Toward a gene therapy for neurological and somatic MPSIIIA

Mucopolysaccharidosis Type IIIA (MPSIIIA) represents an unmet medical need. MPSIIIA shares with many other lysosomal storage disorders (LSD) the characteristic of being a severe neurodegenerative disease accompanied by mild somatic involvement. Thus, the main target organ for the development of new treatments is the central nervous system (CNS), but overall clinical efficacy would be greatly enhanced by simultaneous correction of peripheral disease. We have recently developed a novel treatment for MPSIIIA based on the delivery to the cerebrospinal fluid of serotype 9 adeno-associated virus (AAV9)-derived vectors. This gene therapy strategy corrected both CNS and somatic pathology in animal models through widespread transduction of CNS, peripheral nervous system (PNS), and liver. The work set the grounds for the clinical translation of the approach to treat MPSIIIA in humans. Here we discuss some important considerations that further support the applicability of this treatment to MPSIIIA and other LSD with CNS and somatic involvement

Análisis en animales transgénicos del papel del incremento en la gliceroneogénesis o en la captación de glucosa por el tejido adiposo

Consultable des del TDXTítol obtingut de la portada digitalitzadaLa obesidad y la diabetes de tipo 2 se han convertido en las dos grandes epidemias de los países desarrollados y en vías de desarrollo. El conocimiento de las causas y mecanismos que desencadenan la obesidad, resistencia a la insulina y diabetes de tipo 2 es de vital importancia para su posterior prevención y tratamiento. Tanto la producción de glicerol-3¬fosfato como la obtención de ácidos grasos libres son fundamentales para la síntesis de triglicéridos por el tejido adiposo. Por tanto, alteraciones metabólicas primarias en el tejido adiposo que incrementen la obtención de glicerol-3-fosfato podrían aumentar su capacidad de almacenar lípidos, induciendo el desarrollo de obesidad, resistencia a la insulina y diabetes de tipo 2. En condiciones fisiológicas, se considera que el adipocito produce glicerol-3-fosfato a partir de la glucosa durante el periodo post-prandial, o a través de la gliceroneogénesis durante el ayuno. Así, en la primera parte de este estudio, se analizaron los efectos de un incremento en la gliceroneogénesis del tejido adiposo a través de la sobreexpresión de la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK) en ratones. La sobreexpresión de PEPCK llevaba a un incremento en la reesterificación de ácidos grasos y un mayor depósito de lípidos en tejido adiposo. Aunque estos animales eran obesos hipertróficos, mostraban una sensibilidad a la insulina y tolerancia a la glucosa similar a los controles. Ello probablemente era debido a la ausencia de niveles elevados de FFAs, junto con la ausencia de depósito de grasa en tejidos no adiposos y altos niveles de adiponectina sérica. Posteriormente, los ratones transgénicos aP2-PEPCK se alimentaron con una dieta alta en lípidos durante un breve período. Tras la dieta, estos animales presentaban obesidad mórbida y una severa resistencia a la insulina e intolerancia a la glucosa respecto a los controles. Por tanto, los efectos combinados de la dieta alta en lípidos junto al incremento en la reesterificación de ácidos grasos en tejido adiposo, probablemente saturaban la capacidad de éste de almacenar lípidos. Ello llevaba al depósito de lípidos en hígado y a hipertrigliceridemia. Además, la acumulación de lípidos en tejido adiposo marrón disminuía su capacidad termogénica. Todo ello contribuiría a la obesidad y resistencia a la insulina tan severas que presentaban estos animales transgénicos tras la dieta. Estos resultados sugieren que la capacidad del tejido adiposo blanco para almacenar lípidos es crucial para el mantenimiento de la sensibilidad a la insulina. Por otra parte, un incremento en la fosforilación de la glucosa por el tejido adiposo podría llevar a una mayor esterificación de ácidos grasos y depósito de lípidos, a través de un aumento en su obtención de glicerol-3-fosfato. Por ello, en la segunda parte del estudio, se expresó la enzima glucoquinasa (GK) en tejido adiposo de ratones, una enzima reguladora de la utilización de glucosa en hígado. La presencia de GK en tejido adiposo incrementaba su captación basal de glucosa, y mejoraba la tolerancia a la glucosa y sensibilidad a la insulina en estos animales. A pesar de la mayor captación de glucosa en tejido adiposo blanco, ello no generaba más glicerol-3-fosfato ni alteraba su depósito de lípidos, sino que aumentaba su producción de lactato, incrementando sus niveles circulantes. Todos estos resultados sugieren que la regulación del aporte de glicerol-3-fosfato contribuye al control de la síntesis de triglicéridos. Además, muestran la implicación directa de la PEPCK en la síntesis de glicerol-3-fosfato y resaltan el papel clave de la gliceroneogénesis en la reesterificación de ácidos grasos y la acumulación de grasa en el tejido adiposo. Sin embargo, el incremento en la captación de glucosa no es suficiente para promover la generación de glicerol-3-fosfato y el depósito de grasa.Obesity and type 2 diabetes are the two most important health problems in Western societies. The mechanisms underlying the development of obesity, insulin resistance and type 2 diabetes are not fully understood. Obesity results from an imbalance between energy intake and expenditure, leading to increased energy storage in the form of triglycerides in white adipose tissue (WAT). Adipocytes synthesize triglyceride by esterification of free fatty acids (FFA) with glycerol-3-phosphate and net lipid deposition occurs when esterification is higher than lipolysis. Although glucose is traditionally viewed as the main precursor of the glycerol backbone for triglyceride synthesis, it may also be synthesized from pyruvate or lactate through glyceroneogenesis when glucose supply is limited, as fasting conditions. A regulatory step of glyceroneogenesis is catalized by phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK). Thus, in the first part of this study, increase in glyceroneogenesis was analyzed in transgenic mice overexpressing PEPCK in adipose tissue. PEPCK overexpression led to increased FFA re-esterification, higher adipocyte size, fat mass, body weight and circulating adiponectin and decreased circulating FFA. Moreover, despite obesity, glucose tolerance and whole-body insulin sensitivity were preserved. This suggests that obesity without increased circulating FFA does not lead to insulin resistance or type 2 diabetes. Surprisingly, when fed a high-fat diet for a short period (6 weeks), transgenic mice developed severe obesity and were more hyperinsulinemic, glucose intolerance and insulin resistance than controls. In these animals, high-fat feeding in the presence of increased FFA reesterification leads to triglyceride accumulation in white and brown adipose tissue and to fat storage saturation. This impairs the role of white adipose tissue in buffering the flux of circulating lipids, leading to fat deposition in liver, hypertriglyceridemia and insulin resistance. Furthermore, fat accumulation in brown adipose tissue probably may reduce diet-induced thermogenesis, contributing to severe obesity and insulin resistance. All these results suggest that the regulation of the lipid storage capacity of white adipose tissue is crucial to the maintenance of insulin sensitivity. On the other hand, alterations in nutrient partitioning and particularly in glucose metabolism may contribute to obesity and type 2 diabetes. In an attempt to increase glucose uptake and triglyceride esterification, transgenic mice were engineered to increase glucose phosphorylation in adipose tissue. To this end, and to avoid the feedback inhibition of hexokinase activity by glucose-6-phosphate, the liver enzyme glucokinase (GK) was expressed under the control of aP2 promoter. Transgenic mice showed high levels of GK expression in white adipose tissue which led to increased adipose tissue basal glucose uptake. Consistent with this, transgenic mice presented increased glucose tolerance and higher whole-body insulin sensitivity than controls. Surprisingly, despite increased glucose uptake, body fat content and glycerol-3 phosphate synthesis were not altered in transgenic mice compared with controls. In vitro as well as in vivo studies using nuclear magnetic resonance showed that adipose tissue from transgenic mice released higher amounts of lactate than that from controls. This suggests that the major product from increased glucose uptake is lactate rather than glycerol-3 phosphate, leading to higher circulating lactate levels within physiological range. All these results reinforce the idea that glyceroneogenesis and PEPCK may be crucial to regulate triglyceride synthesis in adipose tissue. However, the increased glucose uptake in adipocytes is not sufficient to promote glycerol-3-phosphate synthesis and lipid deposition

New insights into adipose tissue VEGF-A actions in the control of obesity and insulin resistance

Altres ajuts: The work in our lab relevant to this commentary was supported by grants from EUMODIC (LSHG-CT-2006-037188).Vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) is classically viewed as a key factor in angiogenesis and tissue remodeling. However, recent evidence suggests a potential role of this growth factor in the control of energy metabolism and adipose tissue function. In this regard, we and others have described the effects of the up and downregulation of VEGF-A in adipose tissue on the control of energy homeostasis. VEGF-A overexpression protects against diet-induced obesity and insulin resistance. The observation that VEGF-A overexpression leads to an increase in brown adipose tissue (BAT) thermogenesis and also promotes a "BAT-like" phenotype in white adipose tissue depots is of particular relevance for the understanding of the mechanisms underlying obesity development. In addition, VEGF-A may not only have pro-inflammatory but also anti-inflammatory properties, with a chemotactic activity specific for M2 anti-inflammatory macrophages. This new scientific evidence highlights the importance that VEGF-A actions on metabolism could have on the design of new treatments for obesity, insulin resistance and obesity-related disorders

Aproximacions de teràpia gènica per a la diabetis mellitus centrades en la manipulació genètica del múscul esquelètic

Consultable des del TDXA portada: Facultat de VeterinàriaEn la present tesi es desenvolupa una nova aproximació de teràpia gènica a fí de proporcionar un nou tractament per a la diabetis mellitus de tipus 1 que millori les teràpies actuals per aquesta malaltia. Aquesta nova aproximació es basa en la manipulació genètica del múscul esquelètic per tal d'oferir una producció constitutiva d'insulina, i incrementar la captació de glucosa per aquest teixit mitjançant l'expressió del enzim hepàtic glucoquinasa. Això es recolza en el fet que el múscul és el principal teixit responsable en l'eliminació de la glucosa després d'una ingesta, i que en diabetis la captació del sucre per aquest teixit és reduïda. A més a més ha estat prèviament demostrat que el múscul esquelètic presenta una elevada capacitat per a produir proteïnes terapèutiques de manera sistèmica, el qual permet obtenir uns nivells basals i fisiològics de la hormona. Per tal de desenvolupar aquesta aproximació, inicialment s'ha utilitzat un model dobletransgènic on l'expressió selectiva de la insulina i la glucoquinasa en cèl·lules musculars s'aconsegueix mitjançant l'utilització del promotor del gen de la cadena lleugera de la miosina. Cal fer palés que en condicions normals, els ratolins doble transgènics mostren una resposta més eficient davant canvis sobtats en la concentració de glucosa en sang. L'estudi realitzat en animals diabètics ha mostrat que la inducció de la malaltia mitjançant el tractament amb múltiples baixes dosis d'estreptozotocina produeix en els ratolins control el desenvolupament d'una diabetis aguda amb una marcada hiperglucèmia, mentre que en els ratolins doble transgènics l'expressió d'insulina i glucoquinasa contraresta l'aparició d'hiperglucèmia, sense induïr hipoglucèmia, i les alteracions associades amb la malaltia. Això indica que l'expressió d'insulina i de glucoquinasa pot constituir una nova aproximació de teràpia gènica per al tractament de la diabetis de tipus 1. A continuació, es va estudiar l'aplicació d'aquesta nova aproximació en ratolins diabètics mitjançant l'utilització d'estratègies de teràpia gènica (Electrotransferència). En aquest cas, es s'ha observat que després de la electrotransferència, la modificació genètica del 8% de la massa muscular dóna lloc a la normalització de la glucèmia, la recuperació dels nivells d'insulina circulants, així com un augment del metabolisme muscular i hepàtic de la glucosa, el qual contribueix a millorar l'estat general del animal. Per tant aquests resultats suggereixen que la manipulació genètica del múscul esquelètic per a produir insulina i incrementar la captació i la utilització de glucosa mitjançant l'expressió del enzim hepàtic glucoquinasa, pot esdevenir una teràpia alternativa als tractaments actuals per a la diabetis de tipus 1.In this work we developed a new gene therapy approach for the treatment of type 1 diabetes. This approach is focused on the genetic manipulation of skeletal muscle to express insulin and glucokinase genes in order to obtain a constitutive production of the hormone and to increase the glucose uptake. As in type 1 diabetes the glucose uptake by muscle mass is reduced, this new approach seeks to increase the glucose uptake capacity in this disease. To develop this approach we use a double transgenic mouse model where the specific expression of insuline and glucokinase in the skeletal muscle were obtained driven under the control of miosine light chain promoter. The results showed that in the healthy conditions, the double transgenic mice has a normal oral glucose tolerance test. Furthermore, after treatment with multiple low dose of streptozotocine, control mice develop a severe diabetes with a high hiyperglycemia. In contrast, insuline and glucokinase expression in the double transgenic mice counteracted the hyperglycemia, without induce hypoglycemia and the alterations associated to diabetes. This results suggest that insuline and glucokinase expression could be a new gene therapy approach for the treathment of type 1 diabetes. Once obtained these results, we decided to carry out a novel gene transfer technique by using electrotransfer DNA in diabetic (non transgenic) mice. In this case, we observed that with just an 8% of skeletal muscle electrotroporated is sufficient to recover the normoglicemia, normoinsulinemia and restore the glucose metabolism of the skeletal muscle and liver, and the general health of this mice. Thus, all this results suggest that the manipulation of skeletal muscle to express insuline and to increase the glucose uptake by glucoquinase expression could be an alternative therapy for the diabetes type 1

Contrarestació de la diabetes mellitus mitjançant la generació d'un sensor de la glucosa a múscul esquelètic

Consultable des del TDXTítol obtingut de la portada digitalitzadaEn aquest estudi s'ha dut a terme una nova aproximació de teràpia gènica per a la diabetis basada en l'expressió conjunta d'insulina i de glucoquinasa en el múscul esquelètic utilitzant vectors virals adenoassociats de tipus 1 (AAV1). Els ratolins diabètics tractats amb els vectors AAV1-Ins+GK varen recuperar i mantenir la normoglucèmia, tant en condicions d'alimentació com de dejú, al llarg de més de 4 mesos després de la inducció de diabetis experimental. A més, es va observar una normalització de la tolerància a la glucosa i de la ingesta de menjar i d'aigua. Així doncs, l'acció conjunta de la producció basal d'insulina i de l'activitat de la glucoquinasa haurien generat en el múscul esquelètic un «sensor» de la glucosa que permetria la correcta regulació de la glucèmia en ratolins diabètics, evitant així l'aparició de complicacions secundàries. Un dels principals reptes en el camp de la teràpia gènica és el pas dels protocols de transferència gènica des de models murins fins a models animals grans, com ara gossos. Per això, l'última part d'aquest estudi ha pretès iniciar els primers passos en aquesta direcció. L'administració d'un vector AAV1-Ins al múscul esquelètic d'un gos diabètic ha permès, en primer lloc, establir les condicions per a la transferència de vectors a múscul esquelètic de gossos diabètics; i en segon lloc, ha evidenciat la viabilitat d'aquest tractament per contrarestar la hiperglucèmia en condicions de dejuni, i per millorar-ne la tolerància a la glucosa. Així doncs, els estudis realitzats en ratolins han demostrat l'eficàcia a llarg termini del tractament basat en l'ús de vectors adenoassociats per a la producció d'insulina i de glucoquinasa en el múscul esquelètic per contrarestar la hiperglucèmia diabètica i prevenir així l'aparició de complicacions secundàries. D'altra banda, els estudis portats a terme en un model caní han posat de relleu l'efectivitat preclínica de la tècnica en grans animals, com a pas previ al desenvolupament d'assajos clínics.In this study we designed a new gene therapy approach based on the expression of insulin together with glucokinase in skeletal muscle using adenoassociated virus vectors of serotype 1 (AAV1). AAV-treated diabetic mice completely restored blood glucose levels in fed and in fasted conditions for more than 4 months after diabetes induction. Moreover, the animals normalized glucose tolerance, as well as food and fluid intake. Thus, insulin action together with glucokinase activity have generated a glucose sensor in skeletal muscle that allows tight regulation of glucose levels in diabetic mice, avoiding long term secondary complications. One of the main goals in gene therapy field is to scale up gene transfer protocols from mice to large animal models, such as the dog. For this reason, the last part of this study aimed to develop the first steps in this direction. AAV1 administration of the insulin transgene to skeletal muscle in a diabetic dog established first, the conditions for gene transfer in skeletal muscle of a large animal model and secondly, have shown evidence of the ability of this treatment to counteract diabetic hyperglycemia in fasted conditions and to ameliorate glucose tolerance. In summary, the presented studies in mice have demonstrated the long term efficacy of the treatment using AAV vectors to produce insulin and glucokinase in skeletal muscle to counteract diabetic hyperglycemia and prevent secondary complications. On the other hand, the studies presented in the large animal model demonstrated the preclinical efficacy of the treatment in dogs as a first step towards clinical trials

Proliferative retinopathy: study of the contribution of neuroglial alterations and development of gene therapy approaches

La retinopatía diabética es la causa más común de ceguera adquirida en los países desarrollados, con una alta prevalencia en los pacientes diabéticos. El desarrollo de nuevas terapias requiere un buen conocimiento de la patología de la enfermedad y para ello son necesarios buenos modelos animales. Dichos modelos también resultan esenciales para ensayar el potencial de las nuevas terapias. El ratón transgénic IGF-I constituye un excelente modelo de retinopatía, ya que desarrolla la mayoría de las alteraciones vasculares presentes en los pacientes diabéticos. Para completar la caracterización del fenotipo de la retina de los animales TgIGF-I, la primera parte de esta tesis se centra en el estudio de las alteraciones de las neuronas y las células de la glia en las retinas transgénicas. Los resultados obtenidos muestran que los animales transgénicos presentan una pérdida progresiva de sus respuestas electroretinográficas resultando en una disfunción neuronal grave en los animales transgénicos de avanzada edad. Se detecta gliosis y microgliosis en las retinas de animales transgénicos jóvenes. La gliosis está relacionada con la pérdida de funciones esenciales para la supervivencia de las neuronas que realizan las células de Müller. Las retinas transgénicas presentan cambios en su metabolismo, relacionados con el reciclaje del glutamato, signos de estrés oxidativo y alteraciones en la homeostasis del potasio. Estas alteraciones pueden ser la causa de la disfunción neuronal observada en las retinas transgénicas, que además puede ser agravada por el incremento en la producción de citoquinas pro-inflamatorias. La segunda parte este trabajo se dedicó al estudio de la eficacia de una aproximación de terapia génica dirigida a contrarrestar la neovascularización y la neurodegeneración en la retinopatía diabética. Los vectores adeno-asociados (12V) de tipo 2 fueron escogidos para sobreexpresar el Pigmented Epithelium Derived Factor (PEDF), una proteina con potentes propiedades antiangiogénicas y neuroprotectoras. La transferencia génica del PEDF mediante vectores 12V induce la expresión a largo plazo de esta proteína y, como consecuencia, una marcada reducción de la neovascularization intravítrea, la normalización de la densidad capilar de la retina y la prevención del desprendimiento de retina. Esta reversión del fenotipo es paralela a la reducción de los niveles intraoculares de VEGF y la regulación negativa de efectores de la angiogénesis. Estos resultados demuestran la eficacia a largo plazo del a sobreexpresión de PEDF para contrarrestar la neovascularización retinal y ofrece evidencias para el uso de esta estrategia en el tratamiento de la retinopatía diabética y otras enfermedades proliferativas de la retina.Diabetic retinopathy (DR) is the most common cause of acquired blindness in developed countries, with a high prevalence in diabetic patients. The development of new effective therapies requires further investigations on disease pathogenesis and good animal models are essential to this end and to assay the potential efficacy of new experimental therapies. The TgIGF-I mice is a good model of retinopathy, developing many of the retinal vascular alterations observed in human diabetic patients. To fully characterize the eye pathology of the TgIGF-I, the first part of this work was focused in the study of the alterations of neurons and glial cells in the retinas of these mice. We found that TgIGF-I retinas showed a progressive decline in their electroretinographic responses that resulted in significantly impaired neuronal functionality in old animals. Gliosis and microgliosis were also detected in transgenic retinas at early ages. Gliosis is associated with the loss of essential neuron-supportive functions performed by Müller cells. We found that transgenic retinas showed changes in normal retinal metabolism, such as alterations in the glutamate metabolism, signs of oxidative stress and impaired potassium buffering, that may underlie neuronal dysfunction in transgenic retinas, which could be exacerbated by the increased production of pro-inflammatory cytokines. Thus, the second part of this work was dedicated to the study of the efficacy of a gene therapy approach aimed at counteracting neovascularization and neurodegeneration. Adeno-associated (AAV) vectors of serotype 2 were chosen to overexpress Pigmented Epithelium Derived Factor (PEDF), a protein with potent antiangiogenic and neuroprotective properties. AAV2-mediated PEDF gene transfer led to long-term production of PEDF and to a striking inhibition of intravitreal neovascularization, normalization of retinal capillary density, and prevention of retinal detachment. This was parallel to a reduction in the intraocular levels of Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), that was consistent with a downregulation of downstream effectors of angiogenesis. These results demonstrate long-term efficacy of AAV-mediated PEDF overexpression in counteracting retinal neovascularization and provide evidence towards the use of this strategy to treat angiogenesis in DR and other chronic proliferative retinal disorders