Untersuchungen zur Biodistribution multipotenter mesenchymaler Stromazellen nach intraläsionaler Applikation in induzierte Defekte equiner Oberflächlicher Beugesehnen

Einleitung: Die Tendinopathie der Oberflächlichen Beugesehne (OBS) ist eine häufig auftretende orthopädische Erkrankung beim Pferd, die meist zu einer langfristigen oder sogar endgültigen Leistungsdepression führt. Bisher besteht kein therapeutischer Goldstandard, jedoch wird die Therapie mit multipotenten mesenchymalen Stromazellen (MSC) als aussichtsreich erachtet. Der Verbleib und der Wirkmechanismus dieser Zellen nach lokaler Applikation sind nicht hinreichend bekannt. Eine kombinierte Markierung der MSC mit superparamagnetischen Eisenoxidpartikeln (SPIO) und dem Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin B ermöglicht die Analyse der Biodistribution mit Hilfe von Magnetresonanztomographie (MRT), histologischen und fluoreszenzbasierten Untersuchungen. Ziele: Wesentliches Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der lokalen Distribution intraläsional applizierter MSC sowie die Untersuchung einer potentiellen systemischen Verteilung und gezielten Einwanderung in anderes geschädigtes Gewebe. Weiterhin sollte die Anwendung des Magic Angle- Effektes in der MRT bezüglich Durchführbarkeit an stehenden Pferden und Effektivität des Zelltrackings evaluiert werden. Tiere, Material und Methoden: Bei 6 Pferden wurden im mittleren Teil der metakarpalen/-tarsalen OBS aller 4 Gliedmaßen Sehnenläsionen auf mechanisch-enzymatischem Wege induziert. Die für die Applikation aus Fettgewebe der Glutealregion gewonnenen, autologen MSC wurden mit Molday ION Rhodamine B (BioPAL, Inc., Worcester, USA) markiert. 3 Wochen nach Defektinduktion erfolgte die intraläsional Applikation der markierten MSC in die OBS einer Vorder- und einer Hintergliedmaße und Serum in die kontralateralen Kontrolldefekte. Im Zeitraum der Zellapplikation wurden mehrere venöse Blutproben durchflusszytometrisch auf Rhodamin B-positive Zellen hin untersucht. Insgesamt erfolgten 10 MRT-Untersuchungen der Vordergliedmaßen bis zur 24. Woche nach Zellapplikation in denen Standard- und Magic Angle-Aufnahmen angefertigt wurden. Bis zur 3. Woche nach Zellapplikation erfolgten 4 Standard-MRT-Untersuchungen der Hintergliedmaßen. T1- und T2*- gewichtete Sequenzen dienten bei beiden Aufnahmetechniken der Beurteilung SPIO-bedingter hypointenser Artefakte. 3 Wochen nach der Zellapplikation wurden Biopsien aus den OBS der Hintergliedmaßen entnommen. Zum gleichen Zeitpunkt erfolgte die Entnahme von subkutanem Fett- und Muskelgewebe aus dem Bereich der Fettentnahmestelle und aus der unbeschädigten kontralateralen Glutealregion. 24 Wochen nach Zellapplikation wurden die Tiere euthanasiert und die OBS der Vordergliedmaßen entnommen. Alle Gewebeproben wurden histologisch (Preußisch Blau Färbung) und fluoreszenzbasiert (Fluoreszenzmikroskopie, Durchflusszytometrie) untersucht. Ergebnisse: SPIO-bedingte hypointense Artefakte waren über 24 Wochen in MRT-Aufnahmen der MSC-behandelten OBS vorhanden. Die Signalintensität war konstant niedrig, jedoch verringerte sich das Volumen der hypointensen Artefakte mit der Zeit. Diese ließ ein Abnehmen der Zahl markierter MSC vermuten, was in histologischen Analysen bestätigt wurde. Der Magic Angle-Effekt konnte in allen OBS der Vordergliedmaßen und zu allen Zeitpunkten erzeugt werden. Die Abgrenzbarkeit der hypointensen Artefakte gegenüber dem in Standard-MRT-Aufnahmen hypointensen gesunden Sehnengewebe erhöhte sich, jedoch gab es keine Unterschiede in der Volumenmessung der SPIO- bedingten hypointensen Artefakte zwischen Standard- und Magic Angle-Aufnahmen. Histologisch konnten intrazelluläre Preußisch Blau-positive Zellen in den MSC-behandelten und kontralateralen Sehnenläsionen sowie in anderem geschädigten Gewebe detektiert werden. Diese Beobachtungen bestätigten sich durch den Nachweis Rhodamin B-positiver Zellen. Durchflusszytometrische Untersuchungen von Blutproben zeigten, dass Rhodamin B-positive Zellen vor allem innerhalb der ersten 12 Stunden nach der Zellapplikation im venösen Blut vorhanden waren. Die intraläsional applizierten MSC verblieben hauptsächlich in der behandelten Sehnenläsionen, welches durch das konstant niedrige Signal der Artefakte in der MRT und durch die Detektion markierter Zellen in entsprechenden histologischen Proben belegt wurde. Schlussfolgerung: Eine langfristige Verfolgung SPIO-markierter MSC ist in vivo im MRT durch beide Aufnahmetechniken möglich. Die Abgrenzbarkeit SPIO-bedingter hypointenser Artefakte kann durch den Magic Angle-Effekt erhöht werden. Allerdings ist die Sensitivität der Zellverfolgung in der MRT begrenzt und somit kann eine geringe Zellmigration nicht detektiert werden. Trotz der Hinweise auf eine systemische Verteilung und Migration der markierten Zellen in anderes geschädigtes Gewebe, verbleibt ein Großteil der markierten MSC nach der intraläsionalen Injektion in der behandelten OBS

Long-Term Cell Tracking Following Local Injection of Mesenchymal Stromal Cells in the Equine Model of Induced Tendon Disease.

Tendon disease has been treated with multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) in the equine large-animal model with promising success. The aim of this study was to gain more insight into the fate and biodistribution of MSCs after local application into tendon lesions by long-term cell tracking in this large-animal model. Superficial digital flexor tendon lesions were induced in all limbs in six horses and injected with 10 × 10 6 Molday ION Rhodamine B™-labeled MSCs suspended in serum or serum alone. Follow-up was performed using low-field magnetic resonance imaging (MRI), flow cytometry, and histology. Cell tracking based on the hypointense artifacts induced by the superparamagnetic iron oxide (SPIO) labeling agent in MRI as well as based on Rhodamine B fluorescence was feasible. However, Prussian blue staining for assessment of histology was not entirely specific for SPIO. Labeled cells could be traced at their injection site by MRI as well as histology for the whole follow-up period of 24 weeks. Although the numbers of labeled cells within the injected tendon lesions decreased over time, part of the applied cells appeared to remain viable and integrated within the injured tissue. Furthermore, small numbers of labeled cells were identified in peripheral blood within the first 24 h after cell injection and could also be found until week 24 within the contralateral control tendon lesions that had been injected with serum. The present findings unveil details on MSC biodistribution and persistence after their local application, which are of clinical relevance with regard to MSC safety and mechanisms of action

Long-Term Cell Tracking Following Local Injection of Mesenchymal Stromal Cells in the Equine Model of Induced Tendon Disease

Tendon disease has been treated with multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) in the equine large-animal model with promising success. The aim of this study was to gain more insight into the fate and biodistribution of MSCs after local application into tendon lesions by long-term cell tracking in this large-animal model. Superficial digital flexor tendon lesions were induced in all limbs in six horses and injected with 10106 Molday ION Rhodamine B-labeled MSCs suspended in serum or serum alone. Follow-up was performed using low-field magnetic resonance imaging (MRI), flow cytometry, and histology. Cell tracking based on the hypointense artifacts induced by the superparamagnetic iron oxide (SPIO) labeling agent in MRI as well as based on Rhodamine B fluorescence was feasible. However, Prussian blue staining for assessment of histology was not entirely specific for SPIO. Labeled cells could be traced at their injection site by MRI as well as histology for the whole follow-up period of 24 weeks. Although the numbers of labeled cells within the injected tendon lesions decreased over time, part of the applied cells appeared to remain viable and integrated within the injured tissue. Furthermore, small numbers of labeled cells were identified in peripheral blood within the first 24 h after cell injection and could also be found until week 24 within the contralateral control tendon lesions that had been injected with serum. The present findings unveil details on MSC biodistribution and persistence after their local application, which are of clinical relevance with regard to MSC safety and mechanisms of action

In Vivo Magic Angle Magnetic Resonance Imaging for Cell Tracking in Equine Low-Field MRI.

The magic angle effect increases the MRI signal of healthy tendon tissue and could be used for more detailed evaluation of tendon structure. Furthermore, it could support the discrimination of hypointense artefacts induced by contrast agents such as superparamagnetic iron oxide used for cell tracking. However, magic angle MRI of the equine superficial digital flexor tendon has not been accomplished in vivo in standing low-field MRI so far. The aim of this in vivo study was to evaluate the practicability of this magic angle technique and its benefit for tracking superparamagnetic iron oxide-labelled multipotent mesenchymal stromal cells. Six horses with induced tendinopathy in their forelimb superficial digital flexor tendons were injected locally either with superparamagnetic iron oxide-labelled multipotent mesenchymal stromal cells or serum. MRI included standard and magic angle image series in T1- and T2∗-weighted sequences performed at regular intervals. Image analysis comprised blinded evaluation and quantitative assessment of signal-to-noise ratio. The magic angle technique enhanced the tendon signal-to-noise ratio (P < 0.001). Hypointense artefacts were observable in the cell-injected superficial digital flexor tendons over 24 weeks and artefact signal-to-noise ratio differed significantly from tendon signal-to-noise ratio in the magic angle images (P < 0.001). Magic angle imaging of the equine superficial digital flexor tendon is feasible in standing low-field MRI. The current data demonstrate that the technique improves discrimination of superparamagnetic iron oxide-induced artefacts from the surrounding tendon tissue.Peer Reviewe

Untersuchungen zur Biodistribution multipotenter mesenchymaler Stromazellen nach intraläsionaler Applikation in induzierte Defekte equiner Oberflächlicher Beugesehnen

Einleitung: Die Tendinopathie der Oberflächlichen Beugesehne (OBS) ist eine häufig auftretende orthopädische Erkrankung beim Pferd, die meist zu einer langfristigen oder sogar endgültigen Leistungsdepression führt. Bisher besteht kein therapeutischer Goldstandard, jedoch wird die Therapie mit multipotenten mesenchymalen Stromazellen (MSC) als aussichtsreich erachtet. Der Verbleib und der Wirkmechanismus dieser Zellen nach lokaler Applikation sind nicht hinreichend bekannt. Eine kombinierte Markierung der MSC mit superparamagnetischen Eisenoxidpartikeln (SPIO) und dem Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin B ermöglicht die Analyse der Biodistribution mit Hilfe von Magnetresonanztomographie (MRT), histologischen und fluoreszenzbasierten Untersuchungen. Ziele: Wesentliches Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der lokalen Distribution intraläsional applizierter MSC sowie die Untersuchung einer potentiellen systemischen Verteilung und gezielten Einwanderung in anderes geschädigtes Gewebe. Weiterhin sollte die Anwendung des Magic Angle- Effektes in der MRT bezüglich Durchführbarkeit an stehenden Pferden und Effektivität des Zelltrackings evaluiert werden. Tiere, Material und Methoden: Bei 6 Pferden wurden im mittleren Teil der metakarpalen/-tarsalen OBS aller 4 Gliedmaßen Sehnenläsionen auf mechanisch-enzymatischem Wege induziert. Die für die Applikation aus Fettgewebe der Glutealregion gewonnenen, autologen MSC wurden mit Molday ION Rhodamine B (BioPAL, Inc., Worcester, USA) markiert. 3 Wochen nach Defektinduktion erfolgte die intraläsional Applikation der markierten MSC in die OBS einer Vorder- und einer Hintergliedmaße und Serum in die kontralateralen Kontrolldefekte. Im Zeitraum der Zellapplikation wurden mehrere venöse Blutproben durchflusszytometrisch auf Rhodamin B-positive Zellen hin untersucht. Insgesamt erfolgten 10 MRT-Untersuchungen der Vordergliedmaßen bis zur 24. Woche nach Zellapplikation in denen Standard- und Magic Angle-Aufnahmen angefertigt wurden. Bis zur 3. Woche nach Zellapplikation erfolgten 4 Standard-MRT-Untersuchungen der Hintergliedmaßen. T1- und T2*- gewichtete Sequenzen dienten bei beiden Aufnahmetechniken der Beurteilung SPIO-bedingter hypointenser Artefakte. 3 Wochen nach der Zellapplikation wurden Biopsien aus den OBS der Hintergliedmaßen entnommen. Zum gleichen Zeitpunkt erfolgte die Entnahme von subkutanem Fett- und Muskelgewebe aus dem Bereich der Fettentnahmestelle und aus der unbeschädigten kontralateralen Glutealregion. 24 Wochen nach Zellapplikation wurden die Tiere euthanasiert und die OBS der Vordergliedmaßen entnommen. Alle Gewebeproben wurden histologisch (Preußisch Blau Färbung) und fluoreszenzbasiert (Fluoreszenzmikroskopie, Durchflusszytometrie) untersucht. Ergebnisse: SPIO-bedingte hypointense Artefakte waren über 24 Wochen in MRT-Aufnahmen der MSC-behandelten OBS vorhanden. Die Signalintensität war konstant niedrig, jedoch verringerte sich das Volumen der hypointensen Artefakte mit der Zeit. Diese ließ ein Abnehmen der Zahl markierter MSC vermuten, was in histologischen Analysen bestätigt wurde. Der Magic Angle-Effekt konnte in allen OBS der Vordergliedmaßen und zu allen Zeitpunkten erzeugt werden. Die Abgrenzbarkeit der hypointensen Artefakte gegenüber dem in Standard-MRT-Aufnahmen hypointensen gesunden Sehnengewebe erhöhte sich, jedoch gab es keine Unterschiede in der Volumenmessung der SPIO- bedingten hypointensen Artefakte zwischen Standard- und Magic Angle-Aufnahmen. Histologisch konnten intrazelluläre Preußisch Blau-positive Zellen in den MSC-behandelten und kontralateralen Sehnenläsionen sowie in anderem geschädigten Gewebe detektiert werden. Diese Beobachtungen bestätigten sich durch den Nachweis Rhodamin B-positiver Zellen. Durchflusszytometrische Untersuchungen von Blutproben zeigten, dass Rhodamin B-positive Zellen vor allem innerhalb der ersten 12 Stunden nach der Zellapplikation im venösen Blut vorhanden waren. Die intraläsional applizierten MSC verblieben hauptsächlich in der behandelten Sehnenläsionen, welches durch das konstant niedrige Signal der Artefakte in der MRT und durch die Detektion markierter Zellen in entsprechenden histologischen Proben belegt wurde. Schlussfolgerung: Eine langfristige Verfolgung SPIO-markierter MSC ist in vivo im MRT durch beide Aufnahmetechniken möglich. Die Abgrenzbarkeit SPIO-bedingter hypointenser Artefakte kann durch den Magic Angle-Effekt erhöht werden. Allerdings ist die Sensitivität der Zellverfolgung in der MRT begrenzt und somit kann eine geringe Zellmigration nicht detektiert werden. Trotz der Hinweise auf eine systemische Verteilung und Migration der markierten Zellen in anderes geschädigtes Gewebe, verbleibt ein Großteil der markierten MSC nach der intraläsionalen Injektion in der behandelten OBS

Untersuchungen zur Biodistribution multipotenter mesenchymaler Stromazellen nach intraläsionaler Applikation in induzierte Defekte equiner Oberflächlicher Beugesehnen

Einleitung: Die Tendinopathie der Oberflächlichen Beugesehne (OBS) ist eine häufig auftretende orthopädische Erkrankung beim Pferd, die meist zu einer langfristigen oder sogar endgültigen Leistungsdepression führt. Bisher besteht kein therapeutischer Goldstandard, jedoch wird die Therapie mit multipotenten mesenchymalen Stromazellen (MSC) als aussichtsreich erachtet. Der Verbleib und der Wirkmechanismus dieser Zellen nach lokaler Applikation sind nicht hinreichend bekannt. Eine kombinierte Markierung der MSC mit superparamagnetischen Eisenoxidpartikeln (SPIO) und dem Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin B ermöglicht die Analyse der Biodistribution mit Hilfe von Magnetresonanztomographie (MRT), histologischen und fluoreszenzbasierten Untersuchungen. Ziele: Wesentliches Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der lokalen Distribution intraläsional applizierter MSC sowie die Untersuchung einer potentiellen systemischen Verteilung und gezielten Einwanderung in anderes geschädigtes Gewebe. Weiterhin sollte die Anwendung des Magic Angle- Effektes in der MRT bezüglich Durchführbarkeit an stehenden Pferden und Effektivität des Zelltrackings evaluiert werden. Tiere, Material und Methoden: Bei 6 Pferden wurden im mittleren Teil der metakarpalen/-tarsalen OBS aller 4 Gliedmaßen Sehnenläsionen auf mechanisch-enzymatischem Wege induziert. Die für die Applikation aus Fettgewebe der Glutealregion gewonnenen, autologen MSC wurden mit Molday ION Rhodamine B (BioPAL, Inc., Worcester, USA) markiert. 3 Wochen nach Defektinduktion erfolgte die intraläsional Applikation der markierten MSC in die OBS einer Vorder- und einer Hintergliedmaße und Serum in die kontralateralen Kontrolldefekte. Im Zeitraum der Zellapplikation wurden mehrere venöse Blutproben durchflusszytometrisch auf Rhodamin B-positive Zellen hin untersucht. Insgesamt erfolgten 10 MRT-Untersuchungen der Vordergliedmaßen bis zur 24. Woche nach Zellapplikation in denen Standard- und Magic Angle-Aufnahmen angefertigt wurden. Bis zur 3. Woche nach Zellapplikation erfolgten 4 Standard-MRT-Untersuchungen der Hintergliedmaßen. T1- und T2*- gewichtete Sequenzen dienten bei beiden Aufnahmetechniken der Beurteilung SPIO-bedingter hypointenser Artefakte. 3 Wochen nach der Zellapplikation wurden Biopsien aus den OBS der Hintergliedmaßen entnommen. Zum gleichen Zeitpunkt erfolgte die Entnahme von subkutanem Fett- und Muskelgewebe aus dem Bereich der Fettentnahmestelle und aus der unbeschädigten kontralateralen Glutealregion. 24 Wochen nach Zellapplikation wurden die Tiere euthanasiert und die OBS der Vordergliedmaßen entnommen. Alle Gewebeproben wurden histologisch (Preußisch Blau Färbung) und fluoreszenzbasiert (Fluoreszenzmikroskopie, Durchflusszytometrie) untersucht. Ergebnisse: SPIO-bedingte hypointense Artefakte waren über 24 Wochen in MRT-Aufnahmen der MSC-behandelten OBS vorhanden. Die Signalintensität war konstant niedrig, jedoch verringerte sich das Volumen der hypointensen Artefakte mit der Zeit. Diese ließ ein Abnehmen der Zahl markierter MSC vermuten, was in histologischen Analysen bestätigt wurde. Der Magic Angle-Effekt konnte in allen OBS der Vordergliedmaßen und zu allen Zeitpunkten erzeugt werden. Die Abgrenzbarkeit der hypointensen Artefakte gegenüber dem in Standard-MRT-Aufnahmen hypointensen gesunden Sehnengewebe erhöhte sich, jedoch gab es keine Unterschiede in der Volumenmessung der SPIO- bedingten hypointensen Artefakte zwischen Standard- und Magic Angle-Aufnahmen. Histologisch konnten intrazelluläre Preußisch Blau-positive Zellen in den MSC-behandelten und kontralateralen Sehnenläsionen sowie in anderem geschädigten Gewebe detektiert werden. Diese Beobachtungen bestätigten sich durch den Nachweis Rhodamin B-positiver Zellen. Durchflusszytometrische Untersuchungen von Blutproben zeigten, dass Rhodamin B-positive Zellen vor allem innerhalb der ersten 12 Stunden nach der Zellapplikation im venösen Blut vorhanden waren. Die intraläsional applizierten MSC verblieben hauptsächlich in der behandelten Sehnenläsionen, welches durch das konstant niedrige Signal der Artefakte in der MRT und durch die Detektion markierter Zellen in entsprechenden histologischen Proben belegt wurde. Schlussfolgerung: Eine langfristige Verfolgung SPIO-markierter MSC ist in vivo im MRT durch beide Aufnahmetechniken möglich. Die Abgrenzbarkeit SPIO-bedingter hypointenser Artefakte kann durch den Magic Angle-Effekt erhöht werden. Allerdings ist die Sensitivität der Zellverfolgung in der MRT begrenzt und somit kann eine geringe Zellmigration nicht detektiert werden. Trotz der Hinweise auf eine systemische Verteilung und Migration der markierten Zellen in anderes geschädigtes Gewebe, verbleibt ein Großteil der markierten MSC nach der intraläsionalen Injektion in der behandelten OBS

Treatment of Naturally Occurring Tendon Disease with Allogeneic Multipotent Mesenchymal Stromal Cells: A Randomized, Controlled, Triple-Blinded Pilot Study in Horses

The treatment of tendinopathies with multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) is a promising option in equine and human medicine. However, conclusive clinical evidence is lacking. The purpose of this study was to gain insight into clinical treatment efficacy and to identify suitable outcome measures for larger clinical studies. Fifteen horses with early naturally occurring tendon disease were assigned to intralesional treatment with allogeneic adipose-derived MSCs suspended in serum or with serum alone through block randomization (dosage adapted to lesion size). Clinicians and horse owners remained blinded to the treatment during 12 months (seven horses per group) and 18 months (seven MSC-group and five control-group horses) of follow-up including clinical examinations and diagnostic imaging. Clinical inflammation, lameness, and ultrasonography scores improved more over time in the MSC group. The lameness score difference significantly improved in the MSC group compared with the control group after 6 months. In the MSC group, five out of the seven horses were free of re-injuries and back to training until 12 and 18 months. In the control group, three out of the seven horses were free of re-injuries until 12 months. These results suggest that MSCs are effective for the treatment of early-phase tendon disease and provide a basis for a larger controlled study