Biomass accumulation and fruit quality: the role of invertases in characters of biotechnological interest

Las invertasas son β-D-fructofuranosidasas (EC 3.2.1.26) que hidrolizan la sacarosa irreversiblemente a glucosa y fructosa. Hasta la fecha, se han identificado diferentes isoformas de invertasas que se clasificaron según su localización sub-celular en: a) solubles, las cuales se encuentran en citosol o vacuola, o b) insolubles, las cuales están unidas a componentes de la pared celular. En el marco de esta tesis doctoral se analizó el papel de dos enzimas invertasas, una vacuolar (At1g12240-Inv-vac) y una citosólica (Solyc04g081440-Slalk/ne-INV) en la acumulación de biomasa y distribución y composición del carbono en plantas superiores utilizando como modelo Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum, respectivamente. A través de mapeo de QTLs se demostró que una invertasa vacuolar (Inv-vac) juega un rol determinante en el largo radicular en Arabidopsis. El objetivo del presente trabajo en entender el mecanismo fundamental de este QTL a través del análisis de las diferencias estructurales y funcionales de Inv-vac en dos genotipos parentales (Ler y CVI) y dos líneas introgresadas (N-14 y N-15) portando segmentos genómicos individuales de CVI, conteniendo al locus At1g12240, en el fondo genético de Ler. Se analizó la abundancia relativa de los transcriptos por qRT-PCR la cual mostro patrones de expresión similares entre ambos ecotipos. Sin embargo, el análisis de secuencia de ADN revelo varios polimorfismos que provocan cambios en la secuencia de la proteína correspondiente entre ellos. A su vez, ensayos de actividad en extractos de proteínas totales mostraron mayor actividad invertasa en los genotipos conteniendo el alelo de CVI mientras que los ensayos cinéticos utilizando proteínas recombinantes purificadas revelaron Km similares para ambos alelos y una Vmax ligeramente mayor para el alelo Ler. Tratamientos de extractos de plántulas con agitación y temperatura para minimizar la actividad de posibles inhibidores de invertasa provocaron un aumento importante en la actividad de Ler sin modificar la actividad de los genotipos conteniendo el alelo CVI. Análisis de qRT-PCR de dos inhibidores de invertasa vacuolar en plántulas de los 4 genotipos revelo patrones de expresión diferencial entre ellos. En conjunto, los resultados obtenidos demuestran que el QTL de invertasa vacuolar afecta la acumulación de biomasa radicular y la partición de carbono a través de una regulación diferencial de los inhibidores a nivel ARNm. Para el caso de Solanum lycopersicum, se obtuvieron plantas transgénicas silenciadas por ARNi para el gen que codifica para una invertasa alcalina neutra (Slalk/ne-INV) y se realizó una fenotipificación de las plantas que mostraron diferencias contrastantes con respecto al wild type, mayormente en la aparición de flores y seteo de frutos. A su vez, a través del análisis de acumulación de mensajero por qRT-PCR se observó un aumento de los niveles de expresión de LIN4 durante el desarrollo de los frutos que da cuenta de la importancia de esta enzima en los órganos destino. Los niveles de los principales carbohidratos solubles se midieron a lo largo de un periodo diurno en hojas fuente y la actividad de enzimas centrales del metabolismo de carbono fueron medidas en hojas y frutos rojos de las líneas transgénicas. Por otra parte, se obtuvieron perfiles metabólicos de hojas y frutos de las plantas transgénicas aplicando GC-MS y se realizaron experimentos de acumulación de ARNm por secuenciación masiva (RNAseq). El análisis conjunto de los datos de RNAseq y metabolómica muestran que el silenciamiento de la enzima Slalk/ne-INV genera un aumento de la expresión de genes involucrados principalmente en respuesta a estrés, defensa y muerte celular programada apoyando la idea de un papel principal de esta enzima sobre el metabolismo global de la planta, el crecimiento y la reproducción vinculando la adaptación al estrés, con los azucares y las señales del desarrollo.Invertases are β-D-fructofuranosidases (EC 3.2.1.26) which hydrolyzes sucrose into glucose and fructose irreversibly. To date, different isoforms of invertase have been identified that were classified according to their subcellular localization: a) soluble, which are in cytosol or vacuole, or b) insoluble, which are attached to components of the cell wall. As part of this thesis we analyzed the role of two invertases, a vacuolar (At1g12240-Inv-vac) and a cytosolic (Solyc04g081440-Slalk/ne-INV) in biomass accumulation and distribution and composition of carbon in higher plants using as models Arabidopsis thaliana and Solanum lycopersicum, respectively. By Quantitative Trait Locus (QTL) mapping it has been demonstrated that a vacuolar invertase (vac-Inv) plays a key role determining the radical length in Arabidopsis. In this model, variation in vac-Inv activity was detected in a Near Isogenic Line (NIL) population derived from a cross between two divergent accessions; Landsberg erecta (Ler) and Cape Verde Island (CVI), with the CVI allele conferring both higher Inv activity and longer radicles. The aim of the current work is to understand the mechanism(s) underlying this QTL by analyzing structural and functional differences of vac-Inv from both accessions. Relative transcript abundance analyzed by qRT-PCR showed similar expression patterns in both accessions, however, DNA sequence analyses revealed several polymorphisms that lead to changes in the corresponding protein sequence between them. Moreover, activity assays revealed higher vac-Inv activity in genotypes carrying the CVI allele than the Ler one. Analyses of purified recombinant proteins showed a similar Km for both alleles and a slightly higher Vmax for the Ler one. Treatment of plant extracts with foaming to release possible interacting invertase inhibitory protein/s (Inv-inh) led to a large increase in activity for the Ler-allele, but no changes for genotypes carrying the CVI one. qRT-PCR analyses of two vac-Inv inhibitors in seedlings from parental and NILs genotypes revealed different expression patterns between them. Taken together these results demonstrate that the vac-INV-QTL affects root biomass accumulation and also carbon partitioning through a differential regulation of the vac-Inv inhibitors at the mRNA level. In the case of Solanum lycopersicum, a RNA interference (RNAi) approach was followed to generate transgenic plants silencing the LIN4 (Slalk/ne-INV) expression and phenotypic analyses were made over the plants that showed differences in respect to the wild type line mainly in flower appearance and fruit set. At the same time, through the analyses of mRNA accumulation by qRT-PCR an increase in the expression levels of LIN4 was observed during fruit development which point to the importance of this enzyme in sink organs and during tomato fruit development. The content of the main soluble carbohydrates were measured along a diurnal period in source leaves and the activity of enzymes from central metabolism were measured in leaves and ripe fruits of transgenic lines. Moreover, metabolic profiles were obtained by GC-MS over leaves and fruits of transgenic lines and RNA accumulation experiments were performed by high throughput sequencing (RNAseq). Taken together, the RNAseq and metabolomic data show that the silenced of the Slalk/ne-INV enzyme generates an increased expression of genes involved primarily in response to stress, defense and programmed cell death supporting the idea of a major role of this enzyme on the overall plant metabolism, growth and reproduction linking adaptation to stress, with sugars and developmental signals.Fil: Coluccio Leskow, Carla. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Recognition of saccharides in the NIR region with a novel fluorogenic boronolectin: in vitro and live cell labeling

This work describes a novel mono-boronic acid derivative of a tricarbocyanine. The probe is a genuine near-infrared fluorescence emitter with improved properties such as a large Stokes shift, excellent water solubility and sensitive fluorogenicity upon binding to carbohydrates under physiological conditions.Fil: Samaniego Lopez, Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Centro de Investigaciones en Hidratos de Carbono. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Centro de Investigaciones en Hidratos de Carbono; ArgentinaFil: Lago Huvelle, María Amparo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Uhrig, Maria Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Centro de Investigaciones en Hidratos de Carbono. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Centro de Investigaciones en Hidratos de Carbono; ArgentinaFil: Coluccio Leskow, Federico. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Spagnuolo, Carla Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Centro de Investigaciones en Hidratos de Carbono. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Centro de Investigaciones en Hidratos de Carbono; Argentin

A silica supported tricarbocyanine based pH nanosensor with a large Stokes shift and a near infrared fluorescence response: performance in vitro and in live cells

We report the synthesis of a near-infrared (NIR) fluorescent pHprobe with a remarkable Stokes shift reported (∼ 135 nm) basedon a tricarbocyanine (Cy-PIP). The fluorescent molecule wasanchored to SiO2 nanoparticles (Cy-PIP@SiO2) and is capable ofmonitoring pH changes within the physiological range (pH 6-8).The Cy-PIP@SiO2 nanoparticles were succesfully internalized byHeLa cells as shown by fluorescence confocal microscopy, whileflow cytometry revealed pH fluctuations during the endocytic pathway.Fil: Toum Terrones, Yamili. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Comisión Nacional de Energía Atómica. Centro Atómico Constituyentes; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física; ArgentinaFil: Coluccio Leskow, Federico. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Bordoni, Andrea Veronica. Comisión Nacional de Energía Atómica. Centro Atómico Constituyentes; ArgentinaFil: Acebedo, Sofía Lorena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Centro de Investigaciones en Hidratos de Carbono. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Centro de Investigaciones en Hidratos de Carbono; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Orgánica; ArgentinaFil: Spagnuolo, Carla Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Centro de Investigaciones en Hidratos de Carbono. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Centro de Investigaciones en Hidratos de Carbono; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Orgánica; ArgentinaFil: Wolosiuk, Alejandro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Comisión Nacional de Energía Atómica. Centro Atómico Constituyentes; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física; Argentin

Allelic differences in a vacuolar invertase affect arabidopsis growth at early plant development

Improving carbon fixation in order to enhance crop yield is a major goal in plant sciences. By quantitative trait locus (QTL) mapping, it has been demonstrated that a vacuolar invertase (vac-Inv) plays a key role in determining the radical length in Arabidopsis. In this model, variation in vac-Inv activity was detected in a near isogenic line (NIL) population derived from a cross between two divergent accessions: Landsberg erecta (Ler) and Cape Verde Island (CVI), with the CVI allele conferring both higher Inv activity and longer radicles. The aim of the current work is to understand the mechanism(s) underlying this QTL by analyzing structural and functional differences of vac-Inv from both accessions. Relative transcript abundance analyzed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) showed similar expression patterns in both accessions; however, DNA sequence analyses revealed several polymorphisms that lead to changes in the corresponding protein sequence. Moreover, activity assays revealed higher vac-Inv activity in genotypes carrying the CVI allele than in those carrying the Ler allele. Analyses of purified recombinant proteins showed a similar K (m) for both alleles and a slightly higher V (max) for that of Ler. Treatment of plant extracts with foaming to release possible interacting Inv inhibitory protein(s) led to a large increase in activity for the Ler allele, but no changes for genotypes carrying the CVI allele. qRT-PCR analyses of two vac-Inv inhibitors in seedlings from parental and NIL genotypes revealed different expression patterns. Taken together, these results demonstrate that the vac-Inv QTL affects root biomass accumulation and also carbon partitioning through a differential regulation of vac-Inv inhibitors at the mRNA level

The cytosolic invertase NI6 affects vegetative growth, flowering, fruit set, and yield in tomato

Sucrose metabolism is important for most plants, both as the main source of carbon and via signaling mechanisms that have been proposed for this molecule. A cleaving enzyme, invertase (INV) channels sucrose into sink metabolism. Although acid soluble and insoluble invertases have been largely investigated, studies on the role of neutral invertases (A/N-INV) have lagged behind. Here, we identified a tomato A/N-INV encoding gene (NI6) co-localizing with a previously reported quantitative trait locus (QTL) largely affecting primary carbon metabolism in tomato. Of the eight A/N-INV genes identified in the tomato genome, NI6 mRNA is present in all organs, but its expression was higher in sink tissues (mainly roots and fruits). A NI6-GFP fusion protein localized to the cytosol of mesophyll cells. Tomato NI6-silenced plants showed impaired growth phenotype, delayed flowering and a dramatic reduction in fruit set. Global gene expression and metabolite profile analyses of these plants revealed that NI6 is not only essential for sugar metabolism, but also plays a signaling role in stress adaptation. We also identified major hubs, whose expression patterns were greatly affected by NI6 silencing; these hubs were within the signaling cascade that coordinates carbohydrate metabolism with growth and development in tomato.Fil: Coluccio Leskow, Carla. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Buenos Aires; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Conte, Mariana. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Buenos Aires; ArgentinaFil: Del Pozo, Talia. Universidad Mayor; ChileFil: Bermúdez, Luisa. Universidad de Buenos Aires; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Buenos Aires; ArgentinaFil: Lira, Bruno Silvestre. Universidade de Sao Paulo; BrasilFil: Gramegna, Giovanna. Universidade de Sao Paulo; BrasilFil: Baroli, Irene Mabel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Biodiversidad y Biología Experimental y Aplicada. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Biodiversidad y Biología Experimental y Aplicada; ArgentinaFil: Burgos, Estanislao. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Zavallo, Diego. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Buenos Aires; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Kamenetzky, Laura. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Biociencias, Biotecnología y Biología Traslacional; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Asís, Ramón. Universidad Nacional de Córdoba; ArgentinaFil: Gonzalez, Mauricio. Universidad Mayor; ChileFil: Fernie, Alisdair Robert. Institut Max Planck fur Molekulare Physiologie; AlemaniaFil: Rossi, Maria Magdalena. Universidade de Sao Paulo; BrasilFil: Osorio, Sonia. Consejo Superior de Investigaciones Científicas; España. Universidad de Málaga; EspañaFil: Carrari, Fernando Oscar. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; Argentina. Universidad de Buenos Aires; Argentin

Metabolic analyses of interspecific tomato recombinant inbred lines for fruit quality improvement

Elucidating the determinants of tomato nutritional value and fruit quality to introduce improved varieties on the international market represents a major challenge for crop biotechnology. Different strategies can be undertaken to exploit the natural variability of Solanum to re-incorporate lost allelic diversity into commercial varieties. One of them is the characterization of selected germplasm for breeding programs. To achieve this goal, 18 RILs (S. lycopersicum × S. pimpinellifolium) were comprehensively phenotyped for fruit polar metabolites and quality associated traits. Metabolites were quantified by GC–MS and 1H NMR. Integrative analyses by neuronal clustering and network construction revealed that fruit properties are strongly associated with the metabolites aspartate, serine, glutamate and 2-oxoglutarate. Shelf life and firmness appeared to be linked to malate content. By a comparative analysis of the whole data set, ten RILs presented higher number of traits with positive effect than the S. lycopersicum × S. pimpinellifolium hybrid. Thus, these lines can be proposed as promising candidates for breeding programs aimed to improve fruit quality.Fil: Lopez, Mariana Gabriela. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Zanor, María Inés. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Pratta, Guillermo Raúl. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Cs.agrarias. Departamento de Biologia. Cat.de Genetica; ArgentinaFil: Stegmayer, Georgina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Tecnológica Nacional; ArgentinaFil: Boggio, Silvana Beatriz. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Conte, Mariana. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Bermudez Salazar, Luisa Fernanda. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Coluccio Leskow, Carla. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Rodríguez, Gustavo Rubén. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Cs.agrarias. Departamento de Biologia. Cat.de Genetica; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Picardi, Liliana Amelia. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Cs.agrarias. Departamento de Biologia. Cat.de Genetica; ArgentinaFil: Zorzoli, Roxana. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Cs.agrarias. Departamento de Biologia. Cat.de Genetica; ArgentinaFil: Fernie, Alisdair R.. Max Planck Institute For Molecular Plant Physiology; AlemaniaFil: Milone, Diego Humberto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Ingeniería y Ciencias Hídricas. Departamento de Informática. Laboratorio de Investigaciones en Señales e Inteligencia Computacional; ArgentinaFil: Asis, Ramón. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; ArgentinaFil: Valle, Estela Marta. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Carrari, Fernando Oscar. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentin