DNase SISPA-next generation sequencing confirms Schmallenberg virus in Belgian field samples and identifies genetic variation in Europe

In 2011, a novel Orthobunyavirus was identified in cattle and sheep in Germany and the Netherlands. This virus was named Schmallenberg virus (SBV). Later, presence of the virus was confirmed using real time RT-PCR in cases of congenital malformations of bovines and ovines in several European countries, including Belgium. In the absence of specific sequencing protocols for this novel virus we confirmed its presence in RT-qPCR positive field samples using DNase SISPA-next generation sequencing (NGS), a virus discovery method based on random amplification and next generation sequencing. An in vitro transcribed RNA was used to construct a standard curve allowing the quantification of viral RNA in the field samples. Two field samples of aborted lambs containing 7.66 and 7.64 log(10) RNA copies per mu L total RNA allowed unambiguous identification of SBV. One sample yielded 192 SBV reads covering about 81% of the L segment, 56% of the M segment and 13% of the S segment. The other sample resulted in 8 reads distributed over the L and M segments. Three weak positive field samples (one from an aborted calf, two from aborted lambs) containing virus quantities equivalent to 4.27-4.89 log(10) RNA copies per mu L did not allow identification using DNase SISPA-NGS. This partial sequence information was compared to the whole genome sequence of SBV isolated from bovines in Germany, identifying several sequence differences. The applied viral discovery method allowed the confirmation of SBV in RT-qPCR positive brain samples. However, the failure to confirm SBV in weak PCR-positive samples illustrates the importance of the selection of properly targeted and fresh field samples in any virus discovery method. The partial sequences derived from the field samples showed several differences compared to the sequences from bovines in Germany, indicating sequence divergence within the epidemic

Study of the virulence of african horse sickness virus serotypeS 4 and 9 in two mouse models

Objectives African horse sickness is an infectious disease caused by a double stranded positive RNA virus which belongs to the family Reoviridae, genus Orbivirus. The virus has nine known antigenically distinct serotypes and is transmitted by a culicoides biting midge, principally Culicoides imicola. African horse sickness causes severe morbidity and mortality up to 95 % in horses with severe economic losses. The establishment of an experimental mouse model is needed for the investigation of the pathogenesis of this infection. Methods Two mouse models, interferon-α receptor knock-out mice and immunocompetent mice, were tested. The used virus for mice inoculations belonged to the two serotypes which caused epidemics in Europe, serotypes 4 and 9. The virus was inoculated by subcutaneous route and/or by intra-nasal route. Samples of whole blood were taken for each infected and knock-out mice at regular intervals. The organs (liver, spleen, kidney, lung and brain) were taken at the end of experience of when the most affected mices were euthanasied. All these samples were tested by a qRT-PCR targeting African horse sickness genome segment 7. Results The results demonstrate the potential of the immunodeficient mouse model for both clinical and biological features. Both serotypes of African horse sickness were detected by qRT-PCR until three weeks post-infection (corresponding with the end of the experience) in blood. Conclusions The setting up of this mouse model has developed a tool for efficient in vivo study to characterize the in vivo virulence of this virus, to monitor the evolution of viral populations during in vivo replication cycles and to test the competence or vectorial capacity of indigenous Culicoides. Acknowledgement Research supported by the Belgium Federal Public Service, Health, Food Chain Safety and Environment.INDEVIREQ 1.

Risques d'introduction des alphavirus responsables des encéphalites virales équines américaines en Belgique

Les virus transmis par des arthropodes hématophages (arbovirus) représentent une menace pour la santé animale et humaine en fonction de l’augmentation de l’émergence des arboviroses en dehors des territoires endémiques. Les arbovirus étudiés ici appartiennent au genre Alphavirus et à la famille des Togaviridae, et sont composés d’un génome à ARN simple brin de polarité positive et enveloppés. Ces virus sont des pathogènes exotiques des équidés et causent des maladies graves chez l’homme lors d’épidémies. Les arbovirus présentent une épidémiologie complexe car ils se retrouvent au centre de l’interaction avec 5 composants : le virus, le vecteur, le réservoir, les espèces animales sensibles et l’environnement. Les voies d’introduction possible en Belgique de ces virus ont été investiguées ici en fonction des caractéristiques étiologiques et épidémiologiques de chaque virus. L’encéphalite équine de l’Est (EEEV) a un cycle complexe principal incluant les oiseaux et des moustiques comme Culiseta melanura. Les souches nord-américaines et sud-américaines peuvent être différenciées antigéniquement et génétiquement et ont des différences importantes dans leur cycle de transmission et au niveau de leur virulence. Le cycle naturel de l’EEEV se réalise chaque année dans des zones marécageuses et la migration d’oiseaux virémiques serait une hypothèse à sa réintroduction printanière annuelle. Certaines années, le virus peut être amplifié pendant ce cycle oiseaux-moustiques et le virus devient disponible à d’autres espèces de vecteurs qui font le pont entre les oiseaux et les humains ou d’autres mammifères comme les chevaux. Grâce à cette observation, l’EEEV a pu être isolé de vecteur comme Ochlerotatus sollicitans, Coquillettidia perturbans ou encore Culex pipiens et Aedes vexans qui sont deux espèces bien présentes en Europe. Le risque d’importation de l’EEEV semble peu élevé, elle pourrait se faire par l’intermédiaire du transport volontaire ou involontaire, légal ou illégal d’espèces réservoirs d’oiseaux comme des passériformes (ex : moineau domestique ou des oiseaux d’eau (ex : Egretta thula), des rongeurs comme le rat des cotonniers, des vertébrés ectothermiques comme les amphibiens (ex : Rana catesbeiana) ou des reptiles (ex : Agkistrodon piscivorus), ou encore par le transport accidentel de vecteurs compétents. L’encéphalite équine de l’Ouest (WEEV) est retrouvée dans l’Ouest de l’Amérique du Nord et en Amérique du Sud. Ce virus est un virus recombinant entre le Sindbis virus et l’EEEV. Le virus est inclus dans un cycle qui implique des passereaux et Culex tarsalis. Un deuxième cycle moins connu est rapporté et implique un lapin ou lièvre sauvage (Lepus europaeus) avec un moustique du genre Aedes. Comme pour l’EEEV, les humains et les chevaux ne développent pas une virémie suffisante pour infecter les moustiques et continuer le cycle. Le WEEV pourrait être introduit en Europe par différentes voies : les vecteurs arthropodes adultes infectés ou leurs œufs pour Aedes dorsalis, l’introduction d’oiseaux comme des passériformes ou des mammifères comme le lièvre sauvage virémiques. L’acquisition de la compétence d’un vecteur indigène local comme Culex pipiens ou Aedes dorsalis doit aussi être envisagée. Le groupe des virus de l’encéphalite équine vénézuélienne (VEEV) est sous-divisé en souches enzootiques et souches épizootiques qui utilisent le cheval comme hôte amplificateur. Les souches épizootiques sont opportunistes pour leur choix de vecteurs avec comme conséquence un large panel de vecteurs potentiels. L’introduction et l’établissement de ce virus en Belgique est possible via des moustiques infectés, des rongeurs comme le rat des cotonniers ou des oiseaux d’eau infectés, des chevaux et des hommes infectés qui sont des hôtes amplificateurs pour les souches épizootiques. En conclusion, il convient de faire la distinction entre l’introduction et l’établissement d’une infection de ces virus en Belgique. L’introduction peut se faire par l’intermédiaire de vecteurs insectes ou d’hôtes oiseaux ou mammifères comme les rongeurs ou encore le cheval et l’homme dans le cas du VEEV épizootique. Le maintien de l’infection nécessite la présence de vecteurs indigènes avec une compétence vectorielle ou de vecteurs compétents invasifs pour ces virus ainsi que la présence d’hôtes mammifères ou oiseaux phylogénétiquement apparentés à des espèces réservoirs dans les régions américaines où ces virus sont endémiques.INDEVIREQ 1.

Risk of introduction of alphaviruses responsible for American equine encephalitides in Belgium

Arthropod-borne viruses are a threat for human and animal healths in regards with their dissemination out of their endemic area. The arboviruses reviewed here belong to the family Togaviridae genus Alphavirus and are small enveloped positive sense RNA viruses. They are considered as exotic equid pathogens in Europe and can cause severe diseases in humans in the context of an epidemic. Arboviruses have complex epidemiologic features characterised by interactions between viruses, vectors, reservoir or susceptible host species, and environment. A bibliographic search was performed to identify the mean factors that influenced past outbreaks in America and the presence of potential vectors/vertebrate hosts that could play a role in the transmission cycle in Belgium. Three equine arboviruses, currently considered as the main current threats of emergence/introduction in Western Europe, were chosen as model for this study: Eastern equine encephalitis virus (EEEV), Western equine encephalitis virus (WEEV) and Venezuelan equine encephalitis virus (VEEV). In conclusion, taking into consideration the globalisation (increase of international exchanges) and climate warming, the analysis of the different features of the arbovirus cycles are essential to a balanced risk expertise in the Belgian context. Research supported by the Belgium Federal Public Service, Health, Food Chain Safety and Environment.INDEVIREQ 1.

Study of the virulence of serotypes 4 and 9 of African horse sickness virus in two mouse models

African horse sickness (AHSV) is an infectious disease caused by a double stranded positive RNA virus which belongs to the family Reoviridae, genus Orbivirus. The virus has nine serotypes and is transmitted by a culicoides biting midge, principally Culicoides imicola. African horse sickness causes severe morbidity and mortality up to 95 % in horses with severe economic losses. The establishment of an experimental model is needed for the investigation of the pathogenesis of this infection. Two mouse models, interferon-α receptor knock-out mice (A129 KO or IFNAR -/-) and immunocompetent mice (A129 WT), were tested. The viruses used for mice inoculations belonged to the two serotypes which caused epidemics in Europe, serotypes 4 and 9. The virus was inoculated by subcutaneous (SC) route and/or by intra-nasal (IN) route. Whole blood samples were taken from each mouse at regular intervals. The organs (liver, spleen, kidney, lung and brain) were taken at the end of the experiment or when the most affected mice were euthanized. All these samples were tested by a qRT-PCR targeting AHSV genome segment 7. Both serotypes of AHSV were detected by qRT-PCR until three weeks post-infection in blood of IFNAR -/- mice and A129 WT mice infected by SC route. Serotype 4 shows a higher peak of viremia than serotype 9. The peak of viremia was measured between day 2 and day 4 post-infection. These results demonstrate the potential of the immunodeficient mouse model for both clinical and biological features. The setting up of this mouse model has developed a tool for efficient in vivo study to characterize the in vivo virulence of this virus, to monitor the evolution of viral populations during in vivo replication cycles and to test the competence or vectorial capacity of indigenous Culicoides. Research supported by the Belgium Federal Public Service, Health, Food Chain Safety and Environment.INDEVIREQ 2.

Study of the virulence of serotype 4 and 9 of African horse sickness virus in two mouse models

Objectifs Le virus de la peste équine (African horse sickness virus ; AHSV) est un virus segmenté à ARN double brin, appartenant à la famille des Reoviridae et au genre Orbivirus. L’AHSV se différencie en 9 sérotypes distincts et est transmis par la piqûre d’un vecteur, principalement Culicoides imicola. L’AHSV cause une sévère morbidité et un taux de mortalité qui peut atteindre 95 % chez les chevaux avec de lourdes conséquences économiques. L’établissement d’un modèle d’étude en souris est nécessaire pour plusieurs applications, comme l’investigation de la pathogénie de ce virus, l’étude de la virulence, l’étude d’efficacité de nouveaux vaccins. Méthodes Deux modèles murins, soit une lignée de souris déficientes en récepteur à l’interféron α (A129 KO ou IFNAR -/-), et une lignée immunocompétente (A 129 WT) ont été testées. Les virus de sérotypes 4 et 9 de l’AHSV ont été utilisés pour les inoculations des souris ; ces deux sérotypes ont été à l’origine des épidémies observées en Espagne en 1969 et à la fin des années 80 en Espagne et au Portugal. Le virus a été inoculé par voie sous-cutanée (SC) et/ou par voie intra-nasale (IN) et un groupe de souris témoin (mock-infected) a été utilisé pour les deux modèles testés. Des échantillons de sang ont été prélevés de chaque souris infectée et témoin à intervalles réguliers. Les organes (foie, rate, reins, poumon et cerveau) ont été prélevés à la fin de l’expérience pour la plupart des souris ou lors de l’euthanasie des souris qui présentaient des signes cliniques très prononcés. Tous les échantillons, sang et organes, ont été analysés par qRT-PCR avec comme cible le segment 7 codant la protéine VP7 de l’AHSV qui est la protéine de structure la plus conservée entre les différents sérotypes. Résultats Les deux sérotypes de l’AHSV ont été détectés par qRT-PCR jusqu’à 3 semaines post-infection (ce qui correspond à la fin de l’expérience) dans le sang des souris IFNAR -/- et A129 WT infectées par la voie SC. Le virus de sérotype 4 atteint des niveaux de virémie légèrement plus élevés par rapport au virus de sérotype 9. Les souris A129 WT infectées par la voie intra-nasale ne montrent à aucun moment de l’expérience de virémie détectable par la qRT-PCR. Le pic de virémie a été mesuré entre le jour 2 et le jour 4 post-infection pour les deux lignées de souris. Au pic de virémie, la quantité de ADNc correspondant au segment-7 viral, après quantification par qRT-PCR, était plus élevée chez les souris IFNAR -/-. Conclusions Les souris immunodéficientes (IFNAR -/-) présentent des caractéristiques cliniques et biologiques permettant l’établissement d’un modèle in vivo pertinent. Selon les premiers résultats obtenus, il semble que la voie sous-cutanée soit la voie à privilégier pour les expériences in vivo futures. La mise au point de ce modèle sur souris permet de disposer d’un outil efficace et nécessaire pour l’étude in vivo de l’AHSV, afin de caractériser in vivo la virulence de ce virus et de suivre l’évolution des populations virales pendant la multiplication virale in vivo. Remerciements Recherche financée par le service Recherche Contractuelle, Service Public Fédérale, Santé Publique, Sécurité de la Chaîne alimentaire et Environnement (RT 12/6262 INDEVIREQ 2.0)INDEVIREQ 2.

Quantification of Schmallenberg virus L segment RNA using quantitative real time RT-PCR.

<p>The viral RNA load in field samples was quantified with real time RT-PCR using a standard curve consisting of in vitro transcribed L segment RNA spanning the diagnostic RT-qPCR, which was run in five replicates (blue crosses). The linear trendline and the associated standard curve equation are displayed. The samples are indicated by red squares.</p