Recurrence of Stachybotrys chartarum during mycological and toxicological study of bioaerosols collected in a dairy cattle shed

International audienceAgricultural occupations associated with animal breeding and the processing of animal materials in confinement systems could potentially lead to bioaerosol exposures. Moulds and mycotoxins could be constituents of bioaerosols and should be studied because of their possible involvement in respiratory diseases and cancers. In order to characterize the fungal contamination of the indoor air in a dairy barn, bioaerosols were collected during 20 days in a cattle farm located in Normandy (France). Mycobiota, mycotoxins and the mutagenicity of bioaerosols were studied. The toxigenic ability of Aspergillus flavus group and Aspergillus fumigatus isolates was also evaluated in vitro. The prevalent airborne moulds were from the following potentially toxigenic species: Aspergillus flavus group, Aspergillus fumigatus, Penicillium chrysogenum, Stachybotrys chartarum, and the allergenic species Ulocladium chartarum, Cladosporium cladosporioides. In comparison with harvesting, grain handling or broiler breeding, the concentrations of viable moulds were lower in the cattle shed. Seasonal variations in levels of several species were also observed. This study revealed that aflatoxins were detected in bioaerosols and, for the first time, showed that farmers are possibly exposed to Stachybotrys chartarum during routine barn work. Moreover, the finding of mutagenicity from bioaerosols needs further investigations on bioaerosol composition

Evaluation of fungal contamination and mycotoxin production in maize silage

Agricultural activities involve daily use Of maize silage as feed for livestock, which can be contaminated by mycotoxigenic molds. To evaluate fungal contamination. and the production of mycotoxins in maize silage we propose a multi-disciplinary approach utilizing PCR methods with genes of the aflatoxin (ver-1, omt-1 and apa-2), fumonisin (FUMI) and trichothecene (TR16) biosynthesis pathways. To detect Aspergillus fumigatus, it 26S/intergenic spacer region of the rDNA complex was amplified. These specific PCR assays allowed. three major groups of toxigenic fungi-like aflatoxin-producing Aspergilli, fumonisin and trichothecene-producing Fusaria, and the ubiquitous mold A. fumigatus, to be targeted. A multimycotoxin method is also proposed to simultaneously quantify seven mycotoxins (i.e., aflatoxin B-1, citrinin, deoxynivalenol, fumonisin B-1, gliotoxin, ochratoxin A, zearalenone) in maize silage by high-perforrnance liquid chromatography coupled to mass spectrometry (HPLC-MS). These microbiological and analytical tools revealed three potentially toxigenic groups of fungi and A. fumigatus grown from mature maize silage (I I month old) that was collected in Normandy (France) and the, mycotoxins aflatoxin 13, (7.0-51.3 mu g/kg), citrinin (10.1-14.2 mu g/kg), deoxynivalenol (128.0-181.0 mu g/kg) and gliotoxin (6.6-11.9 mu g/kg). Results indicate that the combination of PCR and HPLC-MS can be used to assess fungal quality of maize silages. (C) 2008 Elsevier B.V. All rights reserved

How to scale up a method from low throughput to high throughput for the quantification of 16 nucleosides? Lesson from experience.

International audienceBiological plausibility of the increase of cancer incidence related to agricultural occupational exposures need to be more documented. Pesticides are suspected to belong to the causes of this increase of cancer incidence in farmers. Oxidative stress and epigenetic alterations are possible mechanism suspected for pesticides cancerogenicity. Aldehydes are produced during lipid peroxidation associated with oxidative stress. These highly hydrophilic compounds can react with DNA to form DNA adducts. These biomarkers have been identified as crucial in the exposome study. Quantified in a specific population, these biomarkers could be linked with professional exposure effects. This imply the analysis of several hundred to several thousand of samples from cohort.Starting from an HPLC-HRMS/MS method developed in the laboratory [1], we decide to develop a high throughput method for the quantification of epigenetic biomarkers and DNA adducts from human white blood cells. The original method, able to quantify 9 exocyclic DNA adducts has been improved by adding 5 new epigenetic biomarkers (i.e. 5-Methylcytidine, 5-Hydroxymethylcytidine, 5-Formylcytidine, 5-Hydroxymethyluridine, 5-Carboxylcytidine) and 2 new DNA adducts (i.e. ethenodeoxyadenosine and ethenodeoxycytidine).The previous method was time consuming and adapted for the preparation of only 20 samples per week. Samples preparation steps are: reduction, precipitation, internal standards addition and enzymatic hydrolysis of DNA. Redesigning of all these steps was needed to increase the throughput of the method.A high throughput improvement as been made thanks to the automatization of most of the steps. A pipetting robot Integra Assit Plus as been used for this automatization. This pipetting Robot was used for the reduction, the precipitation and hydrolysis. The use of individual tube was no longer possible and 96 well plates have been used instead. As an example of optimization, the reduction step was shortened from 2 hours to 30 minutes.In its current state, the preparation method allows the preparation of more than 300 samples each week. The modification applied on the original method have been tested for the preparation of 700 samples obtained from an agricultural cohort. Obtained results are robust and human error are limited thanks to the use of a pipetting robot

La spectrométrie de masse comme outil d’investigation lors des mortalités massives aiguës d’abeilles

International audienceLes activités analytiques de LABÉO autour de la santé des abeilles se sont enrichies d’une nouvelle stratégie permettant de déterminer rapidement l’implication de produits phytosanitaires dans les cas de mortalité massive aiguë d’abeilles. Pour cela, une analyse de dépistage par screening sur LC-Q-Tof est réalisée, suivie d’une confirmation et une quantification par analyse en LC-MS/MS. L’extraction des différents pesticides à partir des abeilles est effectuée selon la méthode normalisée « QuEChERS ». Cette stratégie analytique permet d’élargir à de nouvelles molécules la recherche de pesticides qui ciblent le plus souvent les insecticides pyréthrinoïdes ou néonicotinamides. Le cas d’une intoxication d’abeilles vient illustrer l’efficacité de cette approche analytique

La spectrométrie de masse comme outil d’investigation lors des mortalités massives aiguës d’abeilles

International audienceLes activités analytiques de LABÉO autour de la santé des abeilles se sont enrichies d’une nouvelle stratégie permettant de déterminer rapidement l’implication de produits phytosanitaires dans les cas de mortalité massive aiguë d’abeilles. Pour cela, une analyse de dépistage par screening sur LC-Q-Tof est réalisée, suivie d’une confirmation et une quantification par analyse en LC-MS/MS. L’extraction des différents pesticides à partir des abeilles est effectuée selon la méthode normalisée « QuEChERS ». Cette stratégie analytique permet d’élargir à de nouvelles molécules la recherche de pesticides qui ciblent le plus souvent les insecticides pyréthrinoïdes ou néonicotinamides. Le cas d’une intoxication d’abeilles vient illustrer l’efficacité de cette approche analytique

The challenge to produce robust data in UHPLC-HRMS/MS based metabolomics for molecular epidemiology studies

International audienceMetabolomics studies can be a powerful tool to identify biomarkers of exposures and/or effects. The aim of this project is to develop a general method for the evaluation of agricultural workers exposome through UHPLC-HRMS/MS metabolomic to obtain robust and meaningful results.Each step of the workflow must be optimized. The optimizable steps are sample preparation, chromatographic separation, high-resolution mass spectrometry analysis, data pre-treatment, statistical analysis and biological interpretation of the identified biomarkers. Among these steps analytical measurement is critical to collect as much reliable data as possible while being relevant.This step was optimised on urine collected from a group of healthy volunteers composed of 11 men and 10 women. A set of 5 mobile phases usually used for UHPLC in the literature were tested with a QTOF detector. Samples were injected one or several times to estimate the importance of injection replication. Three normalisation methods were tested, based on creatinine, urine osmolarity and total MS signal. Two ionisation modes were used, combined with reverse phase and HILIC separations. The association of these conditions were evaluated using Galaxy Workflow4Metabolomics. The results were evaluated according to the total numbers of features, and results repeatability. Several data treatment methods were then tested with specifics parameters. At the end, a separation of men and women in 2 groups have been obtained using univariate and multivariate statistical analysis.This method will be applied to the analysis of biological samples obtained from large agricultural occupational cohorts. Other steps still need to be optimized before the global can be applied to cohort analysis. The data treatment step can be improved by the utilisation of external compounds or endogens molecules as standards for the retention time correction of the detected peaks. Statistical treatment step may be more reliable by using new statistical. Biomarkers identification step is to be evaluated yet

ERATUS – Suivi environnemental dans le cadre du programme d’élimination du rat de l’archipel de Chausey

International audienceLes îles Chausey sont un archipel normand relevant du programme Natura 2000. L’archipel est connu pour ses colonies d’oiseaux, nichant au sol, tel le cormoran huppé. Ces oiseaux sont mis en danger par la surpopulation du rat surmulot qui empêche les oiseaux de couver mais qui se nourrit également des oeufs. C’est pourquoi en 2020, le conservatoire du littoral décide de mener une campagne de dératisation selon un protocole établi par l’INRA[1], avec l’utilisation d’un rodonticide antivitamine-K, le brodifacoum. La dératisation est menée en deux temps, une phase test avec étude de l’impact du rodonticide utilisé sur l’environnement puis le déploiement sur l’ensemble des 365 îlots. L’archipel de Chausey étant un site de productions conchylicoles (moules, huîtres, palourdes) et de pêche récréative et professionnel très important, un suivi environnemental de la qualité du milieu a été demandé par le préfet et le comité régional de la conchyliculture afin de s’assurer de l’absence de résidu de brodifacoum dans l’eau et les coquillages en élevage. Pour rechercher ce rodonticide sur l’environnement, plusieurs approches ont été utilisées : analyse de résidus dans la faune et déploiement d’échantillonneurs intégratifs passifs capable d’accumuler les molécules sur une période d’une quinzaine de jours. La mise en place de ce suivi pour le brodifacoum permet également de collecter des données pour d’autres polluants comme les pesticides ou les biocides issus des traitements antifouling de bateaux. Cinq prélèvements ont été réalisés chaque année, avant la pose des appâts, 2 pendant la période d’appâtage, deux semaines après la pose et après une période de pluie. La recherche de traces de rodonticide a été effectuée sur les crevettes bouquets, les palourdes et les huîtres et moules en condition de caging. Les suivis environnementaux se font avec 3 types d’échantillonneurs intégratifs passifs adaptés pour les molécules polaires (POCIS PHARM), pour le glyphosate/AMPA (POCIS glyphosate) et pour les composés hydrophobes (SPMD), ce qui permet la détection d’environ 300 molécules avec des méthodes d’analyses déjà développées en LC-MS/MS et GC-MS/MS. L’extraction et l’analyse de 6 rodonticides dont le brodifacoum est mise au point pour les coquillages et crustacés, le développement analytique est fait sur une LC-MS/MS Agilent 6495. L’extraction est réalisée avec un solvant suivi d’une purification en SPE Dispersive de type « QuEChERS ». La validation a été réalisée selon la norme NF V03-110. Les résultats des deux campagnes de traitement ont montré que le rodonticide n’était pas retrouvé dans la faune analysée ni dans l’environnement. L’analyse des échantillonneurs a mis en évidence la présence d’une vingtaine de pesticides dans les eaux de l’archipel. [1] Denis Bredin, Louis Dutouquet, Protocole d’éradication du rat surmulot sur l’île de Tomé (Bretagne), Espaces naturels, octobre 2004, n°8

The challenge to produce robust data in UHPLC-HRMS/MS based metabolomics for molecular epidemiology studies

International audienceMetabolomics studies can be a powerful tool to identify biomarkers of exposures and/or effects. The aim of this project is to develop a general method for the evaluation of agricultural workers exposome through UHPLC-HRMS/MS metabolomic to obtain robust and meaningful results.Each step of the workflow must be optimized. The optimizable steps are sample preparation, chromatographic separation, high-resolution mass spectrometry analysis, data pre-treatment, statistical analysis and biological interpretation of the identified biomarkers. Among these steps analytical measurement is critical to collect as much reliable data as possible while being relevant.This step was optimised on urine collected from a group of healthy volunteers composed of 11 men and 10 women. A set of 5 mobile phases usually used for UHPLC in the literature were tested with a QTOF detector. Samples were injected one or several times to estimate the importance of injection replication. Three normalisation methods were tested, based on creatinine, urine osmolarity and total MS signal. Two ionisation modes were used, combined with reverse phase and HILIC separations. The association of these conditions were evaluated using Galaxy Workflow4Metabolomics. The results were evaluated according to the total numbers of features, and results repeatability. Several data treatment methods were then tested with specifics parameters. At the end, a separation of men and women in 2 groups have been obtained using univariate and multivariate statistical analysis.This method will be applied to the analysis of biological samples obtained from large agricultural occupational cohorts. Other steps still need to be optimized before the global can be applied to cohort analysis. The data treatment step can be improved by the utilisation of external compounds or endogens molecules as standards for the retention time correction of the detected peaks. Statistical treatment step may be more reliable by using new statistical. Biomarkers identification step is to be evaluated yet

Recherche de résidus d’antiparasitaires dans le compost de fumier de cheval.

National audienceVAL’FUMIER est un programme de valorisation du fumier de cheval au niveau régional, porté par l’IFCE et le GHN (Groupement Hippique National). Pour un haras de 80 chevaux, la production de fumier est de 600 tonnes par an, celui-ci peut être valorisé via leur traitement biologique ou leur épandage agricole et notamment par le compostage de ce sous-produit. Dans le cadre de l’épandage agricole, il est nécessaire de caractériser le compost de fumier, de déterminer sa valeur agronomique et vérifier sa qualité microbiologique selon la norme NF U44-051. Compte tenu des traitements antiparasitaires réalisés régulièrement chez les chevaux, ce programme s’intéresse également à la présence de résidus de médicaments vétérinaires, qui pourrait avoir un impact dans les sols. Deux techniques sont utilisées pour déterminer la présence de benzimidazoles et d’avermectines dans le compost de fumier de cheval. Pour les benzimidazoles, la méthode est adaptée de la méthode ANSES mise en oeuvre dans le lait et les muscles d’animaux, c’est une extraction dispersive avec ajout de sels puis concentration de l’échantillon et injection de l’extrait en chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse. Pour le dosage des avermectines, c’est une extraction par solvant puis purification sur colonne en phase solide, suivie d’une dérivation et analyse de l’extrait sur chromatographie liquide couplée à un détecteur fluorimétrique. Ces deux méthodes ont été adaptées pour l’analyse de compost. Plusieurs échantillons de composts de fumiers ont été analysés, en provenance de 24 exploitations. Pour chaque échantillon, l’extraction a été faite sur l’échantillon et sur ce même échantillon dopé afin de vérifier des rendements pour chaque matrice. Les rendements obtenus montrent que l’extraction et l’analyse sont adaptées et permettent de quantifier 29 molécules benzimidazoles et 6 avermectines. Au final, aucune avermectine n’a été détectée dans les échantillons, 5 composts de fumiers de cheval comportaient du pyrantel, 3 du fenbendazole, 1 du fenbendazole sulfone et une dernière de l’exfenbendazole. Les molécules ont été mis en lien avec l’utilisation de ces médicaments vétérinaires dans les exploitations. Les résultats de cette étude permettent de conclure sur l’absence d’effet significatifs sur le sol par le compost de chevaux traités avec des produits antiparasitaires

Toxicity assessment of five emerging pollutants, alone and in binary or ternary mixtures, towards three aquatic organisms

International audienceDespite a growing scientific attention on ecological impact of emerging pollutants (EPs) such as pharmaceuticals, personal care products, and pesticides, knowledge gaps remain regarding mixture toxicity and effects on aquatic organisms. Several EPs were screened in seawater (Normandy, France), and the ecotoxicity of five compounds, chosen on their occurrence in ecosystems and use worldwide, was assessed and were the biocides methylparaben (MP) and triclosan (TCS), a pesticide degradation product (AMPA), and the pharmaceuticals venlafaxine (VEN) and carbamazepine (CBZ). The acute or sub-chronic toxicity, alone or in binary/ternary mixtures of three of them (CBZ, AMPA, and MP), was assessed on one marine and two freshwater organisms: Crassostrea gigas, Pseudokirchneriella subcapitata, and Daphnia magna. TCS and AMPA were, respectively, the most (EC50 50 mg L-1) toxic chemicals for the four endpoints (algal growth inhibition, daphnia immobilization, oyster embryotoxicity, and metamorphosis). The anxiolytic VEN (EC50 < 1 mg L-1) was particularly toxic to oyster larvae showing sensitivity difference between freshwater and marine organisms. If all the mixtures appeared to be in the same range of toxicity, the joint-toxic effects mainly led to synergistic or antagonistic interactions compared to single-compound toxicity. The data also highlighted species-dependent differing models of toxicity and underscored the need for an awareness of cocktail effects for better ecological risk assessment