In Vivo Hemozoin Kinetics after Clearance of Plasmodium berghei Infection in Mice

Hemozoin (Hz) is released into the blood stream after rupture of infected red blood cells (iRBCs) at the end of each parasite replication cycle. This free Hz is ingested by circulating and resident phagocytes. The presence of Hz in tissues after clearance of infection has been previously reported. Still, little is known about the kinetics of Hz in vivo, during and after Plasmodium infection. It is particularly important to understand Hz kinetics after malaria infections as it has been reported that Hz is associated with impairment of immune functions, including possible consequences for coinfections. Indeed, if Hz remains biologically active for prolonged periods of time inside immunocompetent cells, the potential consequences of such accumulation and presence to the immune system should be clarified. Here, using several independent methods to assess the presence of Hz, we report the long-term in vivo kinetics of Hz in diverse organs in a murine model of malaria infection

Dual effect of Plasmodium-infected erythrocytes on dendritic cell maturation

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Infection with <it>Plasmodium </it>is the cause of malaria, a disease characterized by a high inflammatory response in the blood. Dendritic cells (DC) participate in both adaptive and innate immune responses, influencing the generation of inflammatory responses. DC can be activated through different receptors, which recognize specific molecules in microbes and induce the maturation of DC.</p> <p>Methods</p> <p>Using <it>Plasmodium yoelii</it>, a rodent malaria model, the effect of <it>Plasmodium</it>-infected erythrocytes on DC maturation and TLR responses have been analysed.</p> <p>Results</p> <p>It was found that intact erythrocytes infected with <it>P. yoelii </it>do not induce maturation of DC unless they are lysed, suggesting that accessibility of parasite inflammatory molecules to their receptors is a key issue in the activation of DC by <it>P. yoelii</it>. This activation is independent of MyD88. It was also observed that pre-incubation of DC with intact <it>P. yoelii</it>-infected erythrocytes inhibits the maturation response of DC to other TLR stimuli. The inhibition of maturation of DC is reversible, parasite-specific and increases with the stage of parasite development, with complete inhibition induced by schizonts (mature infected erythrocytes). <it>Plasmodium yoelii</it>-infected erythrocytes induce a broad inhibitory effect rendering DC non-responsive to ligands for TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7 and TLR9.</p> <p>Conclusions</p> <p>Despite the presence of inflammatory molecules within <it>Plasmodium</it>-infected erythrocytes, which are probably responsible for DC maturation induced by lysates, intact <it>Plasmodium</it>-infected erythrocytes induce a general inhibition of TLR responsiveness in DC. The observed effect on DC could play an important role in the pathology and suboptimal immune response observed during the disease. These results help to explain why immune functions are altered during malaria, and provide a system for the identification of a parasite-derived broad inhibitor of TLR-mediated signaling pathways.</p

VEGF Promotes Malaria-Associated Acute Lung Injury in Mice

The spectrum of the clinical presentation and severity of malaria infections is broad, ranging from uncomplicated febrile illness to severe forms of disease such as cerebral malaria (CM), acute lung injury (ALI), acute respiratory distress syndrome (ARDS), pregnancy-associated malaria (PAM) or severe anemia (SA). Rodent models that mimic human CM, PAM and SA syndromes have been established. Here, we show that DBA/2 mice infected with P. berghei ANKA constitute a new model for malaria-associated ALI. Up to 60% of the mice showed dyspnea, airway obstruction and hypoxemia and died between days 7 and 12 post-infection. The most common pathological findings were pleural effusion, pulmonary hemorrhage and edema, consistent with increased lung vessel permeability, while the blood-brain barrier was intact. Malaria-associated ALI correlated with high levels of circulating VEGF, produced de novo in the spleen, and its blockage led to protection of mice from this syndrome. In addition, either splenectomization or administration of the anti-inflammatory molecule carbon monoxide led to a significant reduction in the levels of sera VEGF and to protection from ALI. The similarities between the physiopathological lesions described here and the ones occurring in humans, as well as the demonstration that VEGF is a critical host factor in the onset of malaria-associated ALI in mice, not only offers important mechanistic insights into the processes underlying the pathology related with malaria but may also pave the way for interventional studies

Transcriptomic analysis of the dendritic cell regulation by malaria: production of fever mediators in the absence of maturation

Tese de doutoramento em Bioquímica (Genética Molecular), apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Ciências, 2007Malaria is an infectious disease responsible for ca. 1 Million deaths each year in the Developing World; nearly all victims of malaria are children and pregnant women from sub-Saharan Africa. Our current understanding of the cellular and molecular immune mechanisms of the host responses to the parasite which contribute to clear infection but also to the pathologies associated with malaria is far from being extensive, despite decades of research. Dendritic cells (DCs) are considered the most relevant class of antigen-presenting cells (APC) given their capacity to activate naïve T cells and also modulate CD4+ T cell polarization in response to each pathogen. In these studies we describe various molecular responses of DCs to Plasmodium parasites, using a mouse model of malaria infection, P. yoelii. We found that malaria infection in mice regulates the expression of a high number of genes in DCs at the mRNA level (ca.700) using a whole-genome transcriptomic analysis. We identify specific gene families, metabolic pathways, cell functions and signaling pathways whose genes have their expression regulated in spleen DCs during P. yoelii infection. Furthermore, we describe a new Plasmodium-induced signaling pathway in DCs which requires cyclooxygenase activity (responsible for PGE2 production), triggers production of cyclic adenosyl-monophosphate (cAMP) and leads to expression of interleukin-6, a mediator of inflammation and lymphocyte stimulation. Given the relevance of Toll-like receptors (TLRs) in recognizing pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) and triggering innate immunity, and also their recent association with malaria-induced inflammation, we describe how TLR-dependentPlasmodium Regulation of Dendritic Cells PhD Thesis: Daniel Carapau - 12 - signaling for gene expression leading to DC maturation is impaired in the context of malaria. Finally, we use a fluorescence labeling method for Plasmodium blood-stage parasites to visualize their interactions with DCs. We demonstrate that phagocytosis of infected or non-infected erythrocytes can induce a blockage of DC maturation, what might contribute to the induction of tolerance to Plasmodium.A malária é responsável actualmente por 1 milhão de mortes por ano nos países em vias de desenvolvimento, sendo a maioria das vítimas mortais crianças e mulheres grávidas da África sub-Sariana. O nosso conhecimento actual dos mecanismos moleculares e celulares que compõem a resposta imunitária do hospedeiro contra os parasitas do género Plasmodium, os quais são também responsáveis pela patologia associada à infecção, está longe de ser extensivo, apesar das várias décadas de pesquisa nesta área.Neste estudo abordámos os papéis das células dendríticas ( dendritic cells , DCs) do sistema imunitário no contexto da fase sanguínea da infecção por Plasmodium. As DCs são uma das várias classes de células apresentadoras de antigénio ( antigen presenting cells , APC), tal como os macrófagos e as células B, com a particularidade de serem as únicas capazes de promover a activação primária de células T. Por outro lado, exibem uma grande flexibilidade no modo como reagem a diferentes agentes infecciosos, o que se traduz na produção variada de citoquinas e também em diferentes interacções com os receptores das células T; as DCs podem assim polarizar as células T CD4+ em diferentes fenótipos ( T helper 1 , T helper 2 , células T reguladoras), além de modular a activação das células T CD8+. Até há pouco, o conhecimento sobre as respostas das DCs ao parasita da malária era muito reduzido e limitava-se ao estudo dos marcadores de maturação. Com vista a um conhecimento mais vasto sobre os processos moleculares envolvidos na interacção entre as DCs e a fase sanguínea da malária aquela em que os processos imunitários são acelerados, tal como os patológicos propusemo-nos fazer as seguintes caracterizações: 1) Qual a extensão da regulação da expressão génica das DCs em resposta à infecção por Plasmodium? Para tal procedemos a uma análise global da regulação transcriptómica por Genechip® das DCs do baço em ratinhos infectados com P. yoelii (modelo de malária de roedores) em duas fases da infecção;2) Dado a relevância da febre e dos processos inflamatórios nesta doença, qual o papel das DCs na produção de moléculas pirogéneas, tais como prostanóides e citoquinas, no contexto da malária? São estas moléculas induzidas a nível da expressão génica? Para responder a estas perguntas procedemos a uma análise mais detalhada dos dados obtidos pela análise de Genechip® com vista à identificação de genes relevantes, e também de vias de sinalização e regulação da transcrição, assim como os segundos mensageiros envolvidos. 3) Dada a relevância dos receptores Toll-like (TLRs) no reconhecimento de micróbios e na indução da maturação das DCs, será que esta família de receptores participa na indução da maturação das DCs em resposta aoPlasmodium? São as vias de expressão génica dependentes dos TLRs activadas pelo Plasmodium? Para este objectivo procedemos a uma análise dos critérios associados à maturação das DCs na presença do parasita P. yoelii, além da utilização de células transfectadas com TLRs individuais e de células que não transmitem determinados sinais dependentes de TLRs (MyD88-/-). 4) Dada a capacidade das DCs de fagocitarem e eliminarem micróbios, estará a fagocitose pelas DCs de eritrócitos infectados (EIs) com Plasmodium relacionada com o facto de desencadearem ou não a sua maturação? Para responder a esta pergunta desenvolvemos um processo de marcação por fluorescência dos EIs e estudámos a sua fagocitose in vitro por DCs, assim como o estado de maturação das DCs nesse sistema. Neste trabalho descrevemos os resultados obtidos para cada uma das diferentes abordagens às interacções moleculares entre as DCs (ora do baço no caso in vivo, ora derivadas de progenitores hematopoiéticos nos sistemas in vitro) e a fase eritrocítica da malária. Através da análise por microarray de oligonucleótidos, conhecidos como Genechip®, pudémos caracterizar a resposta transcriptómica das DCs à infecção por P. yoelii à escala do genoma. Perto de 700 genes foram identificados cuja expressão pelas DCs sofre uma alteração significativa durante a infecção por P. yoelii, seja ao dia 5 pósinfecção (pi), ao dia 10 pi ou em ambos. A análise dos processos moleculares e vias metabólicas associadas aos genes regulados pelo P. yoelii permitiu concluir que as principais funções celulares reguladas nas DCs do baço são: ciclo celular, imunidade, vias de sinalização e regulação da transcrição, metabolismo de purinas e pirimidinas e glicólise. Uma análise comparativa com estudos anteriores sobre a regulação da expressão génica em DCs por outros patogéneos permitiu concluir que as semelhanças entre o parasita da malária e outros agentes infecciosos são inferiores a 50%, o que indica que o Plasmodium exerce uma regulação em larga medida única e que carece de caracterização mais detalhada. Os dados obtidos por análise de Genechip® de vários genes foram confirmados por PCR quantitativo, garantindo assim a qualidade dos resultados obtidos. Também os resultados para os marcadores de maturação das DCs (CD40, CD80, CD83, CD86) foram confirmados por citometria, observando-se a ausência de maturação in vivo. Os dados de análise transcriptómica sugerem uma regulação de um elevado número de genes implicados em vias de sinalização molecular. Visto que a Prostaglandina E2 (PGE2) é um dos metabolitos produzidos pelas DCs em resposta ao P. yoelii, investigámos a sinalização dependente de PGE2 e a sua influência na expressão da interleuquina 6 (IL-6), uma das citoquinas cuja produção pelas DCs é estimulada nesta infecção. Determinámos que a actividade da cicloxigenase (COX), responsável pela produção de prostanóides, entre os quais a PGE2, é responsável por: acumulação intracelular de adenosil-monofosfato cíclico (AMPc), activação das cinases de proteína PKA e p38-MAPK, e ainda a secreção de IL-6 pelas DCs em resposta a eritrócitos infectados (EIs) com P. yoelii. Caracterizámos ainda a activação dos receptores toll-like (TLRs) no contexto da infecção por P. yoelii. Não foi detectada qualquer activação de expressão génica em resposta ao parasita em linhas celulares transfectadas com TLRs. Pudemos também observar uma inibição generalizada das respostas mediadas por TLRs em DCs na presença de EIs, sugerindo uma supressão dos mecanismos de sinalização partilhados entre as vias dependentes de TLRs. Investigámos ainda as interacções in vitro entre DCs e EIs marcados com moléculas fluorescentes; conclui-se que à fagocitose de EIS está associada uma forte inibição da maturação das DCs, para além de uma inibição das respostas a estimulação secundária via TLRs. As principais conclusões desta Tese são:i) A infecção por P. yoelii induz uma vasta regulação transcriptómica das DCs do baço, sendo que uma larga parte desta regulação é distinta daquela exercida por outros agentes patogénicos;ii) Os eritrócitos infectados com P. yoelii induzem a expressão de dois importantes agentes pró-inflamatórios e pirógeneos pelas DCs PGE2, IL-6 sendo que a produção de IL-6 depende de uma via que envolve actividade de cicloxigenase (responsável pela produção de PGE2), produção de AMP cíclico, e activação das cinases PKA e p38-MAPK;iii) Apesar da produção de agentes pró-inflamatórios, as DCs não apresentam marcadores de maturação, tanto in vitro como in vivo, e sofrem uma inibição generalizada das vias dependentes de TLRs; a fagocitose de EIs é um dos factores que leva à inibição da maturação das DCs. Estes estudos pretendem esclarecer algumas das incongruências existentes na literatura acerca das respostas das DCs à fase sanguínea da malária.Apresentamos dados que revelam a extensão da regulação da expressão génica dasDCs num modelo de malária de roedores, o que possibilitará estudos mais detalhadosno futuro sobre os vários processos em que as DCs participam no contexto da malária.Apontamos novos papéis para a produção de agentes potenciadores da febre pelasDCs e quais os agentes moleculares envolvidos; ao mesmo tempo, as DCs vêem a sua maturação impedida, o que parece estar relacionado com um contacto directo com osEIs através de fagocitose. A inibição da maturação, mas também a produção de mediadores solúveis como a PGE2 ou a IL-6, são factores que condicionam seriamentea capacidade das DCs activarem células T, o que sugere um papel para as DCs como indutoras de tolerância ao Plasmodium, como é discutido no final deste trabalho.Esperamos com estes estudos contribuir para esclarecer em mais detalhe os papéis das DCs nos processos inflamatórios, febris e de imunidade adaptativa em resposta aoPlasmodium e assim apontar novos caminhos para intervenções terapêuticas que controlem as patologias associadas à malária.FCT (bolsa SFRH/BD/8851/2002 - Programa POCTI

Infection of C57BL/6, BALB/c and DBA/2 mice with <i>P. berghei</i> ANKA.

<p>(<b>A</b>) Survival and (<b>B</b>) parasitemia curves are shown for C57BL/6 (B6) (n = 7), BALB/c (n = 9) and DBA mice (n = 9) and mice. Parasitemias are shown as mean ± standard deviation. (<b>C, D</b>) Penh (enhanced pause) values for non-infected (NI) <i>versus P. berghei</i> ANKA infected DBA mice (n = 21). (<b>E</b>) Respiratory frequency values for non-infected (NI) <i>versus P. berghei</i> ANKA-infected DBA mice (n = 21). ALI and HP groups were defined at the end of each experiment according to cause of death. (<b>F</b>) PaO2/FI(O2) values for non-infected (NI) <i>versus P. berghei</i> ANKA infected DBA mice (n = 6). Values for ALI mice were obtained after the onset of ALI symptoms. Values for HP mice were obtained after day 12 of infection and on mice not displaying ALI symptoms. Results are shown as mean concentration ± standard deviation. (*<i>P</i><0.05).</p

Infection of DBA/2 with <i>P. berghei</i> ANKA does not cause brain damage.

<p>(<b>A</b>) Cranium and Hematoxylin-Eosin staining of brain sections of <i>P. berghei</i> ANKA-infected C57BL/6, B6 (CM), BALB/c, BALB (HP), and DBA mice, DBA (ALI) or DBA (HP) (5 µm). Images are representative of 9 mice in 3 independent experiments. (<b>B</b>) Quantification of cerebral hemorrhagic foci area in brain-sections of the same group of mice. Results are shown as mean concentration ± standard deviation (n = 9 animals per group).</p

VEGF correlates with ALI onset during malaria infection.

<p>(<b>A</b>) Levels of VEGF protein in the sera of <i>P. berghei</i> ANKA-infected DBA mice with ALI and hyperparasitemia (HP), compared to non-infected mice (NI). Results are shown as mean concentration ± standard deviation (n = 6, 23 and 46 mouse sera per group, for NI, ALI and HP, respectively). (<b>B</b>) Expression of VEGF mRNA levels in the lung, spleen, liver and kidney of <i>P. berghei</i> ANKA-infected DBA mice with ALI and HP (n = 15 animals per group), when compared to non-infected mice. (<b>C</b>) Correlation between VEGF protein levels in the serum and mRNA expression of VEGF in the spleen of <i>P. berghei</i> ANKA-infected DBA mice with ALI. (<b>D</b>) Levels of VEGF protein in the sera of different strains of mice (C57BL/6, BALB/c and DBA) infected with different <i>Plasmodia</i> (<i>P. berghei</i> ANKA, <i>P. berghei</i> NK65 - PbNK, <i>P. yoelii yoelii</i> 17X – Py, and <i>P. chabaudi chabaudi</i> AS - Pc) (n = 10 animals per group). Results are shown as mean concentration ± standard deviation. (*<i>P</i><0.001).</p

Exposure to CO suppresses onset of malaria-associated ALI.

<p>(<b>A–B</b>) Effect of CO inhalation on <i>P. berghei</i> ANKA-infected DBA mice survival (<b>A</b>) and parasitemia (<b>B</b>). CO inhalation (starting at day 2 after infection and during 72 h) was compared to normal atmosphere. Parasitemias are shown as mean ± standard deviation (<i>n = </i>10 animals per group). (<b>C</b>) Levels of VEGF in the sera of <i>P. berghei</i> ANKA-infected DBA mice exposed to air or CO. Results are shown as mean concentration ± standard deviation (n = 3 mice per group). (*<i>P</i><0.01) (<b>D–F</b>) Quantification of edema and haemorrhages of hematoxylin-eosin-stained lung sections of non-infected DBA mice (NI DBA) <i>versus P. berghei</i> ANKA-infected DBA mice exposed to air, I DBA (ALI), or CO, I DBA+CO, using a blinded score system (1-mild, 4-severe). Images are representative of 6 mice in 2 independent experiments.</p

Spleen is required for the onset of malaria-associated ALI.

<p>(<b>A</b>) Survival and (<b>B</b>) parasitemia of splenectomised and control <i>P. berghei</i> ANKA-infected DBA mice. (<b>C</b>) Levels of VEGF in the serum of non-infected (NI) DBA mice, <i>P. berghei</i> ANKA-infected DBA mice with ALI and splenectomised <i>P. berghei</i> ANKA-infected DBA mice were taken on the same day as control DBA infected mice developed ALI. Results are shown as mean concentration ± standard deviation. (*<i>P</i><0.01).</p

Infection of DBA/2 with <i>P. berghei</i> ANKA constitutes a rodent model for malaria-associated acute lung injury (ALI).

<p>(<b>A–C</b>) Hematoxylin-Eosin staining of lung sections (5 µm) and quantification of edema and haemorrhages, using a blinded scoring system (1-mild, 4-severe), during the onset of ECM, i.e. C57BL/6 mice, B6 (CM), hyperparasitemia, i.e. BALB/c mice, BALB (HP), and ALI, i.e. DBA mice, DBA (ALI). Images are representative of 9 mice in 3 independent experiments. The bar corresponds to 100 µm.</p