Comparative proteomics of wild-type and nef-deleted HIV-1 particles

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Premature Activation of the SLX4 Complex by Vpr Promotes G2/M Arrest and Escape from Innate Immune Sensing

SummaryThe HIV auxiliary protein Vpr potently blocks the cell cycle at the G2/M transition. Here, we show that G2/M arrest results from untimely activation of the structure-specific endonuclease (SSE) regulator SLX4 complex (SLX4com) by Vpr, a process that requires VPRBP-DDB1-CUL4 E3-ligase complex. Direct interaction of Vpr with SLX4 induced the recruitment of VPRBP and kinase-active PLK1, enhancing the cleavage of DNA by SLX4-associated MUS81-EME1 endonucleases. G2/M arrest-deficient Vpr alleles failed to interact with SLX4 or to induce recruitment of MUS81 and PLK1. Furthermore, knockdown of SLX4, MUS81, or EME1 inhibited Vpr-induced G2/M arrest. In addition, we show that the SLX4com is involved in suppressing spontaneous and HIV-1-mediated induction of type 1 interferon and establishment of antiviral responses. Thus, our work not only reveals the identity of the cellular factors required for Vpr-mediated G2/M arrest but also identifies the SLX4com as a regulator of innate immunity

Viral and cellular mechanisms study that regulate VIH-1 infection

L’infection des cellules cibles par le Virus de l’Immunodéficience Humaine de type 1(VIH-1) suit une succession d’étapes finement régulées par de nombreux facteurs cellulaires et viraux. Mon travail de thèse a consisté à étudier certains aspects de cette régulation, en particulier la protéine virale Nef et son impact sur l’infectivité des virus, mais aussi la susceptibilité des cellules cibles à l’infection. Tout d’abord, nous nous sommes intéressés aux mécanismes selon lesquels Nef augmente l’infectivité virale. Pour cela, nous avons identifié les différences entre le protéome des virus sauvages et des virus dépourvus du gène nef (Δnef) grâce à deux méthodes protéomiques, laDIGE et l’iTRAQ. Nous avons pu mettre en évidence que les protéines Ezrine et EHD4 sont impliquées dans des processus qui rendent les virus sauvages plus infectieux que les virusΔnef. L’augmentation de l’infectivité virale par Nef dépend des glycoprotéines d’enveloppes avec lesquelles les particules virales sont pseudotypées. Dans le but d’identifier les bases moléculaires de ce mécanisme, nous avons généré des constructions chimériques entre des glycoprotéines d’enveloppes qui permettent (enveloppes permissives) ou ne permettent pas(enveloppes non permissives) au phénotype Nef de se manifester. Cette approche a permis démontrer que le domaine cytoplasmique de la protéine d’enveloppe est un des déterminants qui dictent l’acquisition du phénotype Nef. Mon travail s’est aussi axé sur le mécanisme de co-infection cellulaire par le VIH-1.Après co-incubation des cellules avec des virus VIH rapporteur GFP et DsRed, nos résultats ont montré que les événements de co-infection sont plus fréquents qu’attendus dans le cas d’une infection stochastique. Nous montrons que ce biais qui semble favoriser la co-infection et qui suggère l’hétérogénéité de la population cible en terme de susceptibilité à l’infection par le VIH-1 provient en fait d’une sous-estimation des fréquences de cellules infectées en raison d’un phénomène de latence post-intégrative. Ainsi, mes études ont permis de mieux comprendre les mécanismes permettant à Nef d’augmenter l’infectivité des particules virales ouvrant de nouvelles perspectives à ce sujet, de même qu’elles ont permis de mettre en évidence que la co-infection était bien un processus aléatoire mais qui permettait de révéler des cellules arborant un provirus silencieux.Pas de résumé en anglai

Upregulated LINE-1 Activity in the Fanconi Anemia Cancer Susceptibility Syndrome Leads to Spontaneous Pro-inflammatory Cytokine Production

Fanconi Anemia (FA) is a genetic disorder characterized by elevated cancer susceptibility and pro-inflammatory cytokine production. Using SLX4FANCP deficiency as a working model, we questioned the trigger for chronic inflammation in FA. We found that absence of SLX4 caused cytoplasmic DNA accumulation, including sequences deriving from active Long INterspersed Element-1 (LINE-1), triggering the cGAS-STING pathway to elicit interferon (IFN) expression. In agreement, absence of SLX4 leads to upregulated LINE-1 retrotransposition. Importantly, similar results were obtained with the FANCD2 upstream activator of SLX4. Furthermore, treatment of FA cells with the Tenofovir reverse transcriptase inhibitor (RTi), that prevents endogenous retrotransposition, decreased both accumulation of cytoplasmic DNA and pro-inflammatory signaling. Collectively, our data suggest a contribution of endogenous RT activities to the generation of immunogenic cytoplasmic nucleic acids responsible for inflammation in FA. The additional observation that RTi decreased pro-inflammatory cytokine production induced by DNA replication stress-inducing drugs further demonstrates the contribution of endogenous RTs to sustaining chronic inflammation. Altogether, our data open perspectives in the prevention of adverse effects of chronic inflammation in tumorigenesis

Nef-Induced CD4 Endocytosis in Human Immunodeficiency Virus Type 1 Host Cells: Role of p56lck Kinase▿ §

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Nef interferes with the endocytic machinery to modulate the cell surface expression of CD4. However, the basal trafficking of CD4 is governed by different rules in the target cells of HIV-1: whereas CD4 is rapidly internalized from the cell surface in myeloid cells, CD4 is stabilized at the plasma membrane through its interaction with the p56lck kinase in lymphoid cells. In this study, we showed that Nef was able to downregulate CD4 in both lymphoid and myeloid cell lines but that an increase in the internalization rate of CD4 could be observed only in lymphoid cells. Expression of p56lck in nonlymphoid CD4-expressing cells restores the ability of Nef in order to increase the internalization rate of CD4. Concurrent with this observation, the expression of a p56lck-binding-deficient mutant of CD4 in lymphoid cells abrogates the Nef-induced acceleration of CD4 internalization. We also show that the expression of Nef causes a decrease in the association of p56lck with cell surface-expressed CD4. Regardless of the presence of p56lck, the downregulation of CD4 by Nef was followed by CD4 degradation. Our results imply that Nef uses distinct mechanisms to downregulate the cell surface expression levels of CD4 in either lymphoid or myeloid target cells of HIV-1