Ferramentas alternativas para identificação microbiana, determinação de suscetibilidade e detecção de mecanismos de resistência

O papel do laboratório de microbiologia clínica é realizar a identificação do microrganismo, determinar o perfil de suscetibilidade e, quando pertinente, os mecanismos de resistência, o mais breve possível. A microbiologia difere significativamente das demais áreas das análises clínicas, pois os processos são dependentes de crescimento microbiano, resultando em tempo maior para liberação de resultados. Tendo em vista que a replicação microbiana naturalmente demanda tempo, ferramentas para agilização de processos de caracterização microbiana devem ser priorizadas. O teste de referência para detecção de resistência à polimixina B, por exemplo, requer tempo de incubação prolongado (aproximadamente 24h). Tendo em vista a demora para obtenção do perfil de suscetibilidade através de métodos fenotípicos convencionais, se torna ainda mais importante a pesquisa por abordagens que forneçam resultados confiáveis em tempos de incubação menores. Por outro lado, as metodologias que utilizam as técnicas baseadas em espectrometria de massas (técnica de MALDI-TOF) e em amplificação de material genético (técnica de qPCR HRM) são consideradas referência para a identificação microbiana e de enzimas que degradam antiobióticos carbapenêmicos (carbapenemases), respectivamente. Considerando a atual situação sanitária decorrente do crescente aumento no número de casos de COVID-19, mesmo mais de dois anos após o início da pandemia, ainda existe a necessidade de ampliar a testagem através de metodologias que forneçam resultados confiáveis. A principal metodologia para detecção de SARS-CoV-2 é o RT-qPCR. As técnicas acima mencionadas, requerem, no entanto, equipamentos que apresentam elevado investimento inicial, o que os torna restritos a laboratórios de grande porte, com grande demanda de exames. Então um desafio importante é tornar possível que as vantagens dessas tecnologias possam ser utilizadas por laboratórios de pequeno porte. O uso de papel filtro para o transporte de amostras microbianas/biológicas pode facilitar significativamente o envio de microrganismos entre laboratórios. Os objetivos deste trabalho foram avaliar o papel filtro como meio de transporte de microrganismos/espécimes respiratórios inativados para identificação por MALDI-TOF MS, detecção de carbapenemases por qPCR HRM e SARS-Cov-2 por RT-qPCR. Assim como, propor e avaliar métodos rápidos para determinação de suscetibilidade à polimixina B. Para avaliar a capacidade do papel filtro como meio de transporte de microrganismos inativados para identificação por MALDI-TOF MS, foram avaliados 363 isolados da Ordem Enterobacterales, Bacilos Gram-negativos não-fermentadores, Haemophilus influenzae, micobactérias não tuberculosas e leveduras. Para detecção de carbapenemases por qPCR HRM foram avaliados 88 isolados da Ordem Enterobacterales. Para a detecção de SARS-CoV-2 por RT-qPCR foram avaliados 40 espécimes respiratórios de oro/nasofaringe transportados em papel de filtro. Os isolados/espécimes respiratórios foram inativados, impregnados em discos de papel filtro estéril, as proteínas (para identificação em MALDI-TOF MS) e o material genético (para as técnicas de qPCR HRM e RT-qPCR) foram extraídos. Os resultados após a impregnação em papel filtro foram comparados com os resultados diretamente da colônia/espécime respiratório. Para avaliação da leitura antecipada da microdiluição em caldo para polimixina B comparamos a concentração inibitória mínima (CIM) de 192 isolados de Bacilos Gram-negativos (Enterobacterales, Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa) obtida em 8-9h de incubação (leitura antecipada) e em 16-20h de incubação (leitura padronizada) da microdiuição em caldo para polimixina B. Além disso, deselvolvemos um novo teste qualitativo de suscetibilidade à polimixina B através do MALDI-TOF MS (MALDI POLYMYXIN TEST – MPT). Para essa proposta, comparamos os resultados de microdiluição em caldo de polimixina B de 95 isolados de Enterobacterales frente ao MPT. Considerando a correta identificação dos isolados com scores >1.7 em MALDI-TOF MS, 354/363 isolados apresentaram a mesma identificação diretamente da colônia e após o processo de impregnação em papel filtro. O método de transporte de microrganismo inativado apresentou alta sensibilidade (97,6%) e especificidade (100%) quando comparados a identificação realizada diretamente da colônia. O papel filtro também foi avaliado quanto a capacidade de transportar isolados bacterianos inativados para detecção de carbapenemases por qPCR HRM e 87/88 isolados apresentaram o mesmo resultado (presença ou ausência de carbapenemases). Apenas um isolado caracterizado previamente como blaNDM não apresentou o resultado esperado após a impregnação em papel filtro. Esse teste apresentou sensibilidade de 98,86% e especificidade de 100%. O papel filtro foi utilizado para o transporte de espécime respiratório para pesquisa de SARS-Cov-2 e apresentou resultados excelentes de concordância (97,2%) com o resultado obtido da extração direta do espécime respiratório. A leitura antecipada da técnica de microdiluição em caldo para polimixina B e o MPT apresentaram 97,9% e 95,8% de concordância categórica com o método de referência, respectivamente. O papel filtro pode ser utilizado como meio de transporte alternativo para os microrganismos e metodologias supracitadas. Tanto a leitura antecipada da microdiluição em caldo para polimixina B quanto o MPT apresentaram alta concordância com a microdiluição em caldo; portanto, essas metodologias poderiam ser empregadas na rotina do laboratório de microbiologia e possibilitariam a liberação do resultado de suscetibilidade à polimixina B no mesmo dia em que a bactéria é identificada.The role of the microbiology laboratory is to perform microorganism identification, to determine susceptibility profile and, when relevant, resistance mechanisms, as soon as possible. Microbiology differs from other areas of clinical analysis, as the processes are dependent of microbial growth, resulting in longer times to release results. Since microbial replication naturally takes time, approaches to optimize microbial characterization procedures must be prioritized. The reference method to detect polymyxin B resistance requires prolonged incubation time (approximately 24h). Due to delays in the susceptibility tests results using conventional phenotypic methods, research on approaches that could provide reliable results in shorter incubation times are important. Methodologies based on mass spectrometry (MALDI-TOF) and amplification of genetic material (qPCR HRM) are reference for the microbial identification and detection of carbapenemases, respectively. Considering the current health scenery due to the increase of COVID-19 cases, there is still a need to expand testing using reliable methodologies. The RT-qPCR is the main methodology to SARS-CoV-2 detection. All mentioned techniques require equipment with high investment, being only accessible to laboratories with high demand of exams. An important challenge is to enable the advantages of these technologies to be used by small laboratories. The use of filter paper to transport microbial/biological samples can be an advantage to send microorganisms between laboratories. This study aimed to evaluate filter paper as a means of transporting inactivated microorganisms/respiratory specimens to be identified by MALDI-TOF MS and for carbapenemases and SARS-CoV-2 detection by qPCR HRM and RT-qPCR, respectively. Moreover, to propose and evaluate rapid methods to determine polymyxin B susceptibility. For evaluate filter paper as a means of transporting inactivated microorganisms to identification in MALDI-TOF MS, 363 isolates of Enterobacterales, Gram-negative non-fermentative, Haemophilus influenzae, nontuberculous mycobacteria and yeasts were evaluated. For the filter paper evaluation for carbapenemases detection by qPCR HRM, 88 isolates of Enterobacterales were evaluated. For the filter paper evaluation for SARS-CoV-2 detection by RT-qPCR, 40 oro/nasopharyngeal respiratory specimens transported in filter paper were evaluated. Isolates/respiratory specimens were inactivated, impregnated in sterile filter paper disks, and proteins (for MALDI-TOF MS identification) and genetical material (for qPCR HRM and RT-qPCR methodologies) were extracted. Results after impregnation were compared to results obtained directly from colony/respiratory specimens. For the early reading of broth microdilution (BMD) for polymyxin B, minimal inhibitory concentration (MIC) of 192 isolates (Enterobacterales, A. baumannii e P. aeruginosa) were compared in 8-9h (early reading) and 16-20h (standard reading) of incubation of polymyxin B BMD. In addition, we described a new qualitative polymyxin B susceptibility test using MALDI-TOF MS (MALDI POLYMYXIN TEST – MPT). For this purpose, we compared MPT results of 95 Enterobacterales isolates with polymyxin B BMD. Considering the correct isolate identification with scores > 1.7 in MALDI-TOF MS, 354/363 isolates presented the same identification directly from the colony and after impregnation in filter paper. The method of transporting inactivated microorganism presented high sensitivity (97.6%) and specificity (100%) when compared to the identification performed directly from the colony. For the carbapenemases detection by qPCR HRM after filter paper impregnation, 87/88 isolates presented the same result (presence or absence of carbapenemases), resulting in 98.86% of sensitivity and 100% of specificity. Only one isolate previously characterized as blaNDM did not present the expected result. The filter paper evaluation for SARS-CoV-2 detection by RT-qPCR presented excellent results of concordance (97.2%) compared with the direct extraction of the respiratory specimens. The early reading of polymyxin B BMD and MPT presented 97.9% and 95.8% of categorical agreement with the reference method, respectively. The filter paper can be used as an alternative means of transporting of microorganisms in order to carry out methodologies above-mentioned. Both early reading of polymyxin B and MPT presented high concordance with BMD; therefore, these methodologies may be employed in routine of microbiological laboratory and would allow to release polymyxin B results in the same day that bacteria is identified

Lack of association between rrl and erm(41) mutations and clarithromycin resistance in Mycobacterium abscessus complex

BACKGROUND Mycobacterium abscessus complex (MABC) includes species with high resistance rates among mycobacterial pathogens. In fact, MABC infections may not respond to clarithromycin treatment, which has historically been very effective against MABC infection. Molecular markers have been proposed to detect both acquired (rrl polymorphisms) and inducible (erm(41) polymorphisms) clarithromycin resistance in MABC isolates. OBJECTIVES This study aimed to evaluate the susceptibility profile and molecular markers of clarithromycin resistance in MABC. METHODS The clarithromycin susceptibility profile was determined by broth microdilution with reads on days 3, 5, 7 and 14. Mutations in the rrl and erm(41) genes were evaluated by polymerase chain reaction (PCR) using specific primers, followed by sequencing. FINDINGS A total of 14 M. abscessus subsp. abscessus isolates and 28 M. abscessus subsp. massiliense isolates were evaluated, and clarithromycin resistance was observed in all isolates for up to three days of incubation. None of the 42 isolates exhibited a point mutation in the rrl gene, while all the isolates had a T28 polymorphism in the erm(41) gene. Moreover, all 28 M. abscessus subsp. massiliense isolates had a deletion in the erm(41) gene. MAIN CONCLUSIONS While all the MABC isolates exhibited acquired clarithromycin resistance, no isolates exhibited a point mutation in the rrl gene in this study. The M. abscessus subsp. massiliense isolates demonstrated clarithromycin resistance, which is an uncommon phenotype. The molecular data for the rrl and erm(41) genes were not consistent with the phenotypic test results of clarithromycin susceptibility, indicating a lack of correlation between molecular clarithromycin resistance markers for both acquired and inducible resistance

Doença pulmonar por micobactérias não tuberculosas em uma região de alta incidência de tuberculose no Brasil

Objective: The incidence of lung disease caused by nontuberculous mycobacteria (NTM) has been increasing worldwide. In Brazil, there are few studies about nontuberculous mycobacterial lung disease (NTMLD), and its prevalence is yet to be known. Our objective was to determine the specific etiology of the disease in the state of Rio Grande do Sul, Brazil, as well as the frequency and diversity of NTM species in our sample of patients. Methods: This is a retrospective analysis of the medical records of patients diagnosed with NTMLD treated in a referral center located in the city of Porto Alegre, Brazil, between 2003 and 2013. Results: Our sample comprised 100 patients. The most prevalent NTM species were Mycobacterium avium complex (MAC), in 35% of the cases; M. kansasii, in 17%; and M. abscessus, in 12%. A total of 85 patients had received previous treatment for tuberculosis. Associated conditions included structural abnormalities in the lungs, such as bronchiectasis, in 23% of the cases; COPD, in 17%; and immunosuppressive conditions, such as AIDS, in 24%. Conclusions: MAC and M. kansasii were the most prevalent species involved in NTMLD in the state, similarly to what occurs in other regions of Brazil. Data on regional epidemiology of NTMLD, its specific etiology, and associated conditions are essential to establish appropriate treatment, since each species requires specific regimens. Most patients with NTMLD had received previous tuberculosis treatment, which might lead to development of resistance and late diagnosis.Objetivo: A incidência de doença pulmonar causada por micobactérias não tuberculosas (MNT) tem aumentado em todo o mundo. No Brasil, há poucos estudos sobre doença pulmonar por MNT, e sua prevalência ainda não é conhecida. Nosso objetivo foi determinar a etiologia específica da doença no estado do Rio Grande do Sul, bem como a frequência e a diversidade das espécies de MNT em nossa amostra de pacientes. Métodos: Análise retrospectiva dos prontuários de pacientes diagnosticados com doença pulmonar por MNT atendidos em um centro de referência localizado na cidade de Porto Alegre, RS, entre 2003 e 2013. Resultados: Nossa amostra foi composta por 100 pacientes. As espécies de MNT mais prevalentes foram Mycobacterium avium complex (MAC, complexo M. avium), em 35% dos casos; M. kansasii, em 17%; e M. abscessus, em 12%. Um total de 85 pacientes havia feito tratamento anterior para tuberculose. Condições associadas incluíram anormalidades estruturais nos pulmões, como bronquiectasias, em 23% dos casos; DPOC, em 17%; e condições imunossupressoras, como AIDS, em 24%. Conclusões: MAC e M. kansasii foram as espécies mais prevalentes envolvidas na doença pulmonar por MNT no estado, à semelhança do que ocorre em outras regiões do Brasil. Dados sobre a epidemiologia regional da doença pulmonar por MNT, sua etiologia específica e condições associadas são fundamentais para se estabelecer um tratamento adequado, já que cada espécie requer um esquema específico. A maioria dos pacientes com doença pulmonar por MNT havia feito tratamento anterior para tuberculose, o que pode levar a desenvolvimento de resistência e diagnóstico tardio

CISTO ÓSSEO TRAUMÁTICO EM CORPO MANDIBULAR: : UM RELATO DE DOIS CASOS

Introdução: O cisto ósseo traumático é uma lesão intraóssea rara e assintomática, caracterizada por cavidade sem revestimento epitelial, sendo classificado como um pseudocisto.  A sua descoberta é realizada por meio de achados radiográficos de rotina. O objetivo deste trabalho é relatar dois casos clínicos de cisto ósseo traumático em mandíbula. Desenvolvimento: Caso 1: paciente gênero masculino, 17 anos, portando exame radiográfico com imagem radiotransparente em corpo mandibular, assintomático ao exame físico. Ao exame tomográfico, observou-se região hipodensa em corpo mandibular (ápices dentários 47/48) e o mesmo foi submetido a curetagem total da lesão, observou-se loja óssea com ausência de cápsula e discreto sangramento, confirmando hipótese diagnóstica de COT. Caso 2: paciente gênero feminino, 15 anos, portando exame radiográfico de rotina com imagem semelhante, assintomática ao exame físico. Ao exame tomográfico, notou-se região hipodensa em corpo mandibular (ápices dentários 44/45), sendo essa submetida a curetagem total da lesão, com características semelhantes. Os casos apontam neoformação óssea ao acompanhamento radiográfico. Considerações finais: Conclui-se ser primordial o diagnóstico clínico-radiográfico de lesões intraósseas para melhor conduta terapêutica, sendo consenso na literatura os excelentes resultados a longo prazo da curetagem das paredes ósseas como tratamento

Pollen spectrum of honey of Apis mellifera L. and stingless bees (Hymenoptera: Apidae) from the semi-arid region of Bahia State, Brazil

Pollen in honey reflects its botanical origin and melissopalynology is used to identify origin, type, and quantities of pollen grains of the botanical species visited by bees. This study aimed to identify the pollen spectrum of honeys from Apis mellifera and stingless bees produced in the semi-arid region of Bahia, Brazil. We analysed 78 honey samples, which were submitted to the acetolysis process for identification and quantification of pollen types. Fabaceae, Asteraceae and Euphorbiaceae were the most predominant families in pollen types. For Fabaceae, the most representative pollen types were Chamaecrista 1, Mimosa caesalpiniifolia, Mimosa pudica, Mimosa tenuiflora, Prosopis and Senna. The results indicate that the flora explored by the bees to collect nectar is diverse in the semi-arid region of Bahia and the honeys analysed were classified as multifloral.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Pervasive gaps in Amazonian ecological research

Biodiversity loss is one of the main challenges of our time,1,2 and attempts to address it require a clear un derstanding of how ecological communities respond to environmental change across time and space.3,4 While the increasing availability of global databases on ecological communities has advanced our knowledge of biodiversity sensitivity to environmental changes,5–7 vast areas of the tropics remain understudied.8–11 In the American tropics, Amazonia stands out as the world’s most diverse rainforest and the primary source of Neotropical biodiversity,12 but it remains among the least known forests in America and is often underrepre sented in biodiversity databases.13–15 To worsen this situation, human-induced modifications16,17 may elim inate pieces of the Amazon’s biodiversity puzzle before we can use them to understand how ecological com munities are responding. To increase generalization and applicability of biodiversity knowledge,18,19 it is thus crucial to reduce biases in ecological research, particularly in regions projected to face the most pronounced environmental changes. We integrate ecological community metadata of 7,694 sampling sites for multiple or ganism groups in a machine learning model framework to map the research probability across the Brazilian Amazonia, while identifying the region’s vulnerability to environmental change. 15%–18% of the most ne glected areas in ecological research are expected to experience severe climate or land use changes by 2050. This means that unless we take immediate action, we will not be able to establish their current status, much less monitor how it is changing and what is being lostinfo:eu-repo/semantics/publishedVersio