Metodología de control para el análisis de alérgenos de leche, soja y huevo en productos cárnicos y farináceos

In Argentina the mandatory declaration of allergens in food labels is under revision. There is a need of methodologies that enables the detection of allergenic proteins in food. The aim of this study was to evaluate and develop methodologies that allow the detection of most important allergenic proteins in our country. Different methodologies for the detection of milk, soy and egg proteins in meat products and soy and egg protein in farinaceous products were evaluated and developed. SDS-PAGE, immunoblotting and different commercial ELISA kits were evaluated and competitive enzyme immunoassays were developed and validated. According to the results obtained it is concluded that the method to be used depends on the allergen to be detected and/or quantified, the food matrix and the treatment that was applied to the food. Some of the methods that have been studied are useful as screening methods (immunoblotting or competitive enzyme immunoassays). Positive results of these tests confirm the presence of the allergenic substance, however when the results of these methods are negative it is necessary to use a commercial ELISA kit of proper sensitivity for the allergen and the matrix to be analyzed.Fil: Cellerino, Karina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, ArgentinaEn Argentina la declaración obligatoria de los alérgenos en las etiquetas de alimentos se\nencuentra en revisión. Existe la necesidad de disponer de metodologías que permitan la\ndetección de proteínas alergénicas en los alimentos. El objetivo de este estudio fue evaluar y\ndesarrollar metodologías que permitan la detección de las proteínas alergénicas más importantes\nen nuestro país. Se estudiaron y desarrollaron diferentes metodologías para la detección de\nproteínas lácteas, de soja y de huevo en productos cárnicos y de soja y de huevo en productos\nfarináceos. Se evaluaron SDS-PAGE, inmunoblotting, diferentes kits de ELISA comerciales y\nse desarrollaron y validaron enzimoinmunoensayos competitivos. De acuerdo con los resultados\nobtenidos se concluyó que el método a utilizar depende del alérgeno que se quiere detectar y/o\ncuantificar, de la matriz del alimento que contiene al alérgeno y del tratamiento que fue aplicado\nal alimento. Algunos de los métodos estudiados resultaron útiles como métodos de screening\n(inmunoblotting o enzimoinmunoensayos competitivos). Resultados positivos de estos ensayos\npermiten confirmar la presencia de la sustancia alergénica, sin embargo cuando estos métodos\npresentan un resultado negativo es necesario recurrir a un kit de ELISA comercial de adecuada\nsensibilidad para el alérgeno y la matriz analizada

Development of a Competitive Enzyme Immunoassay Technique for the Detection of Soy Traces in Meat Products

The aim of this work was to develop a competitive enzyme immunoassay technique, to detect the presence of traces of soy in meat products. Specific rabbit polyclonal antiserum against soy protein was used as primary antibody. The optimal antigen concentration to be immobilized on the plate and the concentration of primary antibody to be used in competition was determined. The calibration curve was fitted using increasing concentrations of an extract of soy product. The soy product was extracted with Tris-HCl buffer 0.0625M with 3% sodium dodecylsulfate and 2% mercaptoethanol. The working range used in the enzyme immunoassay to detect soy was 9-280ppm SP with adequate linearity (R2: 0.9880). All validation parameters studied were appropriate. Commercial samples of meat products were analyzed with this enzyme immunoassays and a commercial ELISA kit. Significant differences were observed in the quantitative results obtained with both methods; nevertheless the developed enzyme immunoassay could be used as screening method.Facultad de Ciencias ExactasInstituto de Estudios Inmunológicos y Fisiopatológico

Protein Ingredients Control in Gluten Free Products Using SDS-PAGE, Developed Competitive Enzyme Immunoassays and Commercial ELISA Kits.

Some protein ingredients declared in the label of gluten free products are allergenic proteins (milk, soy and egg).The proper identification of these proteins in food products is important for consumers who have food allergies. The aim of this study was to control the presence of protein ingredients declared in the label of gluten free products. Samples were analyzed with sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), using an extractive solution of total proteins (Tris-ClH buffer 0.0625 M with 3% sodium dodecylsulfate and 2% 2-mercaptoethanol; pH: 6.8) and a selective solvent for the extraction of caseins (isopropanol 55° + 2-mercaptoethanol / ISO + ME). Developed Competitive enzyme immunoassays were used for the detection / quantification of milk, soy and egg proteins in products elaborated with rice flour. Specific polyclonal rabbit antiserums against milk, soy and egg proteins were used as primary antibodies in these competitive enzyme immunoassays. Commercial ELISA kits from Neogen, R-Biopharm and Romer were used to verify the results. In some samples undeclared allergens were detected. Correct allergens labeling is very important for the safety of allergic consumers. In conclusion, it is possible to identify all the proteins ingredients in these gluten-free foods studied, using a combination of electrophoretic methods and immunochemical methods.Fil: Cellerino, Karina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Cagnasso, Carolina Elisa. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; ArgentinaFil: Greco, Carola Beatriz. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; ArgentinaFil: Docena, Guillermo H.. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Estudios Inmunológicos y Fisiopatológicos. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Estudios Inmunológicos y Fisiopatológicos; ArgentinaFil: Polenta, Gustavo Alberto. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Ferreyra, Marcela Verónica. Instituto Nacional de Tecnología Industrial; ArgentinaFil: Lopez, Laura Beatriz. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin

Milk Protein Detection in Raw and Cooked Meat Products Using Immunochemichal Methods

The aim of this study was to evaluate different immunochemical methods (Dot Blot, Immnoblotting and two different ELISA kits) for the detection of milk proteins in eleven raw and cooked model systems of meat products with 0 – 5000 ppm of powder deffated milk (PDM) and in nine raw and cooked model systems of meat products with 0-2000 ppm of dry whey (DW) and in eleven commercial meat products. All the samples were analysed with Dot Blot and Immunoblotting with specific polyclonal rabbit serum against milk proteins and with two ELISA kits: Veratox® Total Milk Allergen Quantitative Test from Neogen and Ridascreen® Fast Milk from R-Biopharm. ELISA methods are more sensitive for the detection of milk proteins than Dot Blot and Immunoblotting. The R-Biopharm kit was the most sensitive kit for the analysis of these samples. However Immunoblotting can be useful for the detection of milk proteins if it is suspected that they were added as ingredients or additives. Immunoblotting allows to verify the presence of caseins and / or β-lactoglobulin. In contrast, the use of an ELISA kit is more appropriate to verify a possible cross-contamination.Laboratorio de Investigaciones del Sistema Inmun

Development of a Competitive Enzyme Immunoassay Technique for the Detection of Peanut Traces in Gluten-free Products

The aim of this work was to develop a competititve enzymeimmunoassay technique, to detect the presence of traces of peanut in gluten-free products. Specific rabbit polyclonal antiserum against peanut was used as primary antibody. The optimal antigen concentration to be immobilized on the plate and the concentration of primary antibody to be used in competition was determined. The calibration curve was fitted using increasing concentrations of an extract of peanut product. The peanut product was extracted with Tris-HCl buffer 0.0625M with 3% sodium dodecylsulfate (SDS) and 2% sulphite (S) 0,1 M. All validation parameters studied were appropriate. Commercial samples of gluten-free products were analysed with this enzyme immunoassays and a commercial ELISA kit. Significant differences were observed in the quantitative results obtained with both methods; nevertheless the developed enzyme immunoassay could be used as screening method.Fil: Cellerino, Karina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Sanidad Nutrición Bromatología y Toxicología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Marquez, Silvina Belén. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Sanidad Nutrición Bromatología y Toxicología; ArgentinaFil: Rodriguez, Viviana Gladys. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Sanidad Nutrición Bromatología y Toxicología; ArgentinaFil: Docena, Guillermo H.. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Estudios Inmunológicos y Fisiopatológicos. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Estudios Inmunológicos y Fisiopatológicos; ArgentinaFil: López, Laura Beatriz. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Sanidad Nutrición Bromatología y Toxicología; Argentin

Milk Protein Detection in Raw and Cooked Meat Products Using Immunochemichal Methods

The aim of this study was to evaluate different immunochemical methods (Dot Blot, Immnoblotting and two different ELISA kits) for the detection of milk proteins in eleven raw and cooked model systems of meat products with 0 – 5000 ppm of powder deffated milk (PDM) and in nine raw and cooked model systems of meat products with 0-2000 ppm of dry whey (DW) and in eleven commercial meat products. All the samples were analysed with Dot Blot and Immunoblotting with specific polyclonal rabbit serum against milk proteins and with two ELISA kits: Veratox® Total Milk Allergen Quantitative Test from Neogen and Ridascreen® Fast Milk from R-Biopharm. ELISA methods are more sensitive for the detection of milk proteins than Dot Blot and Immunoblotting. The R-Biopharm kit was the most sensitive kit for the analysis of these samples. However Immunoblotting can be useful for the detection of milk proteins if it is suspected that they were added as ingredients or additives. Immunoblotting allows to verify the presence of caseins and / or β-lactoglobulin. In contrast, the use of an ELISA kit is more appropriate to verify a possible cross-contamination.Laboratorio de Investigaciones del Sistema Inmun

Verificación de la presencia de ingredientes proteicos en premezclas libres de gluten mediante SDS-PAGE y ELISA

El objetivo del presente trabajo fue verificar la presencia de los ingredientes proteicos declarados en la lista de ingredientes de premezclas.

Electrophoretic and immunochemical methods for the detection of milk, soy and egg proteins in commercial mix products

Se evaluó la detección de proteínas de leche, huevo y soja en trece productos comerciales, correspondientes a premezclas para preparar flanes, bizcochuelo, milanesas de soja, tortas fritas, pizza, ñoquis y productos en polvo a base de harinas para niños pequeños. Las muestras fueron analizadas por SDS-PAGE, inmunoblotting y métodos de ELISA. El método electroforético e inmunoblotting resultaron útiles para confirmar la presencia de las proteínas alergénicas en algunas muestras que las declaraban como ingredientes. En cuatro muestras que también declaraban como ingredientes alguna de estas proteínas, tanto con SDS-PAGE como con Inmunoblotting, los resultados fueron negativos, sugiriendo que dichas proteínas no fueron agregadas como ingredientes en dichos alimentos. Los kits de ELISA permitieron la detección de concentraciones muy bajas de estos alérgenos en cuatro productos que presentaban frases de advertencia e incluso en otros cinco que no tenían ninguna declaración de alérgenos. Los métodos de ELISA son útiles para detectar contaminaciones cruzadas, dada su elevada sensibilidad. Se concluye que resulta necesario una declaración responsable de estas proteínas alergénicas, en los rótulos de este tipo de alimentos por parte de los fabricantes.The presence of milk, egg and soy proteins was evaluated in thirteen commercial products, which were premixes to make cream caramel, cake, soy "milanesas", "tortas fritas", pizza, gnocchi and complementary foods. Samples were analysed using SDS-PAGE, immunoblotting and ELISA methods. The electrophoretic method and immunoblotting were useful to confirm the presence of milk, egg and soy proteins in four samples that declared them as ingredients. In other samples, both methods showed negative results for some of these proteins, although they were also declared as ingredients. This suggests that those proteins were not added as ingredients in these products. The ELISA kits detected very low concentration of the allergenic proteins in four products with precautionary phrases and also in five samples that made no reference to them in their labels. ELISA methods are useful to detect cross contamination due to their high sensitivity. The food industry should be responsible for the declaration of milk, egg and soy proteins in their food labels.Fil: Cagnasso, Carolina Elisa. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; ArgentinaFil: Martin, Maria Eugenia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Cellerino, Karina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Audisio, Fabiola. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; ArgentinaFil: Docena, Guillermo H.. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Polenta, Gustavo Alberto. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación de Agroindustria. Instituto de Tecnología de Alimentos; ArgentinaFil: Lopez, Laura Beatriz. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin

Detección de trazas de soja y de leche en galletitas, fideos y snacks libres de gluten: desarrollo de enzimoinmunoensayos competitivos utilizando SDS y sulfito de sodio

Una de las metodologías utilizadas internacionalmente para la detección de alérgenos en alimentos es el método de ELISA. En trabajos previos se ha observado que los kits comerciales no cuantifican adecuadamente, especialmente cuando se aplican a alimentos tratados térmicamente. Se han desarrollado enzimoinmunoensayos (EIE) competitivos que utilizan una solución de extracción con Tris-HCL 0,0625 M con 3% de SDS y con 2% de 2- mercaptoetanol (2-ME). Investigaciones recientes desaconsejan el empleo de 2-ME debido a su toxicidad, por lo tanto este fue sustituido por sulfito de sodio (SS). Con el método SDS-PAGE se corroboró que utilizando la mencionada solución de extracción, pero con diferentes agentes reductores se observaban las mismas bandas proteicas de leche o de soja, con igual intensidad. Para mejorar la performance del enzimoinmunoensayo se obtuvieron anticuerpos específicos de proteínas de soja (PS) y proteínas de leche (PL) inmunizando a conejos con los extractos de dichas proteínas tratadas con esta solución con SDS y SS. El objetivo de este trabajo fue comparar los resultados de los EIE que utilizan 2-ME con los resultados de los EIE que utilizan SS como parte de la solución extractiva. Se evaluaron los parámetros de validación: límite de detección (LD) y de cuantificación (LC), recuperación y precisión en el día y entre días. Los LD y los LC para los EIE para detectar soja y leche utilizando la solución con SS resultaron menores comparados con la solución con 2-ME, de manera que mejoró la sensibilidad del enzimoinmunoensayo (con la solución con SS: soja LD: 4,4 ppm PS, LC: 10,0 ppm PS y leche LD: 11,0 ppm de PL, LC: 27,0 ppm PL; con la solución con 2-ME soja LD: 35,0 ppm PS, LC: 60,0 ppm PS y leche LD: 25,0 ppm de PL, LC: 51,0 ppm PL). La recuperación y la precisión resultaron adecuadas en ambos EIE (recuperación: con la solución con SS: soja 107% y leche 108%; con la solución con 2-ME: soja 109% y leche 112%). Se adoptó como criterio de aceptación que los CV de la precisión intradía e interdías no superaran el 15%, en todos los EIE resultó menor a 15%. Además, se analizaron 9 muestras comerciales de productos libres de gluten con los EIE que utilizaban dichas soluciones extractivas (Tris-HCl/SDS y Tris-HCl/SS) y con kits comerciales de R-Biopharm para soja, y de Neogen para leche. Se observó que ambos EIE y los kits comerciales se comportaron de manera similar en cuanto a la detección de los alérgenos en estudio. Dado el bajo costo de los EIE competitivos se podría utilizar como método de screening el nuevo EIE desarrollado con SS. UBACYT20020160100060BALaboratorio de Investigaciones del Sistema Inmun

Comparison of SDS-PAGE and immunochemical methods for the detection of soy proteins in raw and cooked meat products

Se evaluó la detección de proteínas de soja en productos cárnicos crudos y cocidos utilizando SDS-PAGE y métodos inmunoquímicos. Se analizaron diez sistemas modelo de mezclas de carne vacuna con agregado de aislado de soja, ocho sistemas modelo de fiambres de cerdo con agregado de aislado de soja y ocho muestras comerciales. Los sistemas modelo y las muestras fueron analizadas por SDS-PAGE, Dot blot, Inmunoblotting y ELISA soja de Neogen. Dot Blot e Inmunoblotting resultaron los métodos más sensibles para la detección de proteínas de soja. Con el método de ELISA se obtuvieron valores de concentraciones de aislado de soja muy inferiores a los valores reales. En varias muestras comerciales se detectaron con los distintos métodos proteínas de soja no declaradas en los respectivos rótulos. El tratamiento térmico aplicado en los productos cocidos afectaría la solubilidad de las proteínas de soja y su capacidad para reaccionar con los anticuerpos presentes en el kit de ELISA utilizado.The aim of this study was to evaluate the detection of soy proteins in raw and cooked meat products using SDS-PAGE and immunochemical methods. Ten raw model systems of bovine meat added with soy protein isolates, eight cooked model systems of boneless ham added with soy protein isolates and eight commercial meat products were analized. Model systems and commercial samples were analyzed by SDS-PAGE, Dot Blot, Immunoblotting and ELISA (Soy allergen kit from Neogen). Dot blot and Immunoblotting resulted to be the most sensitive analytical methods for the detection of soy proteins. The concentrations of the soy protein isolate obtained with the ELISA kit were much lower than real values. Soy proteins that were not declared in the label of several samples were detected using different methods. The heat treatment applied to the cooked meat products would affect the solubility of soy proteins and their ability to react with the antibodies of the ELISA kit used.Fil: Cellerino, Karina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Binaghi, Maria Julieta. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; ArgentinaFil: Cagnasso, Carolina Elisa. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; ArgentinaFil: Docena, Guillermo H.. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; ArgentinaFil: López, Laura Beatriz. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; Argentin