Light effects on fruiting body development of wildtype in comparison to light-insensitive mutant strains of the basidiomycete Coprinopsis cinerea, grazing of mites (Tyrophagus putrescentiae) on the strains and production of volatile organic compounds during fruiting body development

Coprinopsis cinerea gilt in Thailand als ein spezieller Speisepilz (Hed-cone-noi), der von kleinen Familienbetrieben auf landwirtschaftlichen Abfallstoffen, wie z.B. auf Wasserhyazinthe und Stroh produziert und in eingelegter Form vermarktet wird. In der Wissenschaft wird er als Modelorganismus zu Fruktifizierungsstudien bei Homobasidiomyzeten (Agaricomycotina) eingesetzt. C. cinerea ist ein heterothallischer Pilz, in dessen Lebenszyklus das Myzel abwech¬selnd zwei Stadien einnimmt: das unfruchtbare, kreuzungsfähige monokaryotische Myzel (Monkaryon) und das fruchtbare dikaryotische Myzel (Dikaryon), die sich im zweiwöchigem Lebenszyklus abwechseln. Dikaryonten mit zwei verschiedenen haploiden Zellkernen entstehen durch Verschmelzen zweier kompatibler Monokaryoten mit unterschiedlichen haploiden Zellkernen. Die Paarung zwischen den beiden Monokaryoten wird über unterschiedliche Allele an den beiden Kreuzungstypgenorte A und B kontrolliert. Diese werden auch für die Induktion der Fruchtkörperbildung des Pilzes benötigt. Gewisse Mutationen in diesen Genen bewirken eine Selbstkompatibilität von monokaryontischen Myzelien, die es diesen Mutanten wie z.B. dem Stamm AmutBmut erlauben, ohne vorherige Kreuzung mit einem anderen Monokaryon Fruchtkörper auszubilden. Solche Mutanten sind bevorzugte Stämme für Mutagenesen zur Suche von Entwicklungsdefekten in Fruchtkörperbildung, da sie nur einen Typ von haploiden Kernen besitzen. In dieser Dissertation wurde der morphologische Prozess der Fruchtkörperentwicklung des Stammes AmutBmut hinsichtlich der Lichtregulierung untersucht. Die Fruchtkörperentwicklung dauert insgesamt sieben Tage. Zuerst werden kleine Hyphenaggregate gebildet, in denen sich Gewebe für Hut und Stiele der Pilze differenzieren. In den reifen Primordien findet Karyogamie, Meiose und sexuelle Basidiosporenbildung in bzw. an spezifischen Zellen (Basidien) statt. Die Prozesse der Gewebeentwicklung, Karyogamie und Meiose, sowie die Bildung von Basidiosporen werden durch den Tag/Nacht-Rhythmus kontrolliert, d.h. durch Zeiten mit und Zeiten ohne Licht. In dieser Arbeit wurden bis zur vollständigen Entwicklung von Primordien sechs verschie¬dene Zeitpunkte definiert, bei denen ein Lichtsignal für den korrekten Fortgang des Prozesses nötig ist. Sollten Lichtsignale während der Entwicklung z.B. durch Transfer von Strukturen verschiedenen Alters (1 Tag alt, 2 Tage alt, etc.) in konstante Dunkelheit fehlen, werden anstelle von Fruchtkörpern elongierte Strukturen ( etiolierte Stiele ) gebildet mit langen Stielen und unterentwickelten Hüten. Je nach Alter beim Transfer sind die erreichten Entwicklungsstadien der Hutgewebe verschieden weit, aber bis zu einem Alter von 5 Tagen wird jeweils eine Weiterentwicklung des Hutgewebes durch Transfer ins Dunkle blockiert. Gewebe einzelner Stadien der Fruchtkörperentwicklung und der Entwicklung etiolierte Stiele bei Wildtyp und Mutanten wurden eingebettet, geschnitten und die Struktur unter dem Mikroskop beobachtet. Vier verschiedene Mutanten wurden untersucht, die in Licht etiolierte Stiele bildeten. Alle Mutationen waren rezessiv und traten in verschiedenen Genen ( dst1, dst2, dst3 bzw. dst4) auf. Zwei der Mutanten wurden direkt aus AmutBmut produziert. Zwei weitere kamen aus Japan mit einem anderen genetischen Hintergrund. In einem umfangreichen co-isogenem Prozess (sieben Generationen, wobei die erste Kreuzung mit dem Homokaryon AmutBmut und die weiteren Rückkreuzungen mit dem zu AmutBmut co-isogenen Monokaryon PS001-1 durchgeführt wurden) wurden neue Stämme mit dem gleichen genetischen Hintergrund wie AmutBmut produziert mit jeweils einem Gendefekt einer etiolotierten Stielausbildung aus den japanischen Stämmen. Bildung etiolierter Stiele in co-isogene Mutanten der vier verschiedenen dst-Gene wurden morphologisch untersucht und verglichen. Zwei Mutanten (dst1, dst2) waren defekt in ersten Schritten der Gewebeentwicklung. Sie waren zudem defekt in Licht-kontrollierter Bildung asexueller Sporen (Oidien) am Myzelium. Die dst2 Mutante war zudem defekt in der Unterdrückung von Fruchtkörperbildung im konstanten Licht und sie bildete auch etiolierte Stiele, wenn sie vollkommen im Dunkeln angezogen wurde im Gengensatz zum AmutBmut Wildtyp und anderen Mutanten, die mindestens ein Lichtsignal zur ersten Induktion einer Entwicklung benötigen. Aufgrund einer einfacheren Handhabung ist diese Mutante daher besonders interessant für Pilzzüchter für die Produktion essbarer Pilze, da sie etolierte Stiele under allen Bedingungen (im Licht, im Dunkeln, bei höheren und bei niedrigeren Temperaturen) macht. Alle anderen Stämme formen etiolierte Stiele nur bei 28°C. Im Gegesatz zu anderen Stämmen, bei denen die kurzlebigen Fruchtkörper schnell degenerieren, wenn sie nicht gleich geerntet und weiter in Lake eingelegt werden, sind etiolierte Stiele langlebig und können daher frisch an Kunden verkauft werden.Pilze werden aus verschiedenen Gründen gegessen, u.a. wegen ihres guten Geschmacks und Geruchs. In Kooperation mit Forschern der Abteilung Forstzoologie und Waldschutz, insbesondere Dr. Prodpran Thakeow, wurden Odorabgaben während der Fruchtkörperentwicklung gemessen. Typische flüchtige Pilzgerüche (1-Octen-3-ol, 3 Octanon) wurden in größeren Mengen während der frühen Phasen der Fruchtkörperentwicklung entdeckt. Ebenso konnten flüchtige Sesquiterpene (β-Himachalen und Cuparen) während der Reifung nachgewiesen werden. Auch wenn diese Gerüche angenehm für den Verbraucher sind, können sie doch Probleme bei der Lage¬rung bereiten. Staubmilben wie z.B. Tyrophagus putrescentiae (Acari: Acaridida) lassen sich einfach durch diese Düfte anlocken und können dann Lebensmittel verderben. Labortests mit T. putrescentiae belegten, dass die beiden C8-Komponenten 1 Octen-3-ol und 3 Octanon die Arthropoden anlocken. Folglich werden Milben auch von C. cinerea Kulturen angelockt, die dann als Nahrungsmittel genutzt wurden. Milbenfraß bewirkt am angegriffenen Myzel eine immense Erhöhung an den vier volatilen Substanzen (VOCs, volatile organic compounds ). Dies erklärt auch die Milebnaggregation an den Fraßstellen in Pilzkulturen, da hier im vegetativen Myzelium vermutlich eine erhöhte Produktion an VOCs stattfindet. Das Verhalten von Milben gegenüber Myzelkulturen und Fruchtkörpern wurde untersucht. Milben fressen das vegetative Myzel, aber nicht Primordien, Fruchtkörperstiele und etiolierte Stiele und auch nicht die multizellulären Sklerotien, melanisierte aggregierte Strukturen, die zum Fortbestehen der Pilze dienen. Allerdings werden die Milben von den Hüten reifer Fruchtkörper angelockt, wo sie die Lamellen beweiden und die reifen Basidiosporen in sich aufnehmen. Die Tiere verbreiten Basidiosporen äußerlich durch Anheften der Sporen an ihren Körpern, sowie gefressene Sporen nach Passieren der Verdauungstrakte durch Ausscheiden von Fäkalien. Ausgeschiedene intakte Basidiosporen in Faekalien können auskeimen. Wie hier gezeigt, dienen Milben daneben auch als Vektoren von Bakterien und, wie in der Literarur berichtet, auch von anderen Pil¬zen. Probleme, die bei der kommerziellen Pilzkultivierung durch Milbenbefall auftreten, sind so¬mit die Kontaminierung des Materials durch die Fäkalien der Milben, sowie die Einbringung anderer schädlicher Mikroorganismen in die Pilzkulturen. In der kommerziellen Pilzkultivierung müssen daher gute hygienische Bedingungen herrschen, um einen Milbenbefall zu vermeiden

3 rd Referee: Prof. Dr. Reiner Finkeldey Date of Oral Examination: 17.07.2008Zusammenfassung

Light effects on fruiting body development of wildtype in comparison to light-insensitive mutant strains of the basidiomycete Coprinopsis cinerea, grazing of mites (Tyrophagus putrescentiae) on the strains and production of volatile organic compounds during fruiting body developmen

Acknowledgements

It is pleasure to thank all the people who made this thesis possible. This is perhaps the hardest chapter that I have to write because it is simple to name all the people that helped to get this PhD work done, but it will be tough to thank them enough. I will try…… I would like to express my sincere thanks to Prof. Dr. Ursula Kuees and Prof. Dr. Andrea Polle for giving me the opportunity to work for this PhD and for their guidance in finishing this research work. I would like to extend my gratitude to Prof. Dr. Stefan Schütz for his willingness to evaluate my thesis and many thanks to Prof. Dr. Reiner Finkeldey for accepting to be one of my examiners. My gratitude to Dr. Andrzej Majcherczyk for introducing me to the protein work, supervision and for stimulating discussions. Special thanks to Dr. Patrik Hoegger from whom I learnt not only scientific things but also many potential tips beyond research that are useful to lead a happy life. Mojtaba Zomorrodi is greatly acknowledged for the technical support, being available all the time and keeping friendly environment in the lab. I am indebted to my many student colleagues Dr. Sreedhar Kilaru, Dr. Rajes