Functional analysis of the SUMO conjugation/deconjugation system during the development and stress response of Arabidopsis thaliana

Tese de doutoramento em Ciências (área de especialização em Biologia)Living organisms are subjected to constantly changing environmental conditions that compromise survival. Perception of these changes precedes the triggering of signaling events that ultimately activate an adequate response. Since plants are sessile organisms they are considerably more exposed to an instable environment, having adopted a wide range of strategies to adapt, avoid or tolerate stress. Knowledge on the molecular basis of these strategies will be key for future crop improvement, particularly with a rapidly changing environment. Several studies have singled out how fast and reversible responses to stress correlate with post-translational modification (PTM) of key proteins. An increasingly important mechanism involves protein modification by small peptides such as ubiquitin and other ubiquitin-like modifiers (UBLs). Focus on small ubiquitin-related modifier (SUMO), a UBL family member, has increased massively in the last years. SUMO attachment, or sumoylation, may exert different effects depending on the target protein, controlling its conformation, or even creating or blocking interacting interfaces. To be attached to a target, pre-SUMO peptides are first processed by SUMO proteases (ULP/SENP family), and then conjugated to a target’s lysine via SUMO E1 activases and SUMO E2 conjugases, aided by SUMO E3 ligases. Deconjugation of the SUMO peptide can be carried out by SUMO proteases. In plants, SUMO homeostasis is critical because mutations in pathway components result in embryonic lethality or pleiotropic phenotypes. One interesting feature of SUMO is that SUMO-conjugates accumulate rapidly upon stress imposition, placing SUMO in the forefront of the plant response to stress, most likely associated to transcriptional re-programming. Studies of SUMO function in plants have been based mostly on reverse genetics approaches in the plant model Arabidopsis thaliana. Similarly, we employed T-DNA insertion mutants to characterize the role of the major SUMO E3 ligase SIZ1 and SUMO proteases ULP1c, ULP1d, ULP2a and ULP2b in the plant stress response. Reactive oxygen species (ROS) are known internal signals caused by stress that can induce SUMO-conjugate accumulation. In the present work we addressed SUMO-ROS interplay, and report that SIZ1 is essential for SUMO-conjugate induction in response to ROS, and is involved in oxidative stress tolerance. Additionally, siz1 mutants displayed altered ROS homeostasis, constitutively accumulating hydrogen peroxide, superoxide ion and singlet oxygen. The siz1 phenotype was partially dependent of salicylic acid (SA) levels since several siz1 defects were greatly recovery by the expression of the transgenic salicylate hydroxylase NahG. The siz1 mutant displays constitutive autoimmune phenotypes, including SA-accumulation. Analysis of oxidative stress-responsive targets of sumoylation suggests a major role for transcription remodeling proteins in the SUMO-dependent response to oxidative stress. Bioinformatic analysis revealed that the transcriptome profile of adult siz1 is similar to that of mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway mutants. These also share common features of autoimmune responses, such as the accumulation of ROS. Results suggest a crosstalk between the SUMO and MAPK pathways, but a direct interaction between MKK2-MPK4 and SUMOs or in vitro sumoylation of MKK2-MPK4 was not observed. Nonetheless, we introgressed mkk1/2 and mpk4 mutants into siz1, and sumoylation profiles suggest that MPK4 acts as a negative regulator while MKK1/2 is seemingly epistatic to SIZ1. In contrast to the low number of components involved in SUMO conjugation, there are several SUMO proteases in plants. SUMO proteases are sources of selectivity, since they can discriminate different SUMO isoforms and targets to be de-sumoylated. They also display different expression patterns and subcellular localizations. We report how phylogenetic reconstruction of the Arabidopsis ULP family outlines the existence of two major branches, and within these, four phylogenetic subgroups. We characterized two of these subgroups, one composed by ULP1c/ULP1d and another by ULP2a/ULP2b. We show how ULP1c/d function redundantly to regulate several developmental traits. Using GUS report assays we also established their spatial expression pattern. A microarray analysis of differentially expressed genes in a double T-DNA insertion mutant was carried out, suggesting a deregulation of drought and abscisic acid-related genes. Taking this into consideration, a characterization of related phenotypes was performed in the double mutant. We additionally demonstrated how ULP1c/d are negative regulators of the plant response against the hemibiotroph pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst) DC3000. The response is however complex, since infection triggered down-regulation of ULP1c and ULP1d transcripts, which may correlate with the observed increase in SUMO-conjugates that follows infection. Analysis of the transcriptome of ulp1c/d after Pst DC3000 challenging revealed the existence of many de-regulated genes involved in both biotic stress responses and hormonal signaling, including auxin-responsive genes. We subsequently observed ulp1c/d sensitivity to exogenous auxins. Overall results suggest a ULP1c/d-dependent modulation of auxin in response to Pst DC3000. ULP2a and ULP2b were structural and phylogenetically characterized, revealing a set of common features with ULP2-type proteases of other biological models. T-DNA insertion mutants for this ULP pair were characterized, showing diverse phenotypic defects and constitutive accumulation of SUMO-conjugates. ULP2a and ULP2b displayed unequal redundancy, placing ULP2b as the most preponderant. Microarray analysis evidenced a specific transcriptional signature that suggests the involvement of ULP2s in secondary metabolism, cell wall remodelling and nitrogen assimilation. The ulp2a/b mutant also displayed an antagonistic morphological phenotype to that of the well characterized SUMO E3 ligase mutant siz1. Most significantly, the triple mutant ulp2a/b siz1 was phenotypically siz1-like, which places ULP2a/b as epistatic and downstream of SIZ1. The current work highlights the importance of both SIZ1 and various SUMO proteases in development and the plant response to external challenges. Subsequent functional studies will help unravel the fundamental role that SUMO dynamics seems to play at a molecular level, in the control of plant development, hormone regulation, stress response and transcription programming.Os organismos vivos estão constantemente sujeitos a alterações ambientais que comprometem a sua sobrevivência. A percepção destas alterações precede eventos de sinalização que culminam na activação de uma resposta adequada. Dado as plantas serem organismos sésseis, elas estão consideravelmente mais expostas a ambientes instáveis, tendo desenvolvido um vasto leque de estratégias para adaptar, evitar ou tolerar o stresse. O conhecimento das bases moleculares subjacentes a estas estratégias é chave para o melhoramento de cultivares de interesse, especialmente estando estes sujeitos a ambientes instáveis. Diversos estudos têm evidenciado como respostas rápidas e reversíveis se correlacionam com mecanismos de modificação pós-tradução (PTM) de proteínas-chave. Mecanismos de reconhecida importância envolvem modificações por pequenos péptidos como a ubiquitina e modificadores semelhantes à ubiquitina (UBLs). O estudo do pequeno modificador relacionado com ubiquitina (small ubiquitin-related modifier; SUMO), um membro da família UBL, tem sido crescente nos últimos anos. A ligação do SUMO a uma proteína (sumoilação) poderá exercer diferentes efeitos consoante a proteína-alvo, controlando a sua conformação, e criando, ou bloqueando, interfaces de interacção. Para ser ligado a um alvo, o péptido pre-SUMO terá que ser inicialmente processado por SUMO proteases (família ULP/SENP), e então conjugado ao resíduo de lisina do alvo através de SUMO E1 activases e SUMO E2 conjugases, auxiliadas por SUMO E3 ligases. A desconjugação do SUMO poderá ser levada a cabo por SUMO proteases. Em plantas, a homeostasia do SUMO é fundamental uma vez que mutações em componentes da via resultam em letalidade embrionária ou em fenótipos pleiotrópicos. Um aspecto interessante do SUMO é o facto dos seus conjugados serem acumulados rapidamente em resposta ao stresse, posicionando o SUMO nos primeiros passos da resposta da planta ao stresse, muito possivelmente associada à reprogramação transcripcional. Estudos da função do SUMO em plantas assentam maioritariamente em estratégias de genética inversa onde é utilizada a espécie modelo Arabidopsis thaliana (Arabidopsis). De forma semelhante, o presente estudo utilizou mutantes de Arabidopsis por inserção de T-DNA para caracterizar o papel da SUMO E3 ligase SIZ1 e das SUMO proteases ULP1c, ULP1d, ULP2a e ULP2b na resposta da planta ao stresse. As espécies reactivas de oxigénio (ROS) estão descritas como sendo sinalizadores internos originados pelo stresse que podem induzir a acumulação de conjugados de SUMO. No presente trabalho foi abordada a interacção SUMO-ROS, tendo-se obtido evidências de que SIZ1 é essencial para a indução de conjugados de SUMO em resposta a ROS, estando SIZ1 envolvida na tolerância ao stresse oxidativo. Adicionalmente, os mutantes siz1 revelam alterações na homeostasia das ROS, acumulando constitutivamente peróxido de hidrogénio, ião superóxido e oxigénio singleto. O fenótipo de siz1 é parcialmente dependente dos níveis de ácido salicílico (SA) uma vez que os defeitos fenotípicos de siz1 são grandemente recuperados pela expressão do transgene salicilato hidrolase NahG. O mutante siz1 apresenta um fenótipo de auto-imunidade constitutiva, incluindo a acumulação de SA. A análise dos alvos de sumoilação que respondem a stresse oxidativo sugere um papel preponderante de proteínas reguladoras da transcrição na resposta ao stresse oxidativo dependente do SUMO. A análise bioinformática revelou que o padrão do transcriptoma de siz1 é semelhante ao de mutantes da via das MAP cinases (MAPK). Estes apresentam também características de resposta auto-imune, como a acumulação de ROS. Os resultados sugerem uma intercepção entre as vias do SUMO e MAPK, porém não foram observadas interacções entre MPK4 e péptidos SUMO, ou sumoilação in vitro de MKK2-MPK4. Contudo, as plantas resultantes da introgressão de mutantes mkk1/2 e mpk4 com siz1 apresentam padrões de sumoilados alterados, permitindo sugerir a MPK4 como sendo um regulador negativo da sumoilação, enquanto as MKK1/2 poderão ser epistáticas de SIZ1. Em contraste com o número limitado de componentes da via de conjugação do SUMO, em plantas existem várias SUMO proteases. As SUMO proteases são uma fonte de selectividade, uma vez que são capazes de discriminar isoformas de SUMOs e descriminar alvos a serem dessumoilados, reconhecem diferencialmente isoformas do SUMO, possuem diferentes padrões de expressão e diferente localização subcelular. A reconstrução filogenética da família ULP de Arabidopsis evidenciou a existência de dois grandes ramos, divididos em quatro subgrupos filogenéticos. Procedemos à caracterização de dois destes subgrupos, um composto por ULP1c/ULP1d e outro por ULP2a/ULP2b. Foi demonstrado que as ULP1c/d funcionam redundantemente na regulação de diversos aspectos do desenvolvimento. Recorrendo a ensaios pelo gene repórter GUS, foi possível estabelecer o padrão de expressão espacial destes genes. Analise por microarray de genes diferencialmente expressos no duplo mutante de inserção por T-DNA para ambos genes identificou uma desregulação de genes envolvidos na secura e ácido abscísico. Tendo este resultado em consideração, uma caracterização de fenótipos relacionados com estes processos foi realizada no duplo mutante. Demonstrou-se igualmente que as ULP1c/d são reguladores negativos na defesa da planta ao microorganismo patogénico hemibiotrófico Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst) DC3000. No entanto esta resposta é complexa já que a infecção diminui os níveis de transcritos de ULP1c e ULP1d, o que poderá estar correlacionado com o aumento de conjugados de SUMO que se seguem à infecção. Uma análise do transcriptoma do ulp1c/d após eliciação com Pst DC3000 revelou a existência de muitos genes desregulados envolvidos nas respostas ao stresse biótico e sinalização hormonal, incluindo genes de resposta a auxinas. Em suma, os resultados apontam para um papel das ULP1c/d na modelização das auxinas em resposta a Pst DC3000. ULP2a e ULP2b foram caracterizadas estrutural e filogeneticamente, revelando um conjunto de características comuns às proteases do tipo ULP2 de outros modelos biológicos. Mutantes por inserção de T-DNA para este par de ULP mostraram diversos defeitos fenotípicos e uma acumulação constitutiva de conjugados de SUMO. ULP2a e ULP2b apresentam redundância desigual, sendo ULP2b a mais preponderante. A análise por microarray evidenciou uma assinatura transcripcional especifica que sugere o envolvimento das ULP2s no metabolismo secundário, remodelação da parede celular e assimilação de azoto. O mutante ulp2a/b apresenta também um fenótipo morfológico antagónico ao fenótipo bem caracterizado do mutante da SUMO E3 ligase SIZ1. Foi interessante constatar que o triplo mutante ulp2a/b siz1 é fenotipicamente semelhante a siz1, colocando as ULP2a/b numa posição epistática e a jusante de SIZ1. O presente trabalho salienta a importância tanto de SIZ1 como de várias SUMO proteases na resposta da planta a desafios externos. Estudos funcionais subsequentes permitirão revelar, ao nível molecular, papéis fundamentais da dinâmica do SUMO no controlo do desenvolvimento, da regulação hormonal, da resposta ao stresse e da programação transcripcional

The Arabidopsis bZIP19 and bZIP23 Activity Requires Zinc Deficiency – Insight on Regulation From Complementation Lines

All living organisms require zinc as an essential micronutrient. Maintaining appropriate intracellular zinc supply, and avoiding deficiency or toxic excess, requires a tight regulation of zinc homeostasis. In Arabidopsis, bZIP19 and bZIP23 (basic-leucine zipper) transcription factors are the central regulators of the zinc deficiency response. Their targets include members of the ZIP (Zrt/Irt-like Protein) transporter family, involved in cellular zinc uptake, which are up-regulated at zinc deficiency. However, the mechanisms by which these transcription factors are regulated by cellular zinc status are not yet known. Here, to further our insight, we took advantage of the zinc deficiency hypersensitive phenotype of the bzip19 bzip23 double mutant, and used it as background to produce complementation lines of each Arabidopsis F-bZIP transcription factor, including bZIP24. On these lines, we performed complementation and localization studies, analyzed the transcript level of a subset of putative target genes, and performed elemental tissue profiling. We find evidence supporting that the zinc-dependent activity of bZIP19 and bZIP23 is modulated by zinc at protein level, in the nucleus, where cellular zinc sufficiency represses their activity and zinc deficiency is required. In addition, we show that these two transcription factors are functionally redundant to a large extent, and that differential tissue-specific expression patterns might, at least partly, explain distinct regulatory activities. Finally, we show that bZIP24 does not play a central role in the Zn deficiency response. Overall, we provide novel information that advances our understanding of the regulatory activity of bZIP19 and bZIP23.</p

Teorías, modelos y estrategias de desarrollo en América Latina y El Caribe. Períodos presidenciales: Lucio Gutierrez, Alfredo Palacios

Ecuador sufrió cambios radicales en el proceso previo a la década del 2010 donde se dieron lugar mandatos encontrados entre si y contrarios a su vez. El presente artículo se desarrolló con el objetivo estudiar las políticas de aciertos y desaciertos de los gobiernos de Lucio Gutierrez (2003-2005) y Alfredo Palacios (2005-2007). El método empleado para el desarrollo de la investigación fue el diseño documental, con la revisión de textos y diversas fuentes arbitradas para la verificación de los principales aspectos que destacaron en los mandatos de los referidos presidentes. Los resultados permitieron conocer las políticas de Estado que aplicó Lucio Gutierrez con un marcado eje izquierdista y Luis Alfredo Palacios un presidente más conservador pero igualmente incisivo aunque menos controversial que el anterior. Las conclusiones fueron Gutierrez que el mandato de Gutierrez fue comparado con el del presidente venezolano de ese momento, con profundas similitudes a Hugo Chávez, lo que desencadeno serias críticas por sus alianzas políticas con este mandatario y la inclusión en políticas de Estado internacional emanadas de proyecciones que se originaron en propuestas como el ALBA por el contrario Luis Alfredo Gutierrez su sucesor y precursor de políticas más conservadoras y aceptables, dio importantes modificaciones en el rumbo político de Ecuador como la solicitud de una Asamblea Constituyente

Emprendimiento femenino en pandemia. Una realidad en las mujeres de la zona noroeste de Guayaquil, Ecuador

The pandemic product of COVID-19 has disrupted every corner of the world, Ecuador is not the exception but beyond the social and economic problems that it has brought with it, it has been essential to achieve the development of new female ventures that have been a fundamental basis to achieve the sustenance of the families in the northwest of Guayaquil. The general objective of this research is to analyze female entrepreneurship in Pandemic as a reality present in women in the northwest of Guayaquil. As a conclusion, it is determined that a large number of women in the northwest area of ​​Guayaquil take the step to enter the world of entrepreneurship, although it has been by necessity the purpose of getting ahead and being able to meet the needs that push them to be more and more active. Within the economy of the country, managing to erase the existing inequality gaps in front of men, this has allowed breaking barriers, and at present with fallen economies and high unemployment rates help to make the reality of these women belonging to the area of northwest of Guayaquil can improve, giving an impulse to achieve economic independence, and income of resources that give them the opportunity to be able to meet their needs, being collaborators of the expenses in their homes and even being in charge of carrying the daily sustenance.La pandemia producto de la COVID-19 ha trastocado a cada rincón del mundo, Ecuador no es la excepción pero más allá de los problemas sociales y económicos que ha traído consigo ha sido fundamental para lograr el desarrollo de nuevos emprendimientos femeninos básicos para el sustento de las familias en la zona noroeste de Guayaquil. El objetivo general de esta investigación es analizar el emprendimiento femenino en pandemia como una realidad presente en las mujeres de la zona noroeste de Guayaquil. Como conclusión se determina que un gran número de mujeres de esta zona den el paso para adentrarse al mundo del emprendimiento, si bien ha sido por necesidad, el propósito de salir adelante y poder suplir las necesidades las empujan a ser cada vez más activas dentro de la economía del país, logrando borrar las brechas de desigualdad existente frente a los hombres, este ha permitido romper barreras, y en esta actualidad con economías caídas y tasas de desempleo elevadas ayudan a que la realidad de estas mujeres pueda mejorar, dando un impulso a lograr independencia económica, e ingreso de recursos que le den la oportunidad de suplir sus necesidades, siendo colaboradoras de los gastos en sus hogares y hasta las encargadas de llevar el sustento diario.La pandemia producto de la COVID-19 ha trastocado a cada rincón del mundo, Ecuador no es la excepción pero más allá de los problemas sociales y económicos que ha traído consigo ha sido fundamental para lograr el desarrollo de nuevos emprendimientos femeninos básicos para el sustento de las familias en la zona noroeste de Guayaquil. El objetivo general de esta investigación es analizar el emprendimiento femenino en pandemia como una realidad presente en las mujeres de la zona noroeste de Guayaquil. Como conclusión se determina que un gran número de mujeres de esta zona den el paso para adentrarse al mundo del emprendimiento, si bien ha sido por necesidad, el propósito de salir adelante y poder suplir las necesidades las empujan a ser cada vez más activas dentro de la economía del país, logrando borrar las brechas de desigualdad existente frente a los hombres, este ha permitido romper barreras, y en esta actualidad con economías caídas y tasas de desempleo elevadas ayudan a que la realidad de estas mujeres pueda mejorar, dando un impulso a lograr independencia económica, e ingreso de recursos que le den la oportunidad de suplir sus necesidades, siendo colaboradoras de los gastos en sus hogares y hasta las encargadas de llevar el sustento diario

Rice F-bZIP transcription factors regulate the zinc deficiency response

The F-bZIP transcription factors bZIP19 and bZIP23 are the central regulators of the zinc deficiency response in Arabidopsis, and phylogenetic analysis of F-bZIP homologs across land plants indicates that the regulatory mechanism of the zinc deficiency response may be conserved. Here, we identified the rice F-bZIP homologs and investigated their function. OsbZIP48 and OsbZIP50, but not OsbZIP49, complement the zinc deficiency-hypersensitive Arabidopsis bzip19bzip23 double mutant. Ectopic expression of OsbZIP50 in Arabidopsis significantly increases plant zinc accumulation under control zinc supply, suggesting an altered Zn sensing in OsbZIP50. In addition, we performed a phylogenetic analysis of F-bZIP homologs from representative monocot species that supports the branching of plant F-bZIPs into Group 1 and Group 2. Our results suggest that regulation of the zinc deficiency response in rice is conserved, with OsbZIP48 being a functional homolog of AtbZIP19 and AtbZIP23. A better understanding of the mechanisms behind the Zn deficiency response in rice and other important crops will contribute to develop plant-based strategies to address the problems of Zn deficiency in soils, crops, and cereal-based human diets.</p

The Arabidopsis bZIP19 and bZIP23 Activity Requires Zinc Deficiency – Insight on Regulation From Complementation Lines

All living organisms require zinc as an essential micronutrient. Maintaining appropriate intracellular zinc supply, and avoiding deficiency or toxic excess, requires a tight regulation of zinc homeostasis. In Arabidopsis, bZIP19 and bZIP23 (basic-leucine zipper) transcription factors are the central regulators of the zinc deficiency response. Their targets include members of the ZIP (Zrt/Irt-like Protein) transporter family, involved in cellular zinc uptake, which are up-regulated at zinc deficiency. However, the mechanisms by which these transcription factors are regulated by cellular zinc status are not yet known. Here, to further our insight, we took advantage of the zinc deficiency hypersensitive phenotype of the bzip19 bzip23 double mutant, and used it as background to produce complementation lines of each Arabidopsis F-bZIP transcription factor, including bZIP24. On these lines, we performed complementation and localization studies, analyzed the transcript level of a subset of putative target genes, and performed elemental tissue profiling. We find evidence supporting that the zinc-dependent activity of bZIP19 and bZIP23 is modulated by zinc at protein level, in the nucleus, where cellular zinc sufficiency represses their activity and zinc deficiency is required. In addition, we show that these two transcription factors are functionally redundant to a large extent, and that differential tissue-specific expression patterns might, at least partly, explain distinct regulatory activities. Finally, we show that bZIP24 does not play a central role in the Zn deficiency response. Overall, we provide novel information that advances our understanding of the regulatory activity of bZIP19 and bZIP23

Análise da capacidade funcional de pacientes com doença pulmonar obstrutiva crônica submetidos à reabilitação pulmonar / Analysis of the functional capacity of patients with chronic obstructive pulmonary disease submitted to pulmonary rehabilitation

Introdução: A Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) promove inatividade gerando prejuízo da capacidade de exercício por meio da redução de massa muscular, ocasionando além das manifestações pulmonares os efeitos sistêmicos, como a perda involuntária de peso e disfunção muscular. Neste contexto, Programas de Reabilitação Pulmonar (PRP), têm mostrado efeitos benéficos sobre a capacidade de exercício e sintomas em pacientes com DPOC. Objetivo: Analisar a capacidade funcional de pacientes portadores de DPOC por meio do teste de caminhada de seis minutos (TC6) nas fases pré e pós PRP. Metodologia: Trata-se de um ensaio clínico analítico, longitudinal, prospectivo e quantitativo, de escala local, no qual cinco pacientes portadores de DPOC, foram submetidos a um PRP. Antes e após o PRP foi avaliada a capacidade funcional através do TC6. O tratamento estatístico dos dados foi realizado através do Pacote Estatístico SPSS 19.0, foi aplicado o teste t de Student. Adotou-se nível de significância p&lt;0,05. Resultado: A terapêutica adotada junto à amostra não foi capaz de promover alterações estatísticas significativas (p=0,11) na distância percorrida no TC6. Conclusão: Embora tenha havido aumento discreto na distância percorrida no TC6 após o PRP, não houve alteração estatística significativa na capacidade funcional de pacientes com DPOC