was not able to reproduce the enhancing effects of endogenous IL-17F expression. In addition, increased IL-17F expression correlated with increased CHO-GS selection transgene expression at the single cell level. This data suggested a possible effect of IL-17F on viral promoter activity or transgene mRNA stability. It also provided direct evidence that the cells expressing the highest amounts of IL-17F obtained the most benefit. Overall data obtained from these study implied that IL-17F may act through an intracellular mechanism, possibly exerted during secretion. We therefore initiated experiments designed to determine the specific compartment(s) within which IL-17F triggers its effect. This work has identified IL-17F as a potentially powerful tool to optimize the CHO cell line generation process. The characterization of this enhancing effect at the molecular level has given us several insights into overcoming the current limitations, thus paving the way for the development of a viable technology that can be exploited within the biotechnology industry. - La CHO est la cellule hôte de mammifere la plus couramment utilisée dans la création de lignée cellulaire produisant des protéines thérapeutiques de haute qualité. La génération de ces lignées cellulaires est un processus long et exigeant l'utilisation de techniques de sélection robustes afin d'isoler des candidats possédants les caractéristiques optimales de croissance, de productivité et de stabilité d'expression. Les industries biopharmaceutiques ont investi beaucoup d'efforts afin d'optimiser les systèmes d'expression CHO dans le but raccourcir la longueur du procédé de sélection de lignées cellulaires et aussi d'en augmenter l'efficacité. A partir d'observations préliminaires obtenues lors de la génération de lignées cellulaires CHO- GS exprimant une cytokine appartenant à la famille des IL-17, nous avons réalisé une étude portant sur l'utilisation de l'IL-17F humaine (IL-17F) comme nouveau facteur d'optimisation pour la génération de lignées cellulaires CHO. Nous avons démontré, en utilisant les deux systèmes de sélection et d'expression CHO couramment utilisés (le premier exploitant la GS et l'autre basée sur la DHFR), que l'expression de l'IL-17F permet une augmentation significative de la fréquence d'apparition de colonies durant le processus de sélection de lignées cellulaires. Les différentes colonies sélectionnées expriment des quantités substantielles d'IL-17F, suggérant un effet bénéfique lors de la sélection qui serait exclusivement conféré aux cellules exprimant la cytokine. En outre, le niveau d'expression du transgene se trouve significativement augmenté lorsque la pression de sélection est portée à un niveau habituellement trop élevé pour permettre la sélection de colonies (soit 100 |JM MSX pour le système d'expression CHO-GS ou 1000 nM MTX pour le système CHO- DHFR). Enfin, l'expression d'IL-17F permet également d'améliorer la vitesse d'apparition de clones pendant une étape de sous-clonage en l'absence de pression de sélection. L'ensemble de ces effets bénéfiques permettent une réduction substantielle de la durée de génération de lignées cellulaires tout en augmentant considérablement la productivité des lignées obtenues. Néanmoins, nous avons constaté que la nécessité d'exprimer des niveaux élevés d'IL-17F afin obtenir l'ensemble de ses effets bénéfiques devient une contrainte lors de l'utilisation d'un vecteur d'expression composé de deux promoteurs CMV indépendants pour la co-expression de la cytokine et d'une protéine soluble présentant un intérêt thérapeutique. Afin de mieux comprendre et de surmonter cette limitation, plusieurs études ont été effectuées dans le but de mieux caractériser l'effet de IL-17F au niveau subcellulaire. L'apport régulier en IL-17F recombinante et biologiquement active dans le milieu de culture lors de la sélection de lignées cellulaires ne permet pas de reproduire les effets bénéfiques observés par l'expression endogène d'IL-17F. En outre, nous avons constaté que, lors de l'utilisation du système CHO- GS, l'augmentation d'expression de 1TL-17F est corrélée à un accroissement de l'expression du marqueur de sélection au niveau cellulaire. Ces résultats suggèrent un possible effet d'IL- 17F sur l'activité des promoteurs viraux et ainsi fournissent une preuve directe que les cellules exprimant de haut niveau d'IL-17F sont celles qui en profitent le plus. L'ensemble de ces observations mettrait en avant que l'effet d'IL-17F se ferait selon un mécanisme intracellulaire. Nous avons donc étudié le(s) compartiment(s) spécifique(s) dans lequel IL-17F pourrait exercer son effet. Ce travail a permis de définir IL-17F comme un puissant outil pour l'optimisation des procédés de génération de lignées cellulaires CHO. La caractérisation de cette amélioration de l'effet au niveau moléculaire nous a donné plusieurs indications sur la manière de dépasser les limitations actuelles, ouvrant ainsi la voie au développement d'une technologie viable qui peut être exploitée pars l'industrie biotechnologique

Projet d’implantation de nouveaux outils diagnostiques (échographie, radiographie, biologie délocalisée, télé-expertise) sur l’île de Porquerolles : évaluation théorique de l’impact sur la fréquence des évacuations médicales de l'île

Medicine on the island of Porquerolles has many specificities having as a common denominator a maritime boundary keeping her away from the traditional care system.Following a related work that allowed to understand causes, modalities and medico-economics consequences of medical evacuations from Porquerolles, this new research was interested in tools allowing in theory an incidence decrease of these evacuations.As such, the theoretical roles of radiography, ultrasound, point-of-care blood testing and telemedicine were analyzed through a prospective observational study that was conducted from May to November 2018.It highlighted the advantages and disadvantages inherent to the potential implementation of each of these new tools on the island of Porquerolles.Its ultimate goal has been to improve the care of patients on the island while reducing collective health expenditureLa médecine sur l’île de Porquerolles revêt de nombreuses spécificités ayant pour dénominateur commun la présence d’une frontière maritime l’isolant du maillage organisationnel standard du parcours de soin d’un patient.Faisant suite à un travail connexe ayant permis de comprendre les causes, modalités et les conséquences médico-économiques des évacuations médicales de Porquerolles, cette nouvelle recherche s’est intéressée aux outils qui pourraient permettre, en théorie, d’en diminuer la fréquence.A ce titre, les rôles théoriques de la radiographie, de l’échographie, de la biologie délocalisée et de la télé-expertise ont été analysés au travers d’une étude prospective observationnelle ayant été menée de mai à novembre 2018.Celle-ci a mis en avant les avantages et les inconvénients inhérents à la mise en place potentielle de chacun de ces nouveaux outils sur l’île de Porquerolles.Son objectif in fine ayant été l’amélioration de la prise en charge des patients sur l’île tout en diminuant les dépenses collectives de santé

Synthèse et réactivité de silylènes stables Si-fonctionnalisés (-Si-H, -Si-Cl, -Si-SnR3, Si-SiR3)

TOULOUSE3-BU Sciences (315552104) / SudocSudocFranceF

Synthesis of a phosphine-stabilized silicon(II) hydride and its addition to olefins: A catalyst-free hydrosilylation reaction

No cat.s allowed: A stable and isolable tricoordinate silicon(II) hydride stabilized by a phosphine ligand was successfully synthesized and fully characterized (see structure, Si green, P yellow, N blue, C gray, H white). Interestingly, this silicon hydride adds to olefins in an unprecedented catalyst-free hydrosilylation reaction in very mild conditions.We are grateful to the CNRS and the ANR (NOPROBLEM) for support of this work. R.R. acknowledges the Ministerio de Educación (MEC, Spain) for a postdoctoral fellowship.Peer reviewe

IL-17F co-expression improves cell growth characteristics and enhances recombinant protein production during CHO cell line engineering.

The generation of a high productivity cell line is a critical step in the production of a therapeutic protein. Many innovative engineering strategies have been devised in order to maximize the expression rate of production cells for increased process efficiency. Less effort has focused on improvements to the cell line generation process, which is typically long and laborious when using mammalian cells. Based on unexpected findings when generating stable CHO cell lines expressing human IL-17F, we studied the benefit of expressing this protein during the establishment of production cell lines. We demonstrate that IL-17F expression enhances the rate of selection and overall number of selected cell lines as well as their transgene expression levels. We also show that this benefit is observed with different parental CHO cell lines and selection systems. Furthermore, IL-17F expression improves the efficiency of cell line subcloning processes. IL-17F can therefore be exploited in a standard manufacturing process to obtain higher productivity clones in a reduced time frame

Development of a new ELISA for serum periostin: evaluation of growth-related changes and bisphosphonate treatment in mice

Periostin is a gamma-carboxyglutamic acid protein preferentially expressed in periosteum and bone mesenchymal stem cells. Lack of a precise assay for measuring circulating levels impairs the investigation of its biological significance. We developed a new ELISA and studied changes of periostin levels both locally at the bone site and systemically in circulating blood during growth and after bisphosphonate-induced inhibition of bone remodeling in the mouse. The ELISA we developed is based on an affinity-purified polyclonal antibody that was raised against the C-terminal sequence of mouse periostin. Reproducibility, repeatability, precision, and accuracy tests met standards of acceptance. Serum periostin and levels of the bone turnover markers osteocalcin, PINP, CTX-I, and TRAP5b were measured in (1) 4-, 6-, 8-, 10-, and 12-week-old wild-type female Balb/c mice and (2) adult ovariectomized female Balb/c mice treated with zoledronic acid or vehicle. Serum periostin decreased during growth and stabilized from 8 weeks and older, its levels correlating with bone turnover markers. Immunohistochemistry in bones from different growth stages showed that periostin localized specifically at the sites of endochondral and intramembranous ossification, especially at the periosteal envelopes. Zoledronic acid induced a marked decrease in bone remodeling markers but did not alter serum periostin levels or periostin immunostaining pattern. The novel ELISA is highly specific and allows accurate and precise measurements of serum periostin levels in mice

Large area CMOS bio-pixel array for compact high sensitive multiplex biosensing

International audienc

Fasting enhances the response of arcuate neuropeptide Y-glucose-inhibited neurons to decreased extracellular glucose

Fasting increases neuropeptide Y (NPY) expression, peptide levels, and the excitability of NPY-expressing neurons in the hypothalamic arcuate (ARC) nucleus. A subpopulation of ARC-NPY neurons (∼40%) are glucose-inhibited (GI)-type glucose-sensing neurons. Hence, they depolarize in response to decreased glucose. Because fasting enhances NPY neurotransmission, we propose that during fasting, GI neurons depolarize in response to smaller decreases in glucose. This increased excitation in response to glucose decreases would increase NPY-GI neuronal excitability and enhance NPY neurotransmission. Using an in vitro hypothalamic explant system, we show that fasting enhances NPY release in response to decreased glucose concentration. By measuring relative changes in membrane potential using a membrane potential-sensitive dye, we demonstrate that during fasting, a smaller decrease in glucose depolarizes NPY-GI neurons. Furthermore, incubation in low (0.7 mM) glucose enhanced while leptin (10 nM) blocked depolarization of GI neurons in response to decreased glucose. Fasting, leptin, and glucose-induced changes in NPY-GI neuron glucose sensing were mediated by 5′-AMP-activated protein kinase (AMPK). We conclude that during energy sufficiency, leptin reduces the ability of NPY-GI neurons to sense decreased glucose. However, after a fast, decreased leptin and glucose activate AMPK in NPY-GI neurons. As a result, NPY-GI neurons become depolarized in response to smaller glucose fluctuations. Increased excitation of NPY-GI neurons enhances NPY release. NPY, in turn, shifts energy homeostasis toward increased food intake and decreased energy expenditure to restore energy balance